JP2009042057A - 検体に含まれる被測定物質の測定方法および該測定方法に用いられる試薬キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】検体に含まれる被測定物質を測定するための本発明の方法は、(a)該検体に、緩衝剤を含む第1試薬、および該被測定物質に特異的に結合する特異的結合物質が結合された微小粒子を含む第2試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程;(b)該検体に、(b1)該緩衝剤および特異的結合物質を含む第3試薬、および微小粒子を含む第4試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程であって、この場合、該第4試薬が、該第2試薬と同じであってもよい、工程、あるいは(b2)該第1試薬、および該第4試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程であって、この場合、該第4試薬が、該第2試薬と異なる、工程;および(c)該工程(a)で得られる吸光度変化と、該工程(b)で得られる吸光度変化との差を求める工程;を包含する。
【選択図】なし
Description
van der Hulst RWら、ガストロエンテロロジー(Gastroenterology)、1997年、第113(4)巻、第1082頁〜第1086頁 Sasazuki Sら、カンサー・エピデミオロジー,バイオマーカーズ・アンド・プリベンション(Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention)、2006年、第15巻、第1341頁〜第1347頁
(a)該検体に、緩衝剤を含む第1試薬、および該被測定物質に特異的に結合する特異的結合物質が結合された微小粒子を含む第2試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程、
(b)該検体に、(b1)該緩衝剤および特異的結合物質を含む第3試薬、および微小粒子を含む第4試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程であって、この場合、該第4試薬が、該第2試薬と同じであってもよい、工程、あるいは(b2)該第1試薬、および該第4試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程であって、この場合、該第4試薬が、該第2試薬と異なる、工程、および
(c)該工程(a)で得られる吸光度変化と、該工程(b)で得られる吸光度変化との差を求める工程
を包含する。
本発明の方法に供される検体は、目的の被測定物質が存在し得るものであればよく、特に制限されない。固体および液体のいずれであってもよい。例えば、便、消化液(唾液など)などの生体試料が用いられる。好ましくは各種動物の便、より好ましくはヒトの便である。なお、便を検体として使用する場合、便潜血検査に用いられる採便容器にて採取した便を転用可能である。このため、例えば、便潜血検査において、再度便を採取することなく、ヘリコバクター・ピロリの感染検査も付随して行うことができるという利点を有する。
本発明の方法に使用される第1試薬は、緩衝剤を含み、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分などを含み得る。この第1試薬は、pHの維持のため、あるいは検体を希釈する目的で用いられる。
本発明の方法に使用される第2試薬は、被測定物質に特異的に結合する特異的結合物質が結合された微小粒子を含み、必要に応じてその他の成分を含み得る。この第2試薬は、例えば、特異的結合物質が結合された微小粒子を第1試薬に用いる緩衝剤に添加することによって得られる。
本発明の方法に使用される第3試薬は、緩衝剤および特異的結合物質を含み、必要に応じてその他の成分を含み得る。緩衝剤は、第1試薬で例示した緩衝剤を用いることができる。特異的結合物質は、検体中に含まれる被測定物質に特異的に結合することによって、被測定物質が微小粒子とともに凝集されることを防止する。したがって、第3試薬に用いられる特異的結合物質は、微小粒子に結合されていない。この特異的結合物質は、例えば、第2試薬で例示した特異的結合物質を用いることができる。第3試薬中での特異的結合物質の濃度は、例えば、終濃度で1〜100μg/mLである。その他の成分としては、第1試薬で用いられる緩衝剤以外の成分を適宜用いることができる。
本発明の方法に使用される第4試薬は、微小粒子を含み、必要に応じてその他の成分を含み得る。この微小粒子は、第2試薬に含まれる特異的結合物質が結合されるべき微小粒子として用いられるものと同じ微小粒子が用いられる。
検体に含まれる被測定物質を測定するための本発明の方法は、(a)該検体に、上記第1試薬、および上記第2試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程、(b)該検体に、(b1)上記第3試薬、および上記第4試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程、あるいは(b2)該第1試薬、および該第4試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程、および(c)該工程(a)で得られる吸光度変化と、該工程(b)で得られる吸光度変化との差を求める工程を包含する。
本発明の試薬キットは、上記緩衝剤を含む第1試薬;上記被測定物質に特異的に結合する特異的結合物質が結合された微小粒子を含む第2試薬;ならびに上記緩衝剤と特異的結合物質とを含む第3試薬および微小粒子を含む第4試薬からなる群より選択される少なくとも1種の試薬を含む。この試薬キットは、本発明の方法に好適に用いられ、これによって、測定干渉物質の凝集反応による弊害(すなわち、バックグラウンド)を排除することができ、被測定物質のより正確な測定を行うことができる。
20検体の各便について、ヘリコバクター・ピロリ抗原の有無を、2種類の市販の便中ヘリコバクター・ピロリ抗原測定キット(イムノカードST HpSA、株式会社テイエフビー社製、およびテストメイト ラピッドピロリ抗原、ベクトンディッキンソン社製)を用いてイムノクロマト法により測定した。測定方法は、添付のプロトコールに従って正確に行った。上記イムノクロマト法により陰性と判定された検体を検体1〜10とし、陽性と判定された検体を検体11〜20とした。結果を表1にまとめて示す。
以下のようにして、第1試薬〜第3試薬を調製し、上記検体1〜20中のヘリコバクター・ピロリ抗原を測定した。なお、以下において、%は、特に記載がない限り、W/V%を表す。
5.0%塩化ナトリウム、3.05%ポリエチレングリコール2000(PEG)、0.05%トリトンX−100、0.002%ジチオトレイトール(DTT)、0.005%1−チオグリセロール、および3.0%ウサギ血清を含む100mM HEPES(pH7.5)を調製し、これを第1試薬とした。
95℃の蒸留水1Lに、10%塩化金酸溶液2mLを撹拌しながら加え、さらに2%クエン酸ナトリウム溶液10mLを加えて撹拌した。その後、冷却し、0.1M炭酸カリウム溶液を用いてpH7.1に調節して金コロイド液を得た。
上記第1試薬に、抗ヘリコバクター・ピロリポリクローナル抗体(Dako社製)を10μg/mLの濃度となるように添加し、ポリエチレングリコール(PEG)で測定感度を適宜調整し、これを第3試薬とした。
上記参考例で用いた各便検体(陰性検体1〜10および陽性検体11〜20)をそれぞれ、採便容器(アルフレッサファーマ株式会社製)に採った。各便検体50μLと、第1試薬140μLとを混合し、37℃にて約5分間保持した。次いで、第2試薬50μLを加えて混合し、37℃にて保持しながら、日立7060形自動分析装置により主波長546nmおよび副波長660nmで測光ポイント18から31の2ポイント測定を行って、2ポイント間の吸光度の差を求めた(吸光度変化量1とする)。測定時間は約10分間であった。
Claims (9)
- 検体に含まれる被測定物質を測定する方法であって、
(a)該検体に、緩衝剤を含む第1試薬、および該被測定物質に特異的に結合する特異的結合物質が結合された微小粒子を含む第2試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程;
(b)該検体に、
(b1)該緩衝剤および特異的結合物質を含む第3試薬、および微小粒子を含む第4試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程であって、この場合、該第4試薬が、該第2試薬と同じであってもよい、工程、あるいは
(b2)該第1試薬、および該第4試薬を順次添加して凝集反応させ、該凝集反応により得られる吸光度変化を測定する工程であって、この場合、該第4試薬が、該第2試薬と異なる、工程;および
(c)該工程(a)で得られる吸光度変化と、該工程(b)で得られる吸光度変化との差を求める工程
を包含する、方法。 - 前記検体が、便である、請求項1に記載の方法。
- 前記被測定物質が、ヘリコバクター属細菌抗原である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ヘリコバクター属細菌抗原が、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ビリス、ヘリコバクター・ハイルマニー、およびヘリコバクター・ヘパティカスからなる群より選択される少なくとも1種のヘリコバクター属細菌の抗原である、請求項3に記載の方法。
- 前記特異的結合物質が、前記被測定物質に対する抗体である、請求項1から4のいずれかの項に記載の方法。
- 前記特異的結合物質が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項1から5のいずれかの項に記載の方法。
- 前記微小粒子が、ラテックス粒子または金属コロイド粒子である、請求項1から6のいずれかの項に記載の方法。
- 前記金属が、金、銀、銅、鉄、白金、およびパラジウムからなる群より選択される少なくとも1種の金属である、請求項7に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法に用いられる試薬キットであって、
緩衝剤を含む第1試薬;
被測定物質に特異的に結合する特異的結合物質が結合された微小粒子を含む第2試薬;ならびに
該緩衝剤と特異的結合物質とを含む第3試薬および微小粒子を含む第4試薬からなる群より選択される少なくとも1種の試薬
を含む、試薬キット。
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