JP2007127438A - 非特異反応抑制剤、免疫学的測定試薬免疫測定方法及び非特異反応抑制剤の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】被測定物質に対して免疫学的に反応する抗体又は抗原を平均粒子径0.05〜0.5μmの担体に担持した免疫測定粒子を使用する免疫測定方法に用いられる非特異反応抑制剤であって、被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体又は抗原を有機溶媒存在下で担持した不溶性担体からなり、前記不溶性担体の平均粒子径は、前記担体の平均粒子径よりも小さい非特異反応抑制剤。
【選択図】なし
Description
以下に、本発明を詳述する。
また、上記有機溶媒の濃度は、担持を行う際の反応溶液全体に対して好ましい下限が1%、好ましい上限が50%である。1%未満であると、非特異反応の抑制効果が不充分となることがある。50%を超えると、有機溶媒に免疫的に反応しない物質が析出し、非特異反応抑制剤が調製できなくなることがある。
また、上記被測定物質に対して免疫学的に反応する抗原としては特に限定されず、免疫原性を有する物質以外にハプテンであってもよい。
上記ブロッキング処理に用いられるブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン等が挙げられる。
上記ブロッキング剤として用いられる物質は、免疫学的に不活性であり、被測定物質である抗原又は抗体と特異的な反応性をもたないが、血清中の非特異反応誘起物質と反応する場合がある。また、不溶性担体との相互作用や結合反応の副反応によって、何らかの変性を受けている場合があり、このような変性が原因で、血清中の非特異反応誘起物質と反応が起こってしまう場合がある。
しかしながら、上記ブロッキング剤と、非特異反応抑制剤に用いる免疫学的に反応しない抗原とを同じ物質とすることにより、このような場合であっても、上記抗原が血清中の非特異反応誘起物質と反応を起こし、非特異反応が阻害(抑制)されると考えられる。
(1)緩衝液(第1試薬)
(1−1)非特異反応抑制剤の調製
平均粒子径が0.05μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLにエタノールを3mL入れ、室温で30分間攪拌した。次いで、この液にウシ血清アルブミン(以下、ウシ血清アルブミンのことをBSAという)を5.0重量%含有したリン酸塩緩衝食塩水(以下、リン酸塩緩衝食塩水のことをPBSともいう)を30mL添加し、室温にて120分間攪拌した後、30,000rpmで遠心分離することにより洗浄した。得られた沈殿物にリン酸塩濃度25mMのPBSを10ml添加し、ラテックス粒子を懸濁させ、非特異反応抑制剤を調製した。
1.0(W/V)%のプルラン(林原社製)、1.0(W/V)%のBSAを含有するPBS(pH6.5、リン酸塩濃度25mM)に、0.9(W/V)%塩化ナトリウムと0.1(W/V)%アジ化ナトリウムを添加した緩衝液に、(1−1)で調製した非特異反応抑制剤を5重量%となるように添加し、緩衝液(第1試薬)とした。
(2−1)脂質抗原液の調製
カルジオリピンのエタノール溶液(5mg/ml、シグマ社製)2ml、精製レシチン(ナカライテスク社製)のエタノール溶液(10mg/ml)10ml及びコレステロール(ナカライテスク社製)のエタノール溶液(10mg/ml)3mlを混合し、脂質抗原液を得た。
ポリスチレンラテックス(平均粒子径0.4μm、10(W/V)%、積水化学工業社製)100μlに、(2−1)で調製した脂質抗原液250μlを一気に添加し、そのまま37℃で緩やかに2時間攪拌した。次に5(W/V)%濃度でBSAを含むPBS(pH6.5、リン酸塩の濃度100mM)3mlを一気に添加し、更に1時間、37℃で攪拌した。15000rpm、4℃で30分間遠心分離し、上清を除き、沈殿したラテックス粒子を1(W/V)%濃度でBSAを含むPBS2mlに再び懸濁した。この操作を2回繰り返しラテックス粒子を洗浄し、最後に10mM濃度でEDTA・4Na、500mM濃度で塩化コリンを含むPBS10mlに懸濁させて脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)とした。
エタノールの添加量を12mLとして非特異反応抑制剤を調製した以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
実施例1と同様の方法で非特異反応抑制剤を調製した後、(1−2)緩衝液(第1試薬)の調製において、非特異反応抑制剤を10重量%となるように添加した以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
実施例2と同様の方法で非特異反応抑制剤を調製した後、(1−2)緩衝液(第1試薬)の調製において、非特異反応抑制剤を10重量%となるように添加した以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
(1−1)非特異反応抑制剤の調製
平均粒子径が0.05μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLにエタノールを3mL入れ、室温で30分間攪拌した。次いで、BSAを5.0重量%含有するPBSを、56℃で10分間熱変性させたもの30mLを添加し、室温にて120分間攪拌した後、30,000rpmで遠心分離することにより洗浄した。得られた沈殿物にリン酸塩濃度25mMのPBSを10ml添加し、ラテックス粒子を懸濁させ、非特異反応抑制剤を調製した。
(1−2)緩衝液(第1試薬)の調製において、非特異反応抑制剤を添加しなかった以外は、実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)及び脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
(1−2)緩衝液(第1試薬)の調製において、1.0(W/V)%濃度でプルラン(林原社製)、1.0(W/V)%BSAを含有するPBS(pH6.5,リン酸塩濃度25mM)に、0.9(W/V)%塩化ナトリウムと0.1(W/V)%アジ化ナトリウムを添加した緩衝液に、BSAを5.0重量%含有するPBSを、56℃で10分間熱変性させたものを添加することにより、緩衝液(第1試薬)を調製した以外は、実施例1と同様にして緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
(1−1)非特異反応抑制剤の調製
平均粒子径が0.05μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLに、BSAを5.0重量%含有したPBSを30mL添加し、室温にて120分間攪拌した後、30,000rpmで遠心分離することにより洗浄した。得られた沈殿物にリン酸塩濃度25mMのPBSを10ml添加し、ラテックス粒子を懸濁させ、非特異反応抑制剤を調製した。
(1−1)非特異反応抑制剤の調製
平均粒子径が0.05μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLに、BSAを5.0重量%含有するPBSを、56℃で10分間熱変性させたもの30mLを添加し、室温にて120分間攪拌した後、30,000rpmで遠心分離することにより洗浄した。得られた沈殿物にリン酸塩濃度25mMのPBSを10ml添加し、ラテックス粒子を懸濁させ、非特異反応抑制剤を調製した。
実施例1〜5及び比較例1〜4で得られた緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)について、以下の方法で評価した。
梅毒陰性血清20μlに、緩衝液(第1試薬)180μlを混合し、37℃で5分間保持した後、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)60μlを添加攪拌し、測定波長700nmで添加後1分間及び5分間の吸光度変化を、日立7170型生化学自動分析機を用いて測定した。そして、得られた吸光度変化から、予め作成した検量線に基づき測定値を求めた。
検量線は既知濃度の標準品を同一条件で測定し、濃度と吸光度変化量の関係を求めることにより作成した。判定基準は、測定値が1.0RU未満の場合を陰性とし、1.0RU以上の場合は、実際は陰性であるにもかかわらず、何らかの物質と反応して誤判定されたものと考えられることから、偽陽性とした。結果を表1に示す。
更に、実施例1〜5の結果から、有機溶媒添加量の増加やBSAの熱変性によって、非特異反応抑制効果をより向上させることが可能となることが分かる。
実施例1の(1−1)非特異反応抑制剤の調製において、平均粒子径が0.22μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLを用いた以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
実施例1の(1−1)非特異反応抑制剤の調製において、平均粒子径が0.15μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLを用いた以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
実施例1の(1−1)非特異反応抑制剤の調製において、平均粒子径が0.05μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLを用いた以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
実施例1の(1−1)非特異反応抑制剤の調製において、平均粒子径が0.40μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLを用いた以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
実施例6〜8及び比較例5で得られた緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)について、以下の方法で評価した。
7種類の梅毒陰性血清20μlに、緩衝液(第1試薬)180μlを混合し、37℃で5分間保持した後、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)60μlを添加攪拌し、測定波長700nmで添加後1分間及び5分間の吸光度変化を、日立7170型生化学自動分析機を用いて測定した。そして、得られた吸光度変化から、予め作成した検量線に基づき測定値を求めた。判定基準は、測定値が1.0RU未満の場合を陰性とし、1.0RU以上の場合を偽陽性とした。結果を表2に示す。
実施例1の(1−1)非特異反応抑制剤の調製において、平均粒子径が0.05μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLに、エタノール3mLの代わりに、プロパノール3mlを添加した以外は実施例1と同様の方法で非特異反応抑制剤を調製した後、(1−2)緩衝液(第1試薬)の調製において、非特異反応抑制剤を10重量%となるように添加した以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
実施例1の(1−1)非特異反応抑制剤の調製において、平均粒子径が0.05μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLに、エタノール3mLの代わりに、プロパノール6mlを添加した以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
実施例1の(1−1)非特異反応抑制剤の調製において、平均粒子径が0.05μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLに、エタノール3mLの代わりに、プロパノール6mlを添加した以外は実施例1と同様の方法で非特異反応抑制剤を調製した後、(1−2)緩衝液(第1試薬)の調製において、非特異反応抑制剤を10重量%となるように添加した以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
(1)非特異反応抑制剤の調製
実施例1の(1−1)非特異反応抑制剤の調製において、平均粒子径が0.05μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%、積水化学工業社製)1.0mLに、エタノール3mLの代わりに、メタノール3mlを添加した以外は実施例1と同様の方法で非特異反応抑制剤を調製した後、(1−2)緩衝液(第1試薬)の調製において、非特異反応抑制剤を10重量%となるように添加した以外は実施例1と同様にして、緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)を調製した。
実施例9〜12で得られた緩衝液(第1試薬)、脂質抗原感作ラテックス試薬(第2試薬)について、上述した実施例1〜5及び比較例1〜4の場合と同様の方法で評価した。結果を表3に示した。
Claims (5)
- 被測定物質に対して免疫学的に反応する抗体又は抗原を平均粒子径0.05〜0.5μmの担体に担持した免疫測定粒子を使用する免疫測定方法に用いられる非特異反応抑制剤であって、
被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体又は抗原を有機溶媒存在下で担持した不溶性担体からなり、
前記不溶性担体の平均粒子径は、前記担体の平均粒子径よりも小さい
ことを特徴とする非特異反応抑制剤。 - 被測定物質に対して免疫学的に反応する抗体又は抗原を平均粒子径0.05〜0.5μmの担体に担持した免疫測定粒子と、請求項1記載の非特異反応抑制剤とを含有することを特徴とする免疫測定試薬。
- 免疫測定粒子には、更にブロッキング剤が担持されており、前記ブロッキング剤と、免疫学的に反応しない抗原とは同じ物質であることを特徴とする請求項2記載の免疫測定試薬。
- 請求項2又は3記載の免疫測定試薬を用いてなることを特徴とする免疫測定方法。
- 被測定物質に対して免疫学的に反応する抗体又は抗原を平均粒子径0.05〜0.5μmの担体に担持した免疫測定粒子を使用する免疫測定方法に用いられる非特異反応抑制剤の製造方法であって、
被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体又は抗原を有機溶媒存在下で不溶性担体に担持させる
ことを特徴とする非特異反応抑制剤の製造方法。
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