JP2004138577A - 蛋白質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来の固相化法では容易に固定化できなかった試料中の蛋白質を固相に固定化でき、且つ試料中に共存する阻害物質の影響を軽減して蛋白質の定量的測定／検出を行うことができる固定化方法、それを用いた蛋白質の定量方法、イムノブロッティング方法並びに蛋白質固定化用試液の提供。
【解決手段】低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩の共存下で、蛋白質を、疎水性表面を有する固相と接触させることを特徴とする、当該蛋白質の当該固相への固定化方法及びそれに用いる固定化用試液。該固定化方法により蛋白質が固定化された固相に蛋白質染色液を接触させ、それにより生じた発色の程度に基づいて行うことを特徴とする、蛋白質の定量方法並びに該固定化方法により蛋白質が固定化された固相を用いることを特徴とする、イムノブロッティング方法。
【選択図】　　　　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固相への蛋白質の新規な固定化方法、それを用いた蛋白質の定量方法、イムノブロッティング方法並びに蛋白質固定化用試液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質の定量は、従来、溶液内で蛋白質の化学的反応性の高い部分と蛋白質反応試液とを反応させたり［Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　１９３：　２６５−２７５　（１９５１）、Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１５０：７６−８５　（１９８５）］、蛋白質と特異的に吸着する色素試液と反応させることで［Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７２：　２４８−２５４　（１９７６）、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，　３２：１５５１−１５５４　（１９８６）］、溶液の吸光度を変化させ、その吸光度変化に基づいて測定する方法、いわゆる液相法が主流であった。しかしながら、生化学的サンプルには、通常、蛋白質の他、非蛋白質性生体成分や緩衝剤、塩類、酸化防止剤、キレート剤、糖類、有機溶媒、人工ポリマー、界面活性剤等多数の物質が共存しており、多くのサンプルでは、これらの共存物質が原因となって蛋白質と蛋白質測定試液の相互作用（反応・結合）を阻害し、正確な蛋白質の測定ができない場合が多々ある。そこで、蛋白質を膜等の固相面に吸着させ、上記共存物質のような蛋白質測定に対する阻害物質を洗い流し、固相面に滞留した蛋白質を蛋白質測定試液で反応させ定量する方法、いわゆる固相化法が開発された［Ｋｕｎｏ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　２１５：９７４−９７５　（１９６７）、Ｇａｔｅｓ，Ｒ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９６：２９０−２９５　（１９９１）、Ｓａｉｄ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９１：１１９−１２６　（１９９０）、Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１６９：２２７−２３３　　（１９８８）、Ｌｉｍ，Ｍ．Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２１：８８８−８９５　（１９９６）］。
【０００３】
しかしながら、これらの蛋白質の膜固定化方法は、阻害物質を除去することはできるが、一定の割合で蛋白質を膜に固定化することができず、やはり正確な蛋白質の定量を行えないため、問題解決には至っていない。
【０００４】
一方で、蛋白質の固定化法として蛋白質変性・チャージ中和作用のあるトリクロロ酢酸や酢酸溶液、酢酸／メタノール溶液を夫々固定化溶液として用いる方法が古くから行われている。しかし、蛋白質によっては十分な固定化ができない場合があるため、蛋白質の測定を定量的に行えない。そのため、新たな蛋白質の固定化／定量方法の開発が望まれている現状にあった。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５−２７５（１９５１），　第２６６頁〜第２７０頁）
【非特許文献１】
Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５０，７６−８５　（１９８５），　（第７７頁〜第８０頁）
【非特許文献１】
Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，　２４８−２５４（１９７６），　（第２４９頁〜第２５１頁）
【非特許文献１】
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３２，１５５１−１５５４（１９８６），　（第１５５１頁〜第１５５２頁）
【非特許文献１】
Ｋｕｎｏ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２１５，９７４−９７５（１９６７），　（第９７５頁）
【非特許文献１】
Ｇａｔｅｓ，Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９６，２９０−２９５（１９９１），　（第２９１頁〜第２９４頁）
【非特許文献１】
Ｓａｉｄ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９１，１１９−１２６（１９９０），　（第１２０頁〜第１２２頁，　第１２５頁）
【非特許文献１】
Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６９，２２７−２３３（１９８８），　（第２２９頁，　第２３２頁）
【非特許文献１】
Ｌｉｍ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１，８８８−８９５（１９９６），　（第８８９頁〜第８９０頁）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、従来の固相化法では容易に固定化できなかった試料中の蛋白質を固相に固定化でき、且つ試料中に共存する阻害物質の影響を軽減して蛋白質の定量的測定／検出を行うことができる固定化方法、それを用いた蛋白質の定量方法、イムノブロッティング方法並びに蛋白質固定化用試液を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
（１）低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩の共存下で、蛋白質を、疎水性表面を有する固相と接触させることを特徴とする、当該蛋白質の当該固相への固定化方法。
（２）上記（１）の方法により蛋白質が固定化された固相に蛋白質染色液を接触させ、それにより生じた発色の程度に基づいて行うことを特徴とする、蛋白質の定量方法。
（３）上記（１）の方法により蛋白質が固定化された固相を用いることを特徴とする、イムノブロッティング方法。
（４）低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩とを含有する、蛋白質固定化用試液。
【０００８】
即ち、本発明者等は、従来の固相化法では蛋白質の固定化が旨く行かない要因について検討を行ったところ、その最大の要因は、蛋白質を固相に固定化する段階で、目的の蛋白質を充分に（一定の割合で）固相に固定化できないために、蛋白質の定量的な測定が行えないのだということを見出した。
【０００９】
そこで、固定化を効率よく行う方法について更に検討を行った結果、エタノール等の低級アルコール類と、トリクロロ酢酸等のハロゲノカルボン酸の共存下に蛋白質の固定化を行うと、固相に蛋白質を充分に固定化できることを見出した。
【００１０】
また、界面活性剤のうち、長鎖アルキル硫酸塩が蛋白質の固定化にユニークな特性を持つことを見出した。即ち、長鎖アルキル硫酸塩を低級アルコール、又は更にハロゲノカルボン酸が存在する条件下で蛋白質の固定化を行うと、蛋白質の吸引・ろ過を行う過程で、蛋白質に何らかの影響を及ぼし、その結果、蛋白質の膜吸着を促進し安定化する一方、阻害物質等の共存物質を膜固相面から排除するように働く（阻害物質の膜滞留を抑える）ことが明らかとなった。長鎖アルキル硫酸塩のこうした働きは、蛋白質含有固定化用試料溶液をマイクロプレートウエル等の固相面に静置した場合でも起こり得る。
【００１１】
一般的に非イオン性界面活性剤等の界面活性剤は、疎水性物質の吸着を阻害する性質を有しており、一方、蛋白質と膜の結合は疎水結合によると考えられている。そのため、これまで界面活性剤が蛋白質の固定化時に好んで用いられることはなく、それ故に界面活性剤の持つ蛋白質に対する作用と、作用を受けた蛋白質の固相面に対する相互作用を詳細に論じた報告は殆ど無い。そのため、界面活性剤である長鎖アルキル硫酸塩が、蛋白質の固定化に有効であるということは今まで知られていなかった。
【００１２】
従って、長鎖アルキル硫酸塩を、従来から蛋白質固定化に用いられていた低級アルコール類、及びハロゲノカルボン酸と共存させることで、蛋白質を充分に固相に固定化できるということは、本発明者らが初めて見出したことである。更に、従来の固相法では界面活性剤が共存する試料中の蛋白質を効率よく固定化することができなかったため、蛋白質の定量も行えなかったが、本発明の固定化法によれば、そのような試料中の蛋白質も効率よく固定化することができ、極めて有効な、利用価値の高い蛋白質固定化方法を完成した。
【００１３】
尚、本発明に於いて、蛋白質の固定化法という場合、蛋白質を固相に固定化する方法をいい、固相法による蛋白質の測定又は定量という場合は、本発明に係る固定化方法で蛋白質を固相に固定化した後、蛋白質の測定又は定量を行うことを意味する。
【００１４】
本発明に係る低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられ、中でもエタノール又はメタノールが好ましい。
【００１５】
本発明に係るハロゲノカルボン酸のハロゲン原子としては、臭素、フッ素、塩素等が挙げられ、中でも塩素が好ましい。カルボン酸としては、酢酸、プロピオン酸等が挙げられ、中でも酢酸が好ましい。このようなハロゲノカルボン酸としては、例えばトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、トリフロロ酢酸（ＴＦＡ）等が挙げられる。
【００１６】
本発明に係る長鎖アルキル硫酸塩の長鎖アルキル基としては、炭素数７〜２５のものが好ましく、中でも８〜１５が好ましい。より好ましくはドデシル基である。また、硫酸塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が好ましく、中でもナトリウム塩が好ましい。このような長鎖アルキル硫酸塩の具体例としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられ、中でもＳＤＳが好ましい。
【００１７】
本発明に係る固定化方法に於いて、蛋白質を低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩と共存させる方法としては、蛋白質を、疎水性表面を有する固相と接触させる際に、当該蛋白質が低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩と共存している状態にできるものであれば、どのような方法でも良い。
【００１８】
例えば、（１）蛋白質を含有する試料と、低級アルコールを含有する溶液と、ハロゲノカルボン酸を含有する溶液及び／又は長鎖アルキル硫酸塩を含有する溶液を混合する方法、（２）蛋白質を含有する試料と、低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩を直接混合する方法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００１９】
低級アルコールを含有する溶液、長鎖アルキル硫酸塩を含有する溶液及びハロゲノカルボン酸を含有する溶液を調製する際に用いられる溶液としては、例えば精製水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液を構成する緩衝剤としては、例えばＭＯＰＳ，ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝剤、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤等、通常この分野で用いられている緩衝剤が挙げられるが、なるべく蛋白質の固定化や測定に対する影響を回避するために、精製水を用いるのが好ましい。
【００２０】
蛋白質と疎水性表面を有する固相とを接触させる固定化用試料中の各試薬の好ましい濃度としては、低級アルコール濃度が３０〜５０　Ｖ／Ｖ％、ハロゲノカルボン酸濃度が０．０８〜１０Ｗ／Ｖ％、長鎖アルキル硫酸塩濃度が０．１〜１Ｗ／Ｖ％である。
【００２１】
本発明に係る疎水性表面を有する固相としては、例えば疎水性表面を有する膜、疎水性表面を有するプレート等が挙げられる。疎水性表面を有する膜の具体例としては、例えば疎水性膜であるポリビニリデンジフロライド膜（ＰＶＤＦ膜）、ニトロセルロース膜、濾紙等が挙げられ、疎水性表面を有するプレートの具体例としては、例えば通常ＥＬＩＳＡ等でよく用いられるプラスッチックプレート等が挙げられる。
【００２２】
蛋白質を、疎水性表面を有する固相と接触させる方法としては、上記方法により調製した、蛋白質と、低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩を含有する固定化用試料を、当該疎水性表面を有する固相と接触させればよい。例えば固定化用試料を当該固相上に滴下する、塗布する等の方法がある。
【００２３】
当該固相として疎水性膜を用いる場合には、当該疎水性膜上に当該固定化用試料を滴下等した後、静置して当該疎水性膜に当該固定化用試料を浸透させるか、又は固定化用試料を、当該疎水性膜を通して吸引濾過する、通常のフィルトレーション法、或いは遠心濾過法による方法を用いれば良い。
【００２４】
フィルトレーション法による蛋白質の固定化方法を、市販のドットブロッターもしくはスロットブロッターを用いる方法を例に挙げて具体的に説明すると、以下の通りである。
【００２５】
まず、メタノール、次いで蒸留水に浸したＰＶＤＦ膜等の疎水性膜及び要すればその上に蒸留水に浸した濾紙となるようにドットブロッターにセットする。次に、一定量の蛋白質と低級アルコール、長鎖アルキル硫酸塩及び／又はハロゲノカルボン酸を含有する固定化用試料（最大４００μＬ）をドットブロッターのウェルにアプライし、真空ポンプで、約１５Ｋｐａ程度の引圧でゆっくり吸引する（フィルトレーションする）と、固定化用試料中の蛋白質はＰＶＤＦ膜に吸着される。固定化試料を完全に吸引した後、洗浄液を各ウェルにアプライし、吸引する。次いで、ドットブロッターからＰＶＤＦ膜を取り出し、ペーパータオル、濾紙等の上に乗せ、約３０分以上かけて真空乾燥を行う。
【００２６】
蛋白質が吸着し易いか否かは、その蛋白質の疎水性と固相膜面の疎水性の関係により決まる。例えばその条件下で吸着し易い蛋白質は、速く吸引した場合も十分吸着されるが、中程度もしくは弱い吸着性しか示さない蛋白質の吸着の程度は吸引速度に大きく影響される。従って、目的の蛋白質を十分吸着させるためには、一般にゆっくり吸引することが好ましい。例えば１０分以上をかけて吸引することが好ましい。
【００２７】
当該固相として、疎水性表面を有するプレートを用いる場合には、例えば当該プレート上に当該固定化用試料を滴下又は塗布等した後、静置して自然乾燥させる方法等を行えばよい。
【００２８】
蛋白質の定量を行うには、蛋白質を固定化した固相を通常の蛋白質定量方法に付し、試料中の蛋白質量を測定すればよい。
【００２９】
本発明に係る蛋白質の定量方法としては、上記方法により蛋白質を固相に固定化させた後、蛋白質染色液として例えばアミノブラック、ピロガロールレッド‐モリブデン酸複合体（Ｐｙｒｏｍｏｌｅｘ）溶液を用いた方法、クマシーブリリアントブルー　（ＣＢＢ）−Ｇ２５０を用いたブラッドフォード法、ビシンクロニニック酸（ＢＣＡ）を用いた方法等によって染色を行い、生じた発色の程度を測定することによって行う、自体公知の蛋白質測定方法によって測定を行えばよい。
【００３０】
実際の定量には、測定しようとする蛋白質毎に、蛋白質濃度既知の蛋白質試料を用いて同様に固定化、染色、測定を行い、検量線を作成しておく。そして、その検量線をもとに、試料中の蛋白質濃度を決定する。
【００３１】
例えば、Ｐｙｒｏｍｏｌｅｘ発色法による定量方法を例にとって説明すると、先ず、蛋白質試料中の蛋白質を本発明の方法によりＰＶＤＦ膜に固定化させた後、ＰＶＤＦ膜を精製水又はＰＢＳ等の緩衝液で洗浄する。要すれば室温で３０分程度真空乾燥させた後、Ｐｙｒｏｍｏｌｅｘ含有染色試液に２０〜３５分程度浸漬させて、発色させる。その後、デンシトメーター、ＣＣＤカメラ等により６００ｎｍの吸光度を測定する。得られた吸光度を、予め濃度既知の蛋白質試料を用いて同様に蛋白質の固定化、測定を行って得られた検量線から、蛋白質の濃度を決定すればよい。
【００３２】
本発明に係るイムノブロッテイング方法としては、本発明の方法によって固相に蛋白質を固定化させる以外は、当該蛋白質に対する抗体や標識抗体を用いて抗原抗体反応による当該蛋白質の測定／検出を行う、通常のイムノブロッティング方法が適用できる。本発明に係る固定化方法を行えば、蛋白質を効率的に固相に固定化できるので、本発明に係るイムノブロッテング方法によれば、従来よりも感度よく蛋白質の検出及び分析を行うことができる。
【００３３】
本発明の固定化方法によって固定化できる蛋白質は、従来の固相化法によって固定化されていた蛋白質は全て挙げられるが、例えば血液、血清、血漿、髄液等の各種体液や尿、リンパ球、血球、細胞類等の生体由来の試料中に含まれる蛋白質が挙げられる。
【００３４】
具体的には、例えばリゾチーム，チトクロームｃ、ＤＮａｓｅ等の酵素、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等の抗体、フィブリノーゲン等の糖蛋白質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）等の血清蛋白質、卵白アルブミン（ＯＶＡ），プリオン等の蛋白質、トリプシンインヒビター等のインヒビター、インシュリン等のホルモン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
尚、本発明は、例えば従来の固相化法では固相に充分固定化できなかったチトクロームｃ等の塩基性蛋白質をも固定化することができ、蛋白質の定量を行える点で、特に有効である。
【００３６】
本発明に係る蛋白質の固定化方法に於いて、固相に固定化できる蛋白質の濃度上限は、例えば、固相が膜の場合約５００μｇ／ｃｍ^２程度、固相がマイクロプレートの場合約１０μｇ／ｃｍ^２程度であるので、固定化用試料中の蛋白質の量は、固定化する固相の種類に応じて、その最大保持能を超えないように、調製することが望ましい。
【００３７】
本発明に係る蛋白質固定化用試液としては、本発明に係る低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩とを含有していればよく、その具体例は前記したとおりである。
【００３８】
また、蛋白質固定化用試液中の低級アルコールの濃度は、蛋白質を固相に固定化する際に３０〜５０Ｖ／Ｖ％になるような濃度、ハロゲノカルボン酸の濃度は０．１〜１０Ｗ／Ｖ％になるような濃度、長鎖アルキル硫酸塩の濃度は、０．１〜１Ｗ／Ｖ％になるような濃度であればよい。より好ましくは、低級アルコールは３５〜５０Ｖ／Ｖ％、ハロゲノカルボン酸は０．５〜５Ｗ／Ｖ％、長鎖アルキル硫酸塩は０．１〜０．４Ｗ／Ｖ％、である。
【００３９】
更に、本発明に係る蛋白質固定化用試液には、蛋白質の固相への固定化、またそれに続く蛋白質の定量に影響を及ぼさないものであれば、その他に塩類、キレート等を含有していてもよい。
【００４０】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
実施例１．
［試料及び試液の調製］
（１）蛋白質試料
卵白アルブミン（以下、ＯＶＡと略記する。ニワトリ卵白由来、和光純薬工業（株）製）、ヘモグロビン（ウシ血液由来、和光純薬工業（株）製）、ＩｇＧ（ウシ由来、和光純薬工業（株）製）、チトクロームｃ（ウマ心筋由来、和光純薬工業（株）製）、リゾチーム（ニワトリ卵白由来、和光純薬工業（株）製）、を夫々秤量し、精製水に溶解して２５０μｇ／ｍＬ溶液としたものを蛋白質試料として用いた。
【００４２】
（２）固定化用試液
各試薬を精製水に溶解して、下記の固定化用試液を調製した。この中で固定化用試液３〜５が、本発明に係る固定化用試液である。
尚、各試薬は、エタノール（和光純薬工業（株）製、特級）、トリクロロ酢酸（以下、ＴＣＡと略記する。和光純薬工業（株）製、化学用）、ドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略記する。和光純薬工業（株）製、化学用）を用いた。
対照　　　　　：精製水
固定化用試液１：０．２　Ｗ／Ｖ　％　ＳＤＳ、
固定化用試液２：０．２　Ｗ／Ｖ　％　ＳＤＳ、２．５Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ
固定化用試液３：０．２　Ｗ／Ｖ　％　ＳＤＳ、４５Ｖ／Ｖ％　エタノール
固定化用試液４：０．２　Ｗ／Ｖ　％　ＳＤＳ、２．５Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４５Ｖ／Ｖ％　エタノール
固定化用試液５：２．５Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４５Ｖ／Ｖ％　エタノール
（３）固定化用試料
蛋白質試料２０μＬ（蛋白質５μｇ）と、所定の固定化用試液３００μＬとを混合したものを調製し、固定化用試料とした。固定化用試料中の各試薬の終濃度（ＰＶＤＦ膜と接触させる際の濃度。以下同じ。）は、夫々下記の通りである。
固定化用試料１：０．１９　Ｗ／Ｖ　％　ＳＤＳ、
固定化用試料２：０．１９　Ｗ／Ｖ　％　ＳＤＳ、２．３４Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ
固定化用試料３：０．１９　Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ、４２．２Ｖ／Ｖ％エタノール
固定化用試料４：０．１９　Ｗ／Ｖ　％　ＳＤＳ、２．３４Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４２．２Ｖ／Ｖ％　エタノール
固定化用試料５：２．３４Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４２．２Ｖ／Ｖ％　エタノール
【００４３】
［蛋白質の固定化及び測定］
ドットブロッター　ＡＤＶＡＮＴＥＣ　ＤＰ−９６（アドバンテック製）に親水化処理したポリビニリデンジフロライド膜（ＰＶＤＦ膜、ミリポア製、イモビロンＰ^ＳＱ　　０．１μｍ）をセットした。次にＰＶＤＦ膜に固定化用試料３２０μＬをアプライし、真空ポンプ（バイオクラフト社製）にて、１５ＫＰａ（１０ｃｍＨｇ）で１０分間吸引濾過した。次いでｐＨ７．４リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　３００μＬをアプライし、同様に吸引濾過して、ＰＶＤＦ膜を洗浄した。ＰＶＤＦ膜を取り出し真空乾燥させた後、Ｐｙｒｏｍｏｌｅｘ試液（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒａｐｉｄ　Ｋｉｔ　ｗａｋｏ、和光純薬工業（株）製）で発色させ、次いでデンシトメーター　ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＣＳ−９０００（（株）島津製作所　製）で６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。
【００４４】
［結果］
結果を図１に示す。図１に於いて、各バーは下記固定化用試料を用いた場合の結果を夫々示す。

【００４５】
図１から明らかなように、試薬としてＳＤＳのみを含有する固定化用試料１を膜に固定化させた場合は、シグナル強度が全く測定できなかった（固定化用試料１）。また、ＳＤＳとＴＣＡを含有する固定化用試料２を用いた場合は、少しシグナル強度が強くなった（測定できた）が、対照（精製水を用いた場合、従来の固定化法）ほど高いシグナル強度は得られなかった。
これに対し、ＳＤＳとエタノールを含有する固定化用試料３を用いた場合は、対照と同等若しくはそれ以上のシグナル強度が得られた。
また、ＴＣＡとエタノールを含有する固定化用試料５を用いた場合は、チトクロームｃを固定化した場合以外は、すべて対照と比較して遙かに高いシグナル強度が得られた。
更に、ＴＣＡとエタノールとＳＤＳを含有する固定化用試料４を用いた場合には、チトクロームｃを固定化した場合も含めて、全ての場合で対照と比較して遙かに高いシグナル強度が得られた。
以上のことより、低級アルコールとハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩の共存下で行う本発明に係る固定化法によれば、従来の水や緩衝液だけを用いて行っていた固定化法と比較して、膜への蛋白質の固定化率を飛躍的に向上させることができることが判る。
また、固定化用試料３及び４で、対照と同程度又はそれより高いシグナル強度が測定できたことから、本発明の固定化法によれば、予めＳＤＳ等を含有する試料を用いても、蛋白質を固定化することができることが判る。
【００４６】
実施例２．
［試料及び試液の調製］
（１）蛋白質試料
リゾチーム、チトクロームｃ、ＩｇＧ、フィブリノーゲン（ヒト血漿由来、和光純薬工業（株）製）、ＢＳＡ（牛血清アルブミン、和光純薬工業（株）製）、ＯＶＡ、トリプシンインヒビター（大豆由来、和光純薬工業（株）製）、ヘモグロビンを夫々秤量し、精製水に溶解して２５０μｇ／ｍＬ溶液としたものを蛋白質試料として用いた。
尚、これらの蛋白質は等電点ｐＩが４．０−１１．４の幅広い範囲にあり、分子量は１２０００−１５０，０００と広範囲のものである（久保ら，蛋白質　生化学ハンドブック，丸善株式会社，５４−７３　（１９８４）参照）。
（２）固定化用試液
２．５　Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４５　Ｖ／Ｖ％　エタノール、及び所定濃度（０〜０．４Ｗ／Ｖ％）のＳＤＳを含有するように、精製水に溶解して調製したものを固定化用試液として用いた。
（３）固定化用試料
所定の蛋白質試料２０μＬ（蛋白質量５μｇ）と固定化用試液３００μＬとを混合したものを調製し、固定化用試料とした（ＴＣＡ終濃度２．３４Ｗ／Ｖ％、エタノール終濃度４２．２Ｖ／Ｖ％）。
［蛋白質の固定化及び測定］
実施例１と同様の方法で、各固定化用試料中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に固定化し、洗浄、染色処理し、次いでデンシトメーターで６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。
【００４７】
（結果）
結果を図２に示す。
図２に於いて、−△−はリゾチーム、−−−はチトクロームｃ、−○−はＩｇＧ、−□−はフィブリノーゲン、−●−はＢＳＡ、−◆−はＯＶＡ、−◇−はトリプシンインヒビターを含有する蛋白質試料を用いた場合の結果を夫々示す。また、横軸は固定化用試液中のＳＤＳ濃度を示す。更に、図２中の、各ポイントのバーは、±ＳＤを示す。
図２から明らかな如く、殆どの蛋白質でＳＤＳ共存下にＰＶＤＦ膜に固定化させると、一旦シグナル強度が増加するが、ＳＤＳ濃度が０．１Ｗ／Ｖ％以上になるとシグナル強度がある一定の値を示す傾向を示した。このことから、固定化用試液中のＳＤＳ濃度を０．１Ｗ／Ｖ％以上（固定化用試料中の終濃度０．０９Ｗ／Ｖ％以上）とすることにより、試料中の蛋白質のＰＶＤＦ膜への固定化率が一定となると考えられる。
また、データのバラツキを示すＣＶ値（ＣＶ値＝標準偏差／平均値（％））についてみると、どの蛋白質も固定化用試液中のＳＤＳ濃度が０．１　Ｗ／Ｖ％より低い濃度では、ＣＶ値が大きく、シグナル強度が安定していないことが分かる。それに対し、固定化用試液中のＳＤＳ濃度が０．１Ｗ／Ｖ％以上の場合は、ＣＶ値が比較的小さく、上述したようにこの濃度範囲でシグナル強度の値が安定であることが示されている。この結果は、試料中の蛋白質の固相膜に固定化される量を示していると考えられる。また、データは示していないが、この結果は再現性があることを確認している。一般に、ＳＤＳ等の長鎖アルキル硫酸塩は、０．００２５　Ｗ／Ｖ％といったかなりの低濃度でも蛋白質の構造崩壊作用を示し、構造崩壊の程度により蛋白質結合（染色）色素に対する反応性に違いを生ずるといわれている（Ｏｒｓｏｎｎｅａｕ，　Ｊ−Ｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，　３５，　２２３３−２２３６　（１９８９））。従って、ここでも、それが要因となって、ＳＤＳ濃度が０．１　Ｗ／Ｖ％より低い固定化溶液を用いた場合で、シグナル強度が上昇する等の急激な変化を示し、且つ、それが変化の途中過程にあるため、ＣＶ値（＜１５％）が大きくなったと推察される。また、このことは、０．１　Ｗ／Ｖ％より低いＳＤＳ濃度条件下では、試料中の蛋白質のＰＶＤＦ膜への固定化率が変動している（一定でない）可能性をも示唆している。
【００４８】
以上のことより、図２に於いて、ＳＤＳの濃度変化の影響を受けずに吸光度（シグナル強度）が安定した時、始めて蛋白質のＰＶＤＦ膜への固定化率が一定になっているのではないかと推察された。
そこで、図２の結果を基に、蛋白質試料としてＢＳＡを用い、０．１　Ｗ／Ｖ％　ＳＤＳを含有する固定化用試液で固定化した後測定を行った場合のシグナル強度を１００（基準値）とした。そして、基準値に対する、その他の各蛋白質を蛋白質試料として用い、０．１Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ、０．２　Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ、０．３　Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ又は０．４　Ｗ／Ｖ％のＳＤＳ固定化用試液を用いて同様に固定化及び測定を行って得られたシグナル強度の相対値を夫々算出した。
【００４９】
表１に、ＳＤＳ濃度が０．２Ｗ／Ｖ％〜０．４Ｗ／Ｖ％まで変化するまで、表２にはＳＤＳ濃度が０．１Ｗ／Ｖ％〜０．４Ｗ／Ｖ％まで変化するまでの、各ポイントのＣＶ値を平均化した値（平均ＣＶ値（％））、各ポイントの相対値の平均値、そのポイント間の絶対偏差を平均した値（平均絶対偏差）、平均絶対偏差をその平均値で割りパーセント表示した値（ポイント間変動率（％））を夫々示す。ポイント間変動率とは、ＳＤＳ濃度変化に伴うシグナル強度の変化を変動率として算出した値のことで、この数字が小さいほど、ＳＤＳ濃度に影響されずにシグナル強度（測定結果）が一定であることを示している。
【００５０】
【表１】

【００５１】
【表２】

【００５２】
その結果、表１より、ＳＤＳ濃度が０．２　Ｗ／Ｖ％−０．４Ｗ／Ｖ％間で、例えばフィブリノーゲン、ＯＶＡ、ＩｇＧ、チトクロームｃは、そのポイント間変動率が最も安定し、１．４−２．７％を示した。また、これら蛋白質の平均ＣＶ値（０．８−１．９％）と比較しても遜色ない結果であり、ＳＤＳ濃度が変化してもシグナル強度の変動が非常に少ないことを示している。
また、表２より、フィブリノーゲンを除く３つの蛋白質は、ＳＤＳ濃度が０．１−０．４Ｗ／Ｖ％の間でもポイント間変動率が２．３−３．３％であり、ＳＤＳ濃度の影響によるシグナル強度の変動が少ないことがわかる。
また、ＳＤＳ濃度が０．１−０．４　Ｗ／Ｖ％の間でポイント間変動率が１０％を超えるフィブリノーゲン、リゾチーム、ＢＳＡについても、ＳＤＳ濃度を０．２−０．４Ｗ／Ｖ％に限定すると安定した結果が得られることが判る。
以上のことより、ＳＤＳ濃度が０．１Ｗ／Ｖ％以上でポイント間変動率が安定してくることから、この濃度範囲のＳＤＳを含有する固定化用試液を用いて、蛋白質を固定化すると、試料中の蛋白質量の正確な定量が行えることが判る。
【００５３】
実施例３．低級アルコールの検討
低級アルコールとしてエタノールの代わりにメタノールを用いた場合の蛋白質試料の固定化及び測定を行った。
［試料及び試液の調製］
【００５４】
（１）蛋白質試料
ＢＳＡ、ＯＶＡ、ヘモグロビン、ＩｇＧ、チトクロームｃ、リゾチームを夫々秤量し、精製水に溶解して２５０μｇ／ｍＬ溶液としたものを蛋白質試料として用いた。
（２）固定化用試液
精製水を用いて下記固定化用試液を調製した。
固定化用試液１：０．２　Ｗ／Ｖ％　ＳＤＳ、２．５　Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ
固定化用試液２：０．２　Ｗ／Ｖ％　ＳＤＳ、２．５　Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４５％　エタノール
固定化用試液３：０．２　Ｗ／Ｖ％　ＳＤＳ、２．５　Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４５％　メタノール（和光純薬工業（株）製、特級）
（３）固定化用試料
蛋白質試料２０μＬ（蛋白質量５μｇ）と、所定の固定化用試液３００ｍＬとを混合したものを調製し、固定化用試料１，２，３とした。固定化用試料中の各試薬の終濃度は、夫々ＳＤＳ　０．１９Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ　２．３４Ｗ／Ｖ％、エタノール　４２．２Ｖ／Ｖ％、メタノール　４２．２Ｖ／Ｖ％である。
［蛋白質の固定化及び測定］
実施例１と同様の方法で、各固定化用試料中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に固定化し、洗浄、染色処理し、次いでデンシトメーターで６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。
【００５５】
［結果］
結果を図３に示す。図３に於いて、各バーは夫々下記固定化用試料を用いた場合の結果を示す。

【００５６】
図３から明らかな如く、メタノールを含有する固定化用試液を用いて調製した固定化用試料を用いた場合も、エタノールを用いた場合と同程度のシグナル強度が得られ、蛋白質をＰＶＤＦ膜に固定化することができたことが判る。
【００５７】
実施例４．ハロゲノカルボン酸の検討
ハロゲノカルボン酸として、ＴＣＡの代わりにトリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する。）を用いた場合の蛋白質試料の固定化及び測定を行った。
［試料及び試液の調製］
（１）蛋白質試料
ＢＳＡ、ＩｇＧ、リゾチームを夫々秤量し、精製水に溶解して２５０μｇ／ｍＬ溶液としたものを蛋白質試料として用いた。
（２）固定化用試液
精製水を用いて、下記固定化用試液を調製した。
【００５８】
固定化用試液１：０．２　Ｗ／Ｖ％　ＳＤＳ、４５　Ｖ／Ｖ％　エタノール
固定化用試液２：０．２　Ｗ／Ｖ％　ＳＤＳ、４５　Ｖ／Ｖ％　エタノール、２．５　Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ
固定化用試液３：０．２　Ｗ／Ｖ％　ＳＤＳ、４５　Ｖ／Ｖ％　エタノール、２．５　Ｗ／Ｖ％　ＴＦＡ（和光純薬工業（株）製）
（３）固定化用試料
蛋白質試料２０μＬ（蛋白質量５μｇ）と、所定の固定化用試液３００ｍＬとを混合したものを調製し、固定化用試料１，２，３とした。固定化用試料中の各試薬の終濃度は、夫々ＳＤＳ　０．１９Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ　２．３４Ｗ／Ｖ％、ＴＦＡ　２．３４Ｗ／Ｖ％、エタノール　４２．２Ｖ／Ｖ％である。
［蛋白質の固定化および測定］
実施例１と同様の方法で、各固定化用試料中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に固定化し、洗浄、染色処理し、次いでデンシトメーターで６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。
【００５９】
［結果］
結果を図４に示す。図４に於いて、各バーは夫々下記固定化用試料を用いた場合の結果を示す。

【００６０】
図４から明らかな如く、ＴＦＡを含有する固定化用試試液用いて調製した固定化用試料を用いた場合も、ＴＣＡを用いた場合と同程度又はそれ以上のシグナル強度が得られ、蛋白質を有効に膜に固定化することができたことが判る。
【００６１】
実施例５．検量線の作成
［試料及び試液の調製］
（１）蛋白質試料
ＯＶＡを０〜２０μｇ／２０μＬとなるように精製水に溶解して蛋白質試料とした。
（２）固定化用試液
０．２　Ｖ／Ｖ％　ＳＤＳ、２．５　Ｖ／Ｖ％　ＴＣＡ、４５　Ｖ／Ｖ％　エタノールとなるように精製水に溶解して調製したものを固定化用試液として用いた。
（３）固定化用試料
蛋白質試料２０μＬ（蛋白質量５μｇ）と、固定化用試液３００μＬとを混合したものを調製し、固定化用試料とした。固定化用試料中の各試薬の終濃度は、夫々ＳＤＳ　０．１９Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ　２．３４Ｗ／Ｖ％、エタノール　４２．２Ｖ／Ｖ％である。
［蛋白質の固定化及び測定］
実施例１と同様の方法で、各固定化用試料中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に固定化し、洗浄、染色処理し、次いでデンシトメーターで６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。
【００６２】
［結果］
その結果を基に、蛋白質量（μｇ）とシグナル強度との関係を示す検量線を作成した。
結果を図５に示す。図５に於いて、各プロットのバーは、±２ＳＤを示す。
検量線から得られた結果は、測定範囲０．２−２０μｇ／蛋白質試料、一致係数０．９９以上、平均ＣＶ１．９％であった。
また、蛋白質濃度０．２−５μｇ／蛋白質試料の範囲で、直線性が得られた。測定結果を統計処理して得られた、この範囲での回帰直線式及び相関係数は下記の通りである。
回帰直線式：ｙ＝０．１２ｘ＋０．０１
相関係数（Ｒ^２）：０．９９
ｘ：蛋白質量
ｙ：シグナル強度
図５から明らかな如く、本発明の方法によりＯＶＡをＰＶＤＦ膜に固定化し、蛋白質量の測定を行ったところ、良好な直線性を示す検量線が得られるので、本発明の固定化方法によれば、高精度のＯＶＡ（蛋白質）濃度の定量測定が行えることが判った。
尚、データは示していないが、実施例２で測定した他の蛋白質についても同様に測定を行った結果、ＯＶＡと同様に直線性のある検量線が得られ、これらの蛋白質についても定量測定が行えることが判った。
【００６３】
実施例６．
［試料及び試液の調製］
（１）蛋白質試料
精製水を用いて、ＢＳＡ、トリプシンインヒビター、フィブリノーゲン、ＯＶＡ、ヘモグロビン、ＩｇＧ、チトクロームｃ、リゾチーム夫々の５μｇ／２０μＬ溶液を調製し、蛋白質試料とした。
［固相化法による蛋白質の測定］
精製水を用いて０．２Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ、２．５Ｗ／Ｖ％ＴＣＡ、４５Ｖ／Ｖ％　エタノールを含有する固定化用試液を調製した。次いで、調製した蛋白質試料２０μＬと固定化用試液３００μＬを混合し、得られた固定化用試料３２０μＬを用いて実施例１と同様の方法で固定化用試料中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に固定化、洗浄、染色処理し、次いで、デンシトメーターで６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。固定化用試料中の各試薬の終濃度は、夫々ＳＤＳ　０．１９Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ　２．３４Ｗ／Ｖ％、エタノール　４２．２Ｖ／Ｖ％である。
［液相法による蛋白質の測定］
上記で調製した蛋白質試料２０μＬに、１ｍＬ　Ｐｙｒｏｍｏｌｅｘ液を添加して、室温で２０分間インキュベーションし、６００ｎｍの吸光度を測定した。
【００６４】
［結果］
蛋白質試料としてＢＳＡを用い、０．２　Ｗ／Ｖ％ＳＤＳを含有する固定化用試料を調製して、ＢＳＡを固定化、測定を行った場合の吸光度（シグナル強度）を１（基準値）とした時の、基準値に対する各蛋白質について同様に固定化、測定を行って得られた吸光度の相対値を求めた結果を図６に示す。また、同様に蛋白質試料としてＢＳＡを用い、液相法による測定を行った場合の吸光度を１（基準値）とした時の、基準値に対する各蛋白質について同様に液相法による測定を行って得られた吸光度の相対値を求めた結果も、図６に併せて示す。
尚、図６に於いて、各バーは夫々下記の方法により各蛋白質を測定した結果に基づいて得られた、上記相対値を示す。

【００６５】
図６より明らかな如く、液相法による測定では、蛋白質濃度は同じでも、蛋白質の種類によって、ＢＳＡに対する吸光度の相対値が大きく異なり、例えばフィブリノーゲンでは、０．４６程度であった。
これに対し、本発明の固相法によって測定を行った場合のＢＳＡに対するフィブリノーゲンの吸光度（シグナル強度）の相対値は０．７５になり、ＢＳＡの場合との吸光度の差が少なくなっていることが判る。これは、測定した殆どの蛋白質についても言える。
また、測定した全蛋白質の平均吸光度の、ＢＳＡの場合のそれを１とした場合に対する相対値は、液相法の場合は０．６５であるのに対して本発明の固相法の場合は０．９４となり、蛋白質種による定量誤差が改善されたことが判る。これはタンパク質が変性状態で膜にトラップされることにより、液相法では反応できなかった、例えばチトクロームｃ、リゾチーム等の塩基性アミノ酸が、染色液と結合できる状態となり、本発明に係る固定化液で蛋白質が効率良く固定化され、より正確な測定結果を得られるようになったと考えられる。
【００６６】
実施例７．
［試料の調製と固定化］
精製水を用いて、ＩｇＧ試料（蛋白質量０〜４μｇ／２０μＬ）、及び２％ＳＤＳ含有ＩｇＧ試料（蛋白質量０〜４μｇ／２０μＬ）を調製した。別に精製水を用いて０．２５Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ、２．５Ｗ／Ｖ％ＴＣＡ及び４５Ｖ／Ｖ％エタノールを含有する固定化用試液を調製した。次いで、蛋白質試料２０μＬと固定化用試液３００μＬを混合し、得られた固定化用試料３２０μＬを用いて実施例１と同様の方法で固定化用試料中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に固定化、洗浄、染色処理し、次いでデンシトメーターで６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。
尚、ＳＤＳを含有しないＩｇＧ試料を用いて得られた固定化用試料中の各試薬の終濃度は、夫々ＳＤＳ　０．２３Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ　２．３４　Ｗ／Ｖ％、エタノール　４２．２Ｖ／Ｖ％である。また、２％ＳＤＳ含有ＩｇＧ試料を用いて得られた固定化用試料中の各試薬の終濃度は、夫々ＳＤＳ　０．３６　Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ　２．３４　Ｗ／Ｖ％、エタノール　４２．２　Ｖ／Ｖ％である。
【００６７】
［結果］
得られた結果を基に、ＳＤＳを含有しないＩｇＧ試料を用いた場合と、２％ＳＤＳ含有ＩｇＧ試料を用いた場合夫々について、蛋白質量（μｇ）とシグナル強度との関係を示す検量線を作成した。
結果を図７に示す。図７に於いて、―◆―はＳＤＳを含有しないＩｇＧ試料を用いた場合、―△―はＳＤＳを含有するＩｇＧ試料を用いた場合の結果を夫々示す。また、各プロットのバーは、±ＳＤを示す。
図７より明らかな如く、両方の検量線は、ほぼ一致した。
この結果から、本発明の固定化方法により蛋白質を固定化させれば、ＳＤＳが蛋白質試料中に存在していても、それに影響されることなく、目的の蛋白質を固相に固定化させ、蛋白質の定量を行うことができることが判る。
【００６８】
実施例８．
ＳＤＳを含有する種々の蛋白質試料を用いて本発明に係る蛋白質の固定化及び測定を行い、当該測定に及ぼすＳＤＳの影響を、液相法による測定の場合と比較した。
［試料及び試液の調製］
（１）蛋白質試料
精製水を用いて、０Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ（対照）、０．２Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ又は２Ｗ／Ｖ％ＳＤＳを含有する蛋白質試料（ＢＳＡ、トリプシンインヒビター、フィブリノーゲン、ヘモグロビン、ＯＶＡ、チトクロームｃ、リゾチーム、ＩｇＧ、トリプシン（和光純薬工業（株）製）夫々２５０μｇ／ｍＬを調製した。
［固定化法による蛋白質の測定］
精製水を用いて０．１Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ、２．５Ｗ／Ｖ％ＴＣＡ、４５Ｖ／Ｖ％エタノールを含有する固定化用試液を調製した。次いで調製した蛋白質試料２０μＬと固定化用試液３００μＬを混合し、得られた固定化用試料３２０μＬを実施例１と同様の方法で固定化、洗浄、染色処理し、デンシトメーターで、６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。［液相法による測定］
上記で調製した蛋白質試料２０μＬに、１ｍＬ　Ｐｙｒｏｍｏｌｅｘ液（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒａｐｉｄ　Ｋｉｔ　ｗａｋｏ、和光純薬工業（株）製）を添加して、２０分室温でインキュベーションし、６００ｎｍに於ける吸光度を測定した。
【００６９】
［結果］
得られた結果を、夫々の対照（ＳＤＳ含有していない試料）を用いて得られた結果を１００とした相対値で表し、表３にまとめた。
【００７０】
【表３】

【００７１】
表３から明らかな如く、本発明に係る固相法による蛋白質の測定を行った場合には、２Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ含有試料でも殆どの蛋白質で、対照に対し±２０％以内の測定結果が得られ、蛋白質試料中のＳＤＳが蛋白質測定に及ぼす影響を回避できたことが判る。
これに対して、２Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ含有試料を用いて液相法によって測定を行った場合には、全く測定ができなかった。
以上の結果から、本発明の蛋白質の固定化法及び定量方法は、あらゆる蛋白質に適用することができることが判る。また、これまで知られていたタンパク定量阻害剤、特に蛋白質可溶化剤として汎用されるＳＤＳ含有試料中の蛋白質定量が可能になった点で、非常に有用でもあることが明らかとなった。
【００７２】
実施例９．
試料中に含まれる界面活性剤が、本発明の固定化用試液を用いた固定化方法及び蛋白質の測定に及ぼす影響を調べた。
［固相法による固定化及び蛋白質の測定］
（１）ＢＳＡ又はＩｇＧ含有蛋白質試料中の蛋白質の測定
精製水で、表４記載の濃度となるように、各界面活性剤を含有するＢＳＡ試料又はＩｇＧ試料（蛋白質量　４μｇ／２０μＬ）を調製し、蛋白質試料とした。
別に、精製水で０．１Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ、２．５　Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４５　Ｖ／Ｖ％　エタノールを含有する固定化用試液を調製した。
次いで蛋白質試料２０μＬと固定化用試液３００μＬを混合して固定化用試料を調製し、その３２０μＬを用いて、実施例１と同様の方法で固定化用試料中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に固定化、洗浄、染色処理し、６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。
固定化用試料中の各試薬の終濃度は、ＳＤＳを含有しない蛋白質試料を用いた場合は、ＳＤＳ　０．０９４Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ　２３．４Ｗ／Ｖ％、エタノール　４２．２Ｖ／Ｖ％である。また、ＳＤＳ含有蛋白質試料を用いた場合の各試薬の終濃度は、ＴＣＡ及びエタノールの終濃度はＳＤＳを含有しない蛋白質試料を用いた場合と同じであるが、ＳＤＳの終濃度は、１％ＳＤＳ含有蛋白質試料を用いた場合は０．１６Ｗ／Ｖ％、２％ＳＤＳ含有試料を用いた場合は０．２１Ｗ／Ｖ％、４％ＳＤＳ含有試料を用いた場合は、０．３４Ｗ／Ｖ％となる。
【００７３】
（２）ＯＶＡ含有蛋白質試料中の蛋白質の測定
表４記載の濃度となるように、各界面活性剤を含有するＯＶＡ試料（蛋白質量　５μｇ／２０μＬ）を調製し、蛋白質試料とした。
別に、精製水で０．２Ｗ／Ｖ％ＳＤＳ、２．５　Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４５　Ｖ／Ｖ％　エタノールを含有する固定化用試液を調製し、上記（１）と同様の方法で固定化用試料を調製し、実施例１と同様の方法でＰＶＤＦ膜に固定化、洗浄、染色処理し、６００ｎｍの吸光度（シグナル強度）を測定した。
尚、固定化用試料中の各試薬の終濃度は、ＳＤＳを含有しない蛋白質試料を用いた場合は、ＳＤＳ　０．１９Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ　２３．４Ｗ／Ｖ％、エタノール　４２．２Ｖ／Ｖ％である。また、２％　ＳＤＳ含有蛋白質試料を用いた場合の各試薬の終濃度は、ＳＤＳ　０．３１Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ　２３．４％、エタノール　４２．２Ｗ／Ｖ％となる。
また、界面活性剤（阻害物質）を含有しない以外は上記と同様に調製したＢＳＡ試料、ＩｇＧ試料、ＯＶＡ試料を用いて同様に固定化、測定を行い、対照とした。
［液相法による蛋白質の測定］
表４記載の濃度となるように各界面活性剤を含有するＢＳＡ試料（１０μｇ／２０μＬ）を調製したものを用い、１ｍＬ　Ｐｙｒｏｍｏｌｅｘ溶液を使って、実施例６と同様の方法で測定した。
また、界面活性剤（阻害物質）を含有しない以外は上記と同様に調製したＢＳＡ試料を用いて同様に液相法による測定を行い、対照とした。
【００７４】
［結果］
夫々の測定は３回ずつ行い、得られた吸光度の平均値を求めた。。対照を用いて得られた平均値を１００として、それに対する界面活性剤を含有する試料を用いて得られた吸光度の平均値の相対値（％）を求め、その相関変位（ＣＶ）と併せて表４に示す。
表４に於いて、界面活性剤（阻害物質）の濃度は、蛋白質試料中の濃度を示す。また、液相法のデータ中、左側の値は界面活性剤の濃度を、右側の値は対照に対する、界面活性剤を含有する試料を用いた場合の平均測定値の相対値（％）±ＣＶを示す。
尚、表４に示したデータは、界面活性剤の最大許容濃度時のデータ、すなわち、添加剤として界面活性剤を用いた場合に、対照（添加剤なし）と比較して平均値が±２０％となる結果が得られた時のデータを示している。
【００７５】
【表４】

【００７６】
ＳＬＳ：　　　　Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ローム　アント゛　ハース社商品名）：ホ゜リオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル
ＮＰ−４０（日本エマルシ゛ョン（株）商品名）：ホ゜リオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル
Ｔｗｅｅｎ　２０（花王（株）商品名）：ホ゜リオキシエチレンソルヒ゛タンモノラウレート
Ｔｗｅｅｎ　８０（花王（株）商品名）：ホ゜リオキシエチレンソルヒ゛タンモノオレエート
Ｂｒｉｊ　３５（ＩＣＩ社商品名）：ホ゜リオキシエチレンラウリルエーテル
ＣＨＡＰＳ：３−［（３−コラミト゛フ゜ロヒ゜ル）シ゛メチルアンモニオフ゜ロハ゜ンスルホン酸］
ＣＴＡＢ：セチルトリメチルアンモニウムフ゛ロマイト゛
【００７７】
表４から明らかな如く、本発明の方法により蛋白質を固定化し測定した場合、蛋白質試料の調製時に一般に用いられる界面活性剤が高濃度共存していても、それに影響を受けずに蛋白質の測定が可能であることが判る。特に液相法と比較すると、液相法の１０倍又はそれ以上の濃度の界面活性剤が蛋白質試料中に添加剤として共存していても、測定可能であることが判る。
以上のことより、本発明の蛋白質の固定化方法は、従来より添加剤として汎用されている界面活性剤に起因する問題、即ち蛋白質の定量を阻害するという問題を解決し得るものであることが判る。
【００７８】
実施例１０．イムノブロッティング
［試料及び試液の調製］
（１）蛋白質試料
マウスＩｇＧ（和光純薬工業（株）製）を秤量し、精製水に溶解して０￣２００μｇ／ｍＬ溶液としたものを蛋白質試料として用いた。
（２）固定化用試液
精製水で、０．２　Ｗ／Ｖ％　ＳＤＳ、２．５　Ｗ／Ｖ％　ＴＣＡ、４５　Ｖ／Ｖ％　エタノールを含有する固定化用試液を調製した。
（３）固定化用試料
上記で調製した各濃度の蛋白質試料夫々２０μＬと、固定化用試液３００μＬを混合したもの（ＳＤＳ終濃度０．１９Ｗ／Ｖ％、ＴＣＡ終濃度２．３４Ｗ／Ｖ％、エタノール終濃度４２．２Ｖ／Ｖ％）を調製し、固定化用試料とした。
（４）ブロッキング溶液
ブロックエース（雪印乳業（株）製）を終濃度２５％となるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈したものを用いた。
（５）抗体溶液
発光検出用抗体溶液：西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムバイオサイエンス製）をブロッキング溶液で１／１００００希釈したものを用いた。
発色検出用抗体溶液：アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（和光純薬工業（株）製）をブロッキング溶液で１／１０００希釈したものを用いた。
（６）洗浄液
Ｔｗｅｅｎ　２０を、終濃度０．０５％となるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈したものを用いた。
（７）検出試薬
発光検出用：ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｓｔａｒｔｅｒ　Ｋｉｔ（アマシャムハ゛イオサイエンス（株）製）
発色検出用：０．０３３％　ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ，和光純薬工業（株）製）、０．０１６５％　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ、和光純薬工業（株）製）／１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ９．５（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２含有）
【００７９】
［蛋白質の固定化および測定］
実施例１と同様の方法で、上記した如く調製した固定化用試料をＰＶＤＦ膜にアプライし、吸引濾過後、ＰＢＳ　（ｐＨ７．４）　３００μＬをアプライし、同様に吸引濾過を行った。ＰＶＤＦ膜を取り出し、ブロッキング溶液に浸し、ローテーションさせながら室温で１時間インキュベーションした（ブロッキング操作）。その後、発光検出用抗体溶液又は発色検出用抗体溶液に浸し、ローテーションさせながら室温１時間インキュベーションした（抗体反応）。抗体反応後の膜を洗浄液で５回洗浄した後、発光検出試薬又は発色検出試薬に浸し、検出反応を行った。発光検出は、ＰＶＤＦ膜を発光検出処理後、Ｘ線フィルム（アマシャムバイオサイエンス製）に感光させて検出を行った。
【００８０】
［結果］
結果を図８に示す。図８に於いて、ＡはＰＶＤＦ膜に固定化した蛋白質試料の免疫検出を発光反応により行い、Ｘ線フィルムに感光させ検出したものである。Ｂは、ＰＶＤＦ膜に固定化した蛋白質試料の免疫検出を発色反応により行い、検出したものである。また、各ドットは、蛋白質試料を各蛋白質量として固定化後に検出した場合の結果を夫々示す。
図８より明らかな如く、イムノブロッティングにより発光検出、発色検出した場合の何れも、膜に固定化したマウスＩｇＧを検出することができた。発光検出での検出限界は０．０６２５μｇ、発色検出での検出限界は０．５μｇであった。従って、本発明の蛋白質の固定化方法により固定化すれば、高感度の免疫検出（イムノブロッティングによる検出）が行い得ることが判った。
【００８１】
【発明の効果】
本発明に係る蛋白質固定化方法によれば、従来の固定化方法よりも充分に蛋白質を固相に固定化できる。また、従来の固定化方法では正確に行えなかった蛋白質の定量も行うことができる。更に、本発明に係る蛋白質固定化方法を用いれば、イムノブロッティングを行った際の感度も高くなるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において得られた、各固定化用試料中の蛋白質を固定化したポリビニリデンジフロライド膜（ＰＶＤＦ膜）をＰｙｒｏｍｏｌｅｘ試液で染色した後、６００ｎｍにおける吸光度（シグナル強度）を測定した結果を示す。
【図２】実施例２に於いて得られた、各固定化用試料中の蛋白質を固定化したＰＶＤＦ膜をＰｙｒｏｍｏｌｅｘ試液で染色した後、６００ｎｍにおける吸光度（シグナル強度）を測定した結果を示す。
【図３】実施例３に於いて得られた、各固定化用試料中の蛋白質を固定化したＰＶＤＦ膜をＰｙｒｏｍｏｌｅｘ試液で染色した後、６００ｎｍに於ける吸光度（シグナル強度）を測定した結果を示す。
【図４】実施例４に於いて得られた、各固定化用試料中の蛋白質を固定化したＰＶＤＦ膜をＰｙｒｏｍｏｌｅｘ試液で染色した後、６００ｎｍに於ける吸光度（シグナル強度）を測定した結果を示す。
【図５】実施例５に於いて得られた、蛋白質試料としてＯＶＡを用いて、ＰＶＤＦ膜に固定化、定量を行って得られた検量線を示す。
【図６】実施例６に於いて得られた、固相法により蛋白質を測定した結果又は液相法により蛋白質を測定した結果に基づいて得られた相対値を示す。
【図７】実施例７に於いて得られた、ＳＤＳを含有しないＩｇＧ試料又はＳＤＳ含有するＩｇＧ試料を蛋白質試料として用い、本発明に係る固定化、蛋白質の定量を行って得られた検量線を示す。
【図８】実施例１０に於いて得られた、イムノブロッティングの結果を示し、ＡはＰＶＤＦ膜に固定化した蛋白質試料の免疫検出を発光反応により行い、Ｘ線フィルムに感光させ検出したものである。Ｂは、ＰＶＤＦ膜に固定化した蛋白質試料の免疫検出を発色反応により行い、検出したものである。
【符号の説明】
【符号の説明】
図１に於いて、各バーは夫々下記固定化用試料を用いた場合の結果を示す。

図２に於いて、−△―はリソゾーム、−−−はチトクロームｃ、−○−はＩｇＧ、−◎−はフィブリノーゲン、−●−はＢＳＡ、−◆−はＯＶＡ、−◇−はトリプシンインヒビターを含有する蛋白質試料を用いた場合の結果を夫々示す。
図３に於いて、各バーは夫々下記固定化用試料を用いた場合の結果を示す。

図４に於いて、各バーは夫々下記固定化用試料を用いた場合の結果を示す。

図６に於いて、各バーは夫々下記の方法により各蛋白質を測定した結果に基づいて得られた、上記相対値を示す。

図７に於いて、−◆−はＳＤＳを含有しない蛋白質試料を用いた場合、−△−はＳＤＳを含有する蛋白質試料を用いた場合の結果を夫々示す。

Claims (19)

1. 低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩の共存下で、蛋白質を、疎水性表面を有する固相と接触させることを特徴とする、当該蛋白質の当該固相への固定化方法。
2. 低級アルコールとハロゲノカルボン酸と長鎖アルキル硫酸塩の共存下で、蛋白質を、疎水性表面を有する固相と接触させることを特徴とする、請求項１記載の固定化方法。
3. 低級アルコールがエタノール又はメタノールである、請求項１又は２記載の固定化方法。
4. ハロゲノカルボン酸がトリクロロ酢酸（以下、ＴＣＡと略記する。）又はトリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する。）である、請求項１〜３の何れかに記載の固定化方法。
5. 長鎖アルキル硫酸塩がドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略記する。）である、請求項１〜４の何れかに記載の固定化方法。
6. 蛋白質と疎水性表面を有する固相とを接触させる際の低級アルコール濃度が、３０〜５０　Ｖ／Ｖ％である、請求項１〜５の何れかに記載の固定化方法。
7. 蛋白質と疎水性表面を有する固相とを接触させる際のハロゲノカルボン酸濃度が、０．０８〜１０　Ｗ／Ｖ％である、請求項１〜６の何れかに記載の固定化方法。
8. 蛋白質と疎水性表面を有する固相とを接触させる際の長鎖アルキル硫酸塩濃度が、０．１〜１　Ｗ／Ｖ％である、請求項１〜７の何れかに記載の固定化方法。
9. 固相が疎水性膜である、請求項１〜８の何れかに記載の固定化方法。
10. 請求項１〜９の何れかの方法により蛋白質が固定化された固相に蛋白質染色液を接触させ、それにより生じた発色の程度に基づいて行うことを特徴とする、蛋白質の定量方法。
11. 請求項１〜９の何れかの方法により蛋白質が固定化された固相を用いることを特徴とする、イムノブロッティング方法。
12. 低級アルコールと、ハロゲノカルボン酸及び／又は長鎖アルキル硫酸塩とを含有する、蛋白質固定化用試液。
13. 低級アルコールとハロゲノカルボン酸と長鎖アルキル硫酸塩とを含有する、請求項１２記載の試液。
14. 低級アルコールがエタノール又はメタノールである、請求項１２又は１３に記載の試液。
15. ハロゲノカルボン酸がＴＣＡ又はＴＦＡである、請求項１１〜１４の何れかに記載の試液。
16. 長鎖アルキル硫酸塩がＳＤＳである、請求項１１〜１５の何れかに記載の試液。
17. 低級アルコール濃度が、３０〜５０　Ｖ／Ｖ％である、請求項１１〜１６の何れかに記載の試液。
18. ハロゲノカルボン酸濃度が、０．１〜１０　Ｗ／Ｖ％である、請求項１１〜１７の何れかに記載の試液。
19. 長鎖アルキル硫酸塩濃度が、０．１〜１　Ｗ／Ｖ％である、請求項１１〜１８の何れかに記載の試液。

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