JP5055507B2 - 試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬 - Google Patents

Description

本発明は、試料中に微量に含まれるタンパク質を非常に高感度に測定することができる測定方法及び測定試薬に関する。本発明は、分析化学、生命科学、及び医療の分野において有用であり、特に臨床検査分野において有用なものである。

血清又は血漿のタンパク質濃度は、脱水、網内系疾患又は慢性感染症等において高値となる。また、血漿タンパクの漏出、栄養不良又は肝機能障害等において低値となる。

このように血清又は血漿のタンパク質濃度は、各種疾患又は各種病態に伴って変化するので、その測定は疾患の診断及び治療において重視されている。

また、尿中のタンパク質は、腎疾患、心疾患、血液疾患、黄だん又は高熱等において出現する。

この尿中のタンパク質を測定することも、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。

また、タンパク質の一種であるアルブミンは、血液濃縮状態において血清又は血漿中の濃度が高値となる。そして、先天性無アルブミン血症、肝実質障害、栄養摂取不足、火傷、出血、ショック、タンパク漏出性胃腸炎、吸収不良症候群又は消耗性疾患等において血清又は血漿中の濃度が低値となる。
この血清又は血漿中のアルブミンを測定することは、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。

尿中のアルブミン（尿中微量アルブミン）の濃度は、健常者においては極めて微量なものであり、その基準参考値は６．５±５．１ｍｇ／Ｌ未満（随時尿）である。
この尿中のアルブミンは、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎の潜在期若しくは良性腎硬化症などの非糖尿病性腎疾患、尿路感染症、高血圧又はうっ血性心不全等において出現する。
そして、尿中のアルブミン（尿中微量アルブミン）を測定することは、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。

従来の総タンパク質の測定方法（並びに測定試薬、測定キット）としては、まず、タンパク質と結合するとその色調を変える色素を担体に含浸させた試験片を用いる方法がある。しかし、この試験片を用いる方法は、検出限界が１００〜２００ｍｇ／Ｌであり、試料中に微量に含まれるタンパク質を測定することができないものであった。また、この方法は、試料中の他の物質や非結合態色素の影響を受けて、測定誤差が生じる場合もあった。

また、タンパク質中の４個のペプチド結合がアルカリ溶液中で２価の銅イオンとキレート結合して紫色に発色する反応を利用するＢｉｕｒｅｔ法は、検出限界が１００ｍｇ／Ｌであり、測定の感度は低いものであった。

そして、やはり２価の銅イオンとフェノール試薬を用いるＬｏｗｒｙ法は、検出限界が２５ｍｇ／Ｌと、Ｂｉｕｒｅｔ法よりは感度は高いが、試料中の微量のタンパク質の測定には、いまだ感度は不充分なものであった。

また、ピロガロールレッド・モリブデン錯体が酸性条件下でタンパク質と結合することにより青紫色に変色する反応を利用するピロガロールレッド・モリブデン錯体発色法は、検出限界が２０ｍｇ／ＬとＬｏｗｒｙ法よりも感度は高いが、やはり試料中の微量のタンパク質の測定には感度は不充分であった。

上述したように従来の総タンパク質の測定方法、測定試薬及び測定キットは、検出限界が高く、すなわち測定の感度が低いものであり、試料中の微量のタンパク質の測定においては、感度は不充分なものであった。
従来のアルブミンの測定方法及び測定試薬としては、ブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）がクエン酸酸性下でアルブミンと結合し、青色を呈することを利用し、この発色による吸光度の増加を測定して試料中のアルブミン濃度を求めるＢＣＧ法が知られていた。
また、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）がアルブミンと結合し、青色を呈することを利用し、この発色による吸光度の増加を測定して試料中のアルブミン濃度を求めるＢＣＰ法も知られていた。

このＢＣＧ法及びＢＣＰ法は、多くの病院で使用されている汎用自動分析装置に適用でき、これにより簡便かつ短時間の内に測定を行うことができる方法であるが、尿中のアルブミンのように、試料中に極めて微量にしか存在しないアルブミンの測定においては、測定の感度は充分とは言えないものであった。
そこで、尿中のアルブミン（尿中微量アルブミン）の測定には、より高感度な放射免疫測定法、酵素免疫測定法、免疫比濁法又はラテックス凝集反応法等の免疫学的測定法を測定原理とする測定方法及び測定試薬が従来用いられてきた（測定感度：５〜３０ｍｇ／Ｌ）。
しかしながら、これらの免疫学的測定試薬は共通して、アルブミンに特異的に結合する抗体を動物等より調製し、それを原料とするため、測定試薬のコストが高いという難点があった。
更に、この抗体を動物等より調製するため、抗体のロットにより感度に差が生じることがあり、一定感度の測定試薬の提供が難しいということもあった。
また、これらの免疫学的測定法及び測定試薬には、汎用自動分析装置で測定を行うことができず専用の測定装置でないと測定が行えなかったり、測定に時間が掛かったり、又は測定操作が煩雑であるという難点を有するものもあった。

「臨床検査法提要」（改訂第３２版）、第１７１頁〜第１７７頁、金原出版、２００５年 「臨床検査法提要」（改訂第３２版）、第４７３頁〜第４８１頁、金原出版、２００５年

本発明の課題は、測定に掛かるコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬を提供することである。

本発明は、以下の発明を包含するものである。
（１） 試料、エリスロシンＢ及び界面活性剤を接触させ、この試料、エリスロシンＢ及び界面活性剤を含む混合液の吸光度を測定することからなる、試料中のタンパク質の測定方法。
（２） 試料及びエリスロシンＢを接触させた後、少なくともこの試料及びエリスロシンＢを含む混合液のｐＨをｐＨ５．０以下とすることを特徴とする前記（１）に記載の試料中のタンパク質の測定方法。
（３） 混合液のｐＨをｐＨ５．０以下とすることを、当該混合液に酸性溶液を添加することにより行うことを特徴とする前記（２）に記載の試料中のタンパク質の測定方法。
（４） 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤及び／又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の試料中のタンパク質の測定方法。
（５） 界面活性剤が、混合液中で当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の試料中のタンパク質の測定方法。
（６） タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の試料中のタンパク質の測定方法。
（７） エリスロシンＢ及び界面活性剤を含有する、試料中のタンパク質の測定試薬。
（８） 少なくともエリスロシンＢを含有する溶液からなる第１試薬と、酸性溶液からなる第２試薬との組み合わせよりなり、界面活性剤が当該第１試薬及び／又は当該第２試薬に添加されていることを特徴とする前記（７）に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
（９） 酸性溶液からなる第２試薬が、試料及び第１試薬を混合した混合液に当該第２試薬を添加することにより、当該混合液のｐＨをｐＨ５．０以下とすることができるものであることを特徴とする前記（８）に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
（１０） 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤及び／又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする前記（７）〜（９）のいずれか１つに記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
（１１） 界面活性剤が、混合液中において当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度となるような濃度に設定されていることを特徴とする前記（７）〜（１０）のいずれか１つに記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
（１２） タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする前記（７）〜（１１）のいずれか１つに記載の試料中のタンパク質の測定試薬。

本発明の試料中のタンパク質の測定方法は、測定に掛かるコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質を高感度に測定することができる、という効果を有するものである。

また、本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、そのコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質を高感度に測定することができる、という効果を有するものである。

〔Ｉ〕．試料中のタンパク質の測定方法
１．本発明の試料中のタンパク質の測定方法
本発明の試料中のタンパク質の測定方法は、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させ、この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の吸光度を測定することからなるものである。
２．試料
本発明における試料としては、タンパク質を含む可能性がある試料であれば特に限定されないが、例えば、ヒト若しくは動物に由来する試料、植物に由来する試料、微生物に由来する試料、食物、飲料、薬剤、試薬、又は環境試料等を挙げることができる。

ヒト若しくは動物に由来する試料は、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、若しくは羊水；脳、心臓、腎臓、若しくは肝臓などの臓器；毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織；又は細胞等を挙げることができる。

食物は、特に限定されず、例えば、食肉、野菜、穀物、果物、卵、水産物、又は加工食品等を挙げることができる。

飲料は、特に限定されず、例えば、ジュース、牛乳、茶、コーヒー、又は酒類等を挙げることができる。

薬剤は、特に限定されず、例えば、輸液、注射液、散剤、又は錠剤等を挙げることができる。

なお、測定に用いる試料の形態は、液体である必要があるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。

また、必要に応じて、希釈又は濃縮処理を行ってもよい。
３．タンパク質
本発明におけるタンパク質とは、試料中に含まれる（又は含まれる可能性のある）タンパク質であって、測定を行おうとするものである。

このタンパク質としては、種々のタンパク質が対象となり、例えば、総タンパク質やアルブミン等を挙げることができるが、本発明においては、このタンパク質が試料中に微量にしか存在しないタンパク質である場合に好適である。
この試料中に微量にしか存在しないタンパク質として、例えば、尿中のアルブミン（尿中微量アルブミン）やベンス・ジョンズタンパク等を挙げることができる。
特に、尿中のアルブミン（尿中微量アルブミン）の測定に好適である。
４．フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
本発明におけるフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物は、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性の化合物であれば、特に限定されずに用いることができる。

このフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物としては、例えば、キサンテン系色素等を挙げることができる。

このキサンテン系色素としては、例えば、エリスロシンＢ、エオシンＹ、エオシンＢ、フロキシンＢ又はローズベンガル等を挙げることができる。

フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物としては、エリスロシンＢが特に好ましい。

このフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物の濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中のタンパク質を測定することができないので、少なくとも試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液中の濃度で、０．１μＭ以上であることが好ましく、０．５μＭ以上であることがより好ましく、０．７μＭ以上であることが特に好ましい。

また、このフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物の濃度は、高すぎると試薬ブランク（試薬盲検）も高い値となってしまうということがあるので、少なくとも試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液中の濃度で、１，０００μＭ以下であることが好ましく、１００μＭ以下であることがより好ましく、５０μＭ以下であることが特に好ましい。
５．界面活性剤
本発明における界面活性剤は、界面活性剤であれば、特に限定されずに用いることができる。

この界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤を挙げることができる。

試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を、界面活性剤と接触させると、界面活性剤を接触させない場合に比べて、測定により得られる吸光度が高いものとなり、高感度化させることができる。

また、この界面活性剤との接触により、試薬ブランク（試薬盲検）の値（吸光度）が低減する。

この試料の測定により得られる吸光度が高くなること、及び試薬ブランク（試薬盲検）の値（吸光度）が低減することにより、測定により得られる吸光度差の値（試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの）は大きなものとなり、すなわち、より大きな吸光度差の値が得られることになるので、測定の感度は高いものとなり、高感度化が達成される。
よって、この界面活性剤との接触により、試料中の微量のタンパク質の測定が可能となる。

この界面活性剤との接触により、試料の測定において得られる吸光度が高くなることは、界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤と陽イオン性界面活性剤の混合物である場合に顕著である。

また、この界面活性剤との接触により、試薬ブランク（試薬盲検）の値（吸光度）が低減することは、界面活性剤が非イオン性界面活性剤である場合に顕著である。

よって、本発明においては、この界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤と陽イオン性界面活性剤の混合物であることがより好ましく、特に非イオン性界面活性剤が好ましい。

この界面活性剤の濃度は、低すぎると前記の界面活性剤と接触させることによる効果が充分に得られないので、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液中の濃度で、０．１μＭ以上であることが好ましく、２０μＭ以上であることがより好ましく、４０μＭ以上であることが特に好ましい。

なお、この界面活性剤の濃度は、高すぎると前記の界面活性剤と接触させることによる効果が却って弱まることがある。

これより、本発明において界面活性剤は、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液中における濃度が、当該界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の濃度であることが好ましい。
非イオン性界面活性剤及び陽イオン性界面活性剤の具体例として、その化合物名及びその臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）等を、「表１」、「表２」及び「表３」に示した。

本発明における界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤である「トライトンＸ−１００（Triton X-100）」〔ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル〕（臨界ミセル濃度：０．３５ｍＭ）及び「ツイーン２０（Tween 20）」〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル〕（臨界ミセル濃度：３．２ｍＭ；１８℃）、並びに陽イオン性界面活性剤である「ゼフィラミン（Zephiramine）」〔ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム塩酸塩〕（臨界ミセル濃度：０．３７ｍＭ）が特に好ましい。

例えば、このトライトンＸ−１００においては、前記混合液中における濃度が、臨界ミセル濃度である０．３５ｍＭ未満であることが好ましく、０．１５ｍＭ以下であることがより好ましく、０．１１ｍＭ以下であることが特に好ましい。
６．試料中のタンパク質の測定
本発明における試料中のタンパク質の測定について、以下説明を行う。
（１）試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤の接触
試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させることであるが、前記の試料、前記のフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び前記の界面活性剤を接触させることができれば、どのような方法でもよい。
この接触時のフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤のそれぞれの濃度については、前記の通りである。

この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させることは、１段階で行ってもよく、又は２段階以上の多段階により行ってもよい。

前記接触を１段階で行う場合は、試料と、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤の混合物（例えば測定試薬）を接触させる。

前記接触を２段階以上の多段階で行う場合、その順序として次のものを挙げることができる。
（ａ） 試料とフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに界面活性剤を接触させる。
（ｂ） 試料と界面活性剤を接触させ、次にこれにフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させる。
（ｃ） フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物と界面活性剤を接触させ、次にこれに試料を接触させる。

この、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤を接触させる時間であるが、３０秒間以上であることが好ましく、１分間以上であることがより好ましく、３分間以上であることが特に好ましい。
この、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤を接触させる温度であるが、特に限定はない。但し、６０℃以上であると、タンパク質が変性する可能性があるので、０〜５０℃が好ましく、５〜４５℃がより好ましく、１５〜４０℃が特に好ましい。
（２）ｐＨ
本発明においては、試料、及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下とすることが好ましい。

前記接触後に、前記混合液のｐＨをｐＨ５．０以下とすることにより、測定により得られる吸光度が更に高いものとなり、かつ試薬ブランク（試薬盲検）の値（吸光度）を低減させることができる。

この試料の測定により得られる吸光度が高くなり、かつ試薬ブランク（試薬盲検）の値（吸光度）が低減することにより、測定により得られる吸光度差の値（試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの）はより大きなものとなり、すなわち、より大きな吸光度差の値が得られることになり、高い測定の感度が得られるようになるので好ましい。

前記接触後に、前記混合液のｐＨをｐＨ５．０以下とすることが好ましいのであるが、このｐＨをｐＨ４．０以下とすることにより前記吸光度差の値を更に大きくすることができるのでより好ましく、同じ理由によりこのｐＨをｐＨ３．５以下とすることが特に好ましい。

なお、この試料、及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とすることは、これが達成できれば、どのような方法で行ってもよい。

例えば、少なくとも試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液に、酸性の溶液である酸性溶液を添加することより、当該混合液のｐＨをｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とさせてもよい。

なお、もちろん、この酸性溶液は、前記混合液に添加することにより、当該混合液のｐＨをｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とすることができるような、酸性物質含有量、ｐＨ又は添加量等のものでなければならない。

この酸性溶液としては、例えば、クエン酸水溶液、酢酸水溶液、塩酸水溶液、硝酸水溶液、又は硫酸水溶液等を挙げることができる。
この試料、及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とすることの順序として、本発明において次のものを挙げることができる。
（Ａ） 試料と、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤の混合物（例えば測定試薬）を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とする。
（Ｂ） 試料とフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに界面活性剤を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とする。
（Ｃ） 試料と界面活性剤を接触させ、次にこれにフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とする。
（Ｄ） フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物と界面活性剤を接触させ、次にこれに試料を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とする。
（Ｅ） 試料とフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とし、次にこの当該混合液に界面活性剤を接触させる。
（Ｆ） 試料とフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに界面活性剤を含む酸性溶液を添加し、当該混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下（より好ましくはｐＨ４．０以下、特に好ましくはｐＨ３．５以下）とする。
（３）吸光度測定
本発明の測定方法においては、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させ、この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の吸光度の測定を行い、試料中のタンパク質の濃度を求める。

この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の吸光度の測定であるが、当該混合液が有する吸収極大の波長又は近辺の波長において吸光度の測定を行う。

そして、この試料を測定したときの吸光度（測定値）を、測定を行うタンパク質の濃度が既知の試料（標準液、標準物質）を測定したときの吸光度（測定値）で除して、この標準液のタンパク質の濃度の値を乗じることにより、試料中に含まれていたタンパク質の濃度を算出することができる。

なお、前記の試料を測定したときの吸光度（測定値）、及び測定を行うタンパク質の濃度既知の試料（標準液、標準物質）を測定したときの吸光度（測定値）は、測定を行うタンパク質を全く含まない純水又は生理食塩水等を試料として測定を行い得られた試薬ブランク（試薬盲検）の吸光度を差し引いたものである。
（４）測定操作例
汎用自動分析装置により本発明の試料中のタンパク質の測定方法を実施する際の操作の一例を以下に示す。
〔１〕 フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンＢ、及び非イオン性界面活性剤であるトライトン Ｘ−１００を含有するタンパク質測定試薬の第１試薬と、クエン酸水溶液からなるタンパク質測定試薬の第２試薬とを各々、使用する汎用自動分析装置装置に適合した容器に入れる。
〔２〕 これらの試薬が入った容器の各々を、前記自動分析装置の所定の位置に置く。
〔３〕 また、タンパク質の測定を行う試料も前記自動分析装置に適合した容器に入れ、所定の位置に置く。
〔４〕 使用する測定試薬、及び測定を行おうとする試料等についての測定条件（測定パラメータ）等を前記自動分析装置に入力し、設定する。
〔５〕 そして、試料の測定を開始する。

通常は、試料と前記の測定試薬の第１試薬のそれぞれをピペット（プローブ）又はチューブ等で反応セル（反応キュベット）に分注し、混合、接触させ、第１段階の反応系を形成させて、温度一定の条件下に保ち、第１段階の反応を行わせる。
〔６〕 一定時間後（第１段階の反応の終了後）、この反応セル（反応キュベット）内の試料と測定試薬の第１試薬との反応液（第１段階の反応系）について、予め設定した波長における吸光度値を測定する。
〔７〕 次に、この反応セル（反応キュベット）内の反応液に、前記の測定試薬の第２試薬をピペット（プローブ）又はチューブ等で分注し、混合、接触させ、第２段階の反応系を形成させて、温度一定の条件下に保ち、第２段階の反応を行わせる。
〔８〕 一定時間後（第２段階の反応の終了後）、この反応セル（反応キュベット）内の試料と測定試薬の第１試薬及び第２試薬との反応液（第２段階の反応系）について、前記〔６〕の波長における吸光度値を測定する。
〔９〕 試料に替えて純水について、前記〔５〕〜〔８〕の操作を行い、試薬ブランク（試薬盲検）の吸光度値を測定する。
〔１０〕 前記〔８〕で得た吸光度値より試薬ブランク（試薬盲検）の吸光度値を差し引いたものから、前記〔６〕で得た吸光度値より試薬ブランク（試薬盲検）の吸光度値を差し引いたものを減じて、吸光度差の値を算出する。
〔１１〕 前記〔１０〕で算出した吸光度差の値と、測定を行うタンパク質の濃度が既知の試料（標準液）における吸光度差の値〔検量線〕とを比較することにより、試料中含まれていたタンパク質の濃度を算出して得る。
〔ＩＩ〕．試料中のタンパク質の測定試薬
１．本発明の試料中のタンパク質の測定試薬
本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含有するものである。
２．試料
本発明における試料は、前記の「〔Ｉ〕．試料中のタンパク質の測定方法」の「２．試料」において記載した通りである。
３．タンパク質
本発明におけるタンパク質は、前記の「〔Ｉ〕．試料中のタンパク質の測定方法」の「３．タンパク質」において記載した通りである。
４．フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
本発明におけるフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物は、前記の「〔Ｉ〕．試料中のタンパク質の測定方法」の「４．フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物」において記載した通りであるが、ここで記載した濃度が、試料に含まれていたタンパク質と、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物との接触時に当該混合液中において達成されるように、このフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を測定試薬に含有させることが好ましい。
５．界面活性剤
本発明における界面活性剤は、前記の「〔Ｉ〕．試料中のタンパク質の測定方法」の「５．界面活性剤」において記載した通りである。
この界面活性剤は、試料に含まれていたタンパク質及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物との接触時に、当該混合液中において当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度となるような濃度になるよう、この界面活性剤を測定試薬に含有させることが好ましい。
６．測定試薬の構成
（１）構成
本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、２試薬又は３試薬以上の構成からなることが好ましい。

特に２試薬からなることが好ましい。

前記測定試薬が第１試薬及び第２試薬の２試薬からなる場合、この２つの試薬にそれぞれ含まれる成分の構成として次のものを挙げることができる。
（ａ）第１試薬： フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
第２試薬： 界面活性剤
（ｂ）第１試薬： フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、界面活性剤
第２試薬： 界面活性剤
（ｃ）第１試薬： 界面活性剤
第２試薬： フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
（ｄ）第１試薬： 界面活性剤
第２試薬： フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、界面活性剤
（ｅ）第１試薬： フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤
第２試薬： 緩衝剤等
（ｆ）第１試薬： フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤
第２試薬： 界面活性剤、緩衝剤等
（２）酸性溶液
本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、少なくともフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含有する溶液からなる第１試薬と、酸性溶液からなる第２試薬との組み合わせよりなり、界面活性剤が当該第１試薬及び／又は当該第２試薬に添加されているものであることが好ましい。

なお、前記の酸性溶液からなる第２試薬は、試料及び第１試薬を混合した混合液に当該第２試薬を添加することにより、当該混合液のｐＨをｐＨ５．０以下とすることができるものである。
この酸性溶液及びｐＨについての詳細は、前記の「〔Ｉ〕．試料中のタンパク質の測定方法」の「６．試料中のタンパク質の測定」の「（２）ｐＨ」において記載した通りである。
なお、本発明の試料中のタンパク質の測定試薬が、少なくともフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含有する溶液からなる第１試薬と、酸性溶液からなる第２試薬との組み合わせよりなる場合、この２つの試薬にそれぞれ含まれる成分の構成として次のものを挙げることができる。
（Ａ）第１試薬： フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤
第２試薬： 酸性溶液
（Ｂ）第１試薬： フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤
第２試薬： 界面活性剤を含む酸性溶液
（Ｃ）第１試薬： フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
第２試薬： 界面活性剤を含む酸性溶液
７．他の成分
本発明の試料中のタンパク質の測定試薬においては、必要に応じて、更に、緩衝剤、アルカリ金属若しくはアルカリ土類金属などのイオン又はこれを含む塩；キレート剤；アジ化ナトリウム、抗生物質若しくは合成抗菌剤などの防腐剤；糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤；活性化剤；試料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響抑制に関わる物質；又は他の試薬成分等を適宜必要に応じて存在させることができる。

そして、前記の緩衝剤としては、測定上必要なｐＨの範囲に緩衝能を有する緩衝剤を存在させることが好ましい。

このような緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、無機リン酸、無機リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこの実施例の記載により限定されるものではない。
〔実施例１〕（本発明の測定方法及び測定試薬における界面活性剤の効果の確認）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、界面活性剤の効果を確認した。
１．試薬
（１）第１試薬
第１試薬として、エリスロシンＢ（和光純薬工業社）を純水に溶解し、１０２μＭ エリスロシンＢ水溶液を調製した。
（２）第２試薬
第２試薬として、クエン酸（和光純薬工業社）を純水に溶解し、５００ｍＭ クエン酸水溶液を調製した。
（３）第３試薬
第３試薬として、下記の試薬を各々調製した。
（ａ）界面活性剤不含試薬
界面活性剤を含まない界面活性剤不含試薬として、純水を用意した。
（ｂ）トライトンＸ−１００試薬
トライトンＸ−１００試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、６．４ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（ｃ）ツイーン２０試薬
ツイーン２０試薬として、ツイーン２０を純水に溶解し、０．４ｍＭ ツイーン２０水溶液を調製した。
（ｄ）ゼフィラミン試薬
ゼフィラミン試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、４ｍＭ ゼフィラミン水溶液を調製した。
２．試料
（イ）タンパク質含有試料
タンパク質を含むタンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、２．０ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ロ）タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
３．測定
（１） 前記２の（イ）のタンパク質含有試料の３，６６０μＬに、前記１の（１）の第１試薬を８０μＬ、前記１の（２）の第２試薬を１６０μＬ、及び前記１の（３）の第３試薬の（ａ）の界面活性剤不含試薬を１００μＬ添加し、混合し、混合液とした。
（２） 次に、前記（１）の混合液を、分光光度計により、波長を４００ｎｍから７００ｎｍまでスキャンして吸光度を測定し、前記混合液の吸収曲線を記録した。
（３） 前記２の（イ）のタンパク質含有試料に替えて前記２の（ロ）のタンパク質不含試料を試料とする他は前記（１）及び（２）の記載の通りに操作を行い、吸収曲線を記録した。

試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸収曲線、及び試料としてタンパク質不含試料を用いた場合の前記吸収曲線を、図１に示した。
（４） 前記１の（３）の第２試薬の（ａ）の界面活性剤不含試薬に替えて、前記１の（３）の第２試薬の（ｂ）のトライトンＸ−１００試薬を第２試薬とする他は、前記（１）、（２）及び（３）の記載の通りに操作を行い、試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸収曲線、及び試料としてタンパク質不含試料を用いた場合の前記吸収曲線を示した図２を得た。
（５） 前記１の（３）の第２試薬の（ａ）の界面活性剤不含試薬に替えて、前記１の（３）の第２試薬の（ｃ）のツイーン２０試薬を第２試薬とする他は、前記（１）、（２）及び（３）の記載の通りに操作を行い、試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸収曲線、及び試料としてタンパク質不含試料を用いた場合の前記吸収曲線を示した図３を得た。
（６） 前記１の（３）の第２試薬の（ａ）の界面活性剤不含試薬に替えて、前記１の（３）の第２試薬の（ｄ）のゼフィラミン試薬を第２試薬とする他は、前記（１）、（２）及び（３）の記載の通りに操作を行い、試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸収曲線、及び試料としてタンパク質不含試料を用いた場合の前記吸収曲線を示した図４を得た。
４．測定結果
（１） 図１及び図２より、以下のことが分かる。

非イオン性界面活性剤であるトライトンＸ−１００を測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンＢ及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が著しく高くなっている。

また、このトライトンＸ−１００を測定試薬に含有させ、エリスロシンＢ及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク（試薬盲検）〕の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が顕著に低減している。

これらのことより、非イオン性界面活性剤であるトライトンＸ−１００を測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンＢ及び試料と接触させた場合には、測定により得られる吸光度差の値（試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの）がより大きなものとなり、高い測定の感度が得られるようになったことが確かめられた。
（２） 図１及び図３より、以下のことが分かる。

非イオン性界面活性剤であるツイーン２０を測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンＢ及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が著しく高くなっている。

また、このツイーン２０を測定試薬に含有させ、エリスロシンＢ及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク（試薬盲検）〕の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が明らかに低減している。

これらのことより、非イオン性界面活性剤であるツイーン２０を測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンＢ及び試料と接触させた場合には、測定により得られる吸光度差の値（試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの）がより大きなものとなり、高い測定の感度が得られるようになったことが確かめられた。
（３） 図１及び図４より、以下のことが分かる。

陽イオン性界面活性剤であるゼフィラミンを測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンＢ及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が著しく高くなっている。

なお、このゼフィラミンを測定試薬に含有させ、エリスロシンＢ及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク（試薬盲検）〕の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度は高くなっている。

しかしながら、この場合でも、測定により得られる吸光度差の値（試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの）は、測定試薬にゼフィラミンを含有させ接触させたときの方が、測定試薬に含有させず接触させない場合よりも、より大きなものとなり、この場合も、高い測定の感度が得られるようになったことが確かめられた。
〔実施例２〕（本発明の測定方法及び測定試薬における界面活性剤の濃度と効果の関係の確認）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、界面活性剤であるトライトンＸ−１００の濃度と効果の関係を確認した。
１．試薬
（１）第１試薬
第１試薬として、エリスロシンＢ（和光純薬工業社）を純水に溶解し、１０２μＭ エリスロシンＢ水溶液を調製した。
（２）第２試薬
第２試薬として、クエン酸（和光純薬工業社）を純水に溶解し、５００ｍＭ クエン酸水溶液を調製した。
（３）第３試薬
第３試薬として、下記の試薬を各々調製した。
（ａ）界面活性剤不含試薬
界面活性剤を含まない界面活性剤不含試薬として、純水を用意した。
（ｂ）トライトンＸ−１００試薬
（イ）１．６ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
１．６ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、１．６ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（ロ）３．２ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
３．２ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、３．２ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（ハ）４．８ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
４．８ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、４．８ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（ニ）６．４ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
６．４ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、６．４ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（ホ）８ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
８ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、８ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（ヘ）９．６ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
９．６ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、９．６ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（ト）１２．８ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
１２．８ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、１２．８ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（チ）１６ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
１６ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、１６ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（リ）１９．２ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
１９．２ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、１９．２ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（ヌ）２５．６ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
２５．６ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、２５．６ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
（ル）３２ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬
３２ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、３２ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
２．試料
（イ）タンパク質含有試料
タンパク質を含むタンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、１．５ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ロ）タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
３．測定
（１） 前記２の（イ）のタンパク質含有試料の３，６６０μＬに、前記１の（１）の第１試薬を８０μＬ、前記１の（２）の第２試薬を１６０μＬ、及び前記１の（３）の第３試薬の（ａ）の界面活性剤不含試薬を１００μＬ添加し、混合し、混合液とした。
（２） 次に、前記（１）の混合液を、分光光度計により、波長５４７ｎｍにおける吸光度を測定した。
（３） 前記２の（イ）のタンパク質含有試料に替えて前記２の（ロ）のタンパク質不含試料を試料とする他は、前記（１）及び（２）の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
（４） 次に、前記１の（３）の第３試薬の（ａ）の界面活性剤不含試薬に替えて、前記１の（３）の第３試薬の（ｂ）トライトンＸ−１００試薬の（イ）１．６ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬〜（ル）３２ｍＭ トライトンＸ−１００含有試薬の計１１種類の第３試薬をそれぞれ用いる他は、前記（１）、（２）及び（３）の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
（５） 前記（１）〜（４）における各第３試薬を用いた場合の、タンパク質含有試料を測定したときの吸光度、及びタンパク質不含試料を測定したときの吸光度を、図５に示した。
４．測定結果
この図５より、以下のことが分かる。

試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物（エリスロシンＢ）及び界面活性剤（トライトンＸ−１００）を含む混合液中で、界面活性剤（トライトンＸ−１００）の濃度が、この界面活性剤（トライトンＸ−１００）の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）である０．３５ｍＭ以上においては、濃度が０．３５ｍＭ未満のときに比べて、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸光度が低減しており、またタンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク（試薬盲検）〕の吸光度が増加している。
すなわち、前記混合液中における界面活性剤（トライトンＸ−１００）の濃度が、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）である０．３５ｍＭ以上においては、濃度が０．３５ｍＭ未満のときに比べて、測定により得られる吸光度差の値（試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの）がより小さくなり、測定の感度が減少し、界面活性剤（トライトンＸ−１００）を含有及び接触させることの効果が弱まっていることが分かる。
このことより、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤（トライトンＸ−１００）を含む混合液中での界面活性剤（トライトンＸ−１００）の濃度は、この界面活性剤（トライトンＸ−１００）の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の濃度であることが好ましいことが分かる。
〔実施例３〕（本発明の測定方法及び測定試薬における界面活性剤の濃度と効果の関係の確認）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、界面活性剤であるゼフィラミンの濃度と効果の関係を確認した。
１．試薬
（１）第１試薬
第１試薬として、エリスロシンＢ（和光純薬工業社）を純水に溶解し、１０２μＭ エリスロシンＢ水溶液を調製した。
（２）第２試薬
第２試薬として、クエン酸（和光純薬工業社）を純水に溶解し、５００ｍＭ クエン酸水溶液を調製した。
（３）第３試薬
第３試薬として、下記の試薬を各々調製した。
（ａ）界面活性剤不含試薬
界面活性剤を含まない界面活性剤不含試薬として、純水を用意した。
（ｂ）ゼフィラミン試薬
（イ）４ｍＭ ゼフィラミン含有試薬
４ｍＭ ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、４ｍＭ ゼフィラミン水溶液を調製した。
（ロ）８ｍＭ ゼフィラミン含有試薬
８ｍＭ ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、８ｍＭ ゼフィラミン水溶液を調製した。
（ハ）１５ｍＭ ゼフィラミン含有試薬
１５ｍＭ ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、１５ｍＭ ゼフィラミン水溶液を調製した。
（ニ）２０ｍＭ ゼフィラミン含有試薬
２０ｍＭ ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、２０ｍＭ ゼフィラミン水溶液を調製した。
（ホ）３０ｍＭ ゼフィラミン含有試薬
３０ｍＭ ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、３０ｍＭ ゼフィラミン水溶液を調製した。
２．試料
（イ）タンパク質含有試料
タンパク質を含むタンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、２．０ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ロ）タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
３．測定
（１） 前記２の（イ）のタンパク質含有試料の３，６６０μＬに、前記１の（１）の第１試薬を８０μＬ、前記１の（２）の第２試薬を１６０μＬ、及び前記１の（３）の第３試薬の（ａ）の界面活性剤不含試薬を１００μＬ添加し、混合し、混合液とした。
（２） 次に、前記（１）の混合液を、分光光度計により、波長５４７ｎｍにおける吸光度を測定した。
（３） 前記２の（イ）のタンパク質含有試料に替えて前記２の（ロ）のタンパク質不含試料を試料とする他は、前記（１）及び（２）の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
（４） 次に、前記１の（３）の第３試薬の（ａ）の界面活性剤不含試薬に替えて、前記１の（３）の第３試薬の（ｂ）ゼフィラミン試薬の（イ）４ｍＭ ゼフィラミン含有試薬〜（ホ）３０ｍＭ ゼフィラミン含有試薬の計５種類の第３試薬をそれぞれ用いる他は、前記（１）、（２）及び（３）の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
（５） 前記（１）〜（４）における各第３試薬を用いた場合の、タンパク質含有試料を測定したときの吸光度、及びタンパク質不含試料を測定したときの吸光度を、図６に示した。
４．測定結果
この図６より、以下のことが分かる。

試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物（エリスロシンＢ）及び界面活性剤（ゼフィラミン）を含む混合液中で、界面活性剤（ゼフィラミン）の濃度が増すと、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸光度、及びタンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク（試薬盲検）〕の吸光度はともに増加する。

しかしながら、測定により得られる吸光度差の値（試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの）、すなわち測定の感度は、この界面活性剤（ゼフィラミン）の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）である０．３７ｍＭ以上においては、濃度が０．３７ｍＭ未満のときに比べて、より小さくなっている。
このことより、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤（ゼフィラミン）を含む混合液中での界面活性剤（ゼフィラミン）の濃度は、この界面活性剤（ゼフィラミン）の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の濃度であることがより好ましいことが分かる。
〔実施例４〕（本発明の測定方法及び測定試薬における効果とｐＨとの関係の確認）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における効果と、ｐＨとの関係を確認した。
１．試薬
（１）第１試薬
第１試薬として、エリスロシンＢ（和光純薬工業社）を純水に溶解し、１０２μＭ エリスロシンＢ水溶液を調製した。
（２）第２試薬
第２試薬として、下記の試薬を各々調製した。
（ａ）クエン酸不含試薬
クエン酸を含まないクエン酸不含試薬として、純水を用意した。
（ｂ）１２５ｍＭ クエン酸含有試薬
１２５ｍＭ クエン酸含有試薬として、クエン酸（和光純薬工業社）を純水に溶解し、１２５ｍＭ クエン酸水溶液を調製した。
（ｃ）５００ｍＭ クエン酸含有試薬
５００ｍＭ クエン酸含有試薬として、クエン酸（和光純薬工業社）を純水に溶解し、５００ｍＭ クエン酸水溶液を調製した。
（ｄ）２，５００ｍＭ クエン酸含有試薬
２，５００ｍＭ クエン酸含有試薬として、クエン酸（和光純薬工業社）を純水に溶解し、２，５００ｍＭ クエン酸水溶液を調製した。
（３）第３試薬
第３試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、６．４ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
２．試料
（イ）タンパク質含有試料
タンパク質を含むタンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、１．５ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ロ）タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
３．測定
（１） 前記２の（イ）のタンパク質含有試料の３，６６０μＬに、前記１の（１）の第１試薬を８０μＬ、前記１の（２）の第２試薬の（ａ）クエン酸不含試薬を１６０μＬ、及び前記１の（３）の第３試薬を１００μＬ添加し、混合し、混合液とした。
（２） 次に、前記（１）の混合液を、分光光度計により、波長５４７ｎｍにおける吸光度を測定した。
（３） 前記２の（イ）のタンパク質含有試料に替えて前記２の（ロ）のタンパク質不含試料を試料とする他は、前記（１）及び（２）の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
（４） 次に、前記１の（２）の第２試薬の（ａ）のクエン酸不含試薬に替えて、前記１の（２）の第２試薬の（ｂ）１２５ｍＭ クエン酸含有試薬〜（ｄ）２，５００ｍＭ クエン酸含有試薬の計３種類の第２試薬をそれぞれ用いる他は、前記（１）、（２）及び（３）の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
（５） なお、前記１の（２）の各第２試薬を用いたときの、試料、第１試薬、第２試薬及び第３試薬を混合した混合液のｐＨは、以下の通りであった。
（ａ）クエン酸不含試薬： ｐＨ５．３
（ｂ）１２５ｍＭ クエン酸含有試薬： ｐＨ３．５
（ｃ）５００ｍＭ クエン酸含有試薬： ｐＨ２．３
（ｄ）２，５００ｍＭ クエン酸含有試薬： ｐＨ２．０
（６） 前記（１）〜（４）における各第２試薬を用いた場合の、タンパク質含有試料を測定したときの吸光度、及びタンパク質不含試料を測定したときの吸光度を、図７に示した。
４．測定結果
この図７より、以下のことが分かる。

試料、第１試薬、第２試薬及び第３試薬を混合した混合液中、すなわち試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物（エリスロシンＢ）及び界面活性剤（トライトンＸ−１００）を含む混合液中で、ｐＨが５．３の場合は、測定により得られる吸光度差の値（試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの）は小さいものであり、測定の感度は高くはない。

しかしながら、前記混合液中のｐＨが、ｐＨ５．０、ｐＨ４．０、ｐＨ３．５と下がるにつれ、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸光度は増加し、かつタンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク（試薬盲検）〕の吸光度は低減している。

この試料の測定により得られる吸光度が高くなり、かつ試薬ブランク（試薬盲検）の値（吸光度）が低減することにより、測定により得られる吸光度差の値（試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの）はより大きなものとなり、すなわち、より大きな吸光度差の値が得られることになり、高い測定の感度が得られるようになる。
よって、本発明においては、試料、及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のｐＨを、ｐＨ５．０以下とすることが好ましく、ｐＨ４．０以下とすることがより好ましく、ｐＨ３．５以下とすることが特に好ましいことが分かる。
〔実施例５〕（本発明の測定方法及び測定試薬における検量線の作成）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における検量線を作成した。
１．試薬
（１）第１試薬
第１試薬として、エリスロシンＢ（和光純薬工業社）を純水に溶解し、１０２μＭ エリスロシンＢ水溶液を調製した。
（２）第２試薬
第２試薬として、クエン酸（和光純薬工業社）を純水に溶解し、５００ｍＭ クエン酸水溶液を調製した。
（３）第３試薬
第３試薬として、トライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕を純水に溶解し、６．４ｍＭ トライトンＸ−１００水溶液を調製した。
２．試料
（イ）０．２５ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料
０．２５ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、０．２５ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ロ）０．５０ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料
０．５０ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、０．５０ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ハ）０．７５ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料
０．７５ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、０．７５ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ニ）１．００ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料
１．００ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、１．００ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ホ）１．５０ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料
１．５０ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、１．５０ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ヘ）２．００ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料
２．００ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、２．００ｍｇ／Ｌのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
（ト）タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
３．測定
（１） 前記２の（イ）の０．２５ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料の３，６６０μＬに、前記１の（１）の第１試薬を８０μＬ、前記１の（２）の第２試薬を１６０μＬ、及び前記１の（３）の第３試薬を１００μＬ添加し、混合し、混合液とした。
（２） 次に、前記（１）の混合液を、分光光度計により、波長５４７ｎｍにおける吸光度を測定した。
（３） 前記２の（イ）の０．２５ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料に替えて前記２の（ロ）０．５０ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料〜（ヘ）２．００ｍｇ／Ｌ タンパク質含有試料及び（ト）タンパク質不含試料をそれぞれ試料とする他は、前記（１）及び（２）の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
（４） 前記（１）〜（３）において、各試料を測定したときの吸光度と、その試料中のタンパク質であるヒト血清アルブミンの濃度との関係を示した図である検量線を図８に示した。
４．測定結果
この検量線を示した図８より、試料中のヒト血清アルブミンの濃度が０ｍｇ／Ｌから１．５ｍｇ／Ｌという極めて微量な範囲においても、良好な直線性が得られていることが分かる。

このことより、その基準範囲が６．５±５．１ｍｇ／Ｌ未満（随時尿）という極めて微量な尿中のアルブミン（尿中微量アルブミン）についても、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬であれは、精確に測定することが可能であることが分かる。
〔実施例６〕（本発明の測定方法及び測定試薬並びに他法の検出限界及び定量限界）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬、並びに他法の検出限界及び定量限界を確かめた。
〔Ｉ〕．本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬
１．試薬
（１）第１試薬
第１試薬として、エリスロシンＢ（和光純薬工業社）、及びトライトンＸ−１００（ナカライテスク社）〔分子量：６２５〕をそれぞれ純水に溶解し、１０２μＭ エリスロシンＢ及び０．３７３ｍＭ トライトンＸ−１００を含む水溶液を調製した。
（２）第２試薬
第２試薬として、クエン酸（和光純薬工業社）を純水に溶解し、５００ｍＭ クエン酸水溶液を調製した。
２．試料
（イ） ヒト血清アルブミン〔ＨＳＡ〕（シグマ社）を純水に溶解し、これを純水で段階的に希釈して、ヒト血清アルブミン水溶液の希釈系列を用意した。
（ロ） タンパク質不含試料として、純水を用意した。
（ハ） 標準液として、濃度既知のヒト血清アルブミン水溶液を用意した。
３．測定
（１） 前記２の（イ）の各濃度のヒト血清アルブミン水溶液試料の５０μＬに、前記１の（１）の第１試薬を１５０μＬ、及び前記１の（２）の第２試薬を１５０μＬ添加し、混合し、混合液とした。
（２） 次に、前記（１）の混合液の波長５４７ｎｍにおける吸光度を測定した。
（３） 次に、前記（ロ）のタンパク質不含試料について、前記（１）及び（２）の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した（試薬ブランク）。
（４） 次に、前記（ハ）の標準液について、前記（１）及び（２）の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
（５） 前記２の（イ）の各濃度のヒト血清アルブミン水溶液試料のそれぞれについて、測定により得られた吸光度から、前記（３）で得られたタンパク質不含試料における吸光度（試薬ブランク）を差し引いた。

次に、この吸光度を、前記（４）で求めた標準液の吸光度で除し、次にこの標準液のヒト血清アルブミン濃度を乗ずることにより、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の濃度を求めた。
（６） 前記（１）〜（５）の操作を計１２回繰り返して行い、各ヒト血清アルブミン水溶液試料について、計１２の測定値（濃度）を求めた。
〔ＩＩ〕．免疫比濁法
１．試薬
免疫比濁法による尿試料中のアルブミン（微量アルブミン）の測定試薬である「マイクロアルブミン−ＨＡテスト」（和光純薬工業）を用いた。
２．試料
前記〔Ｉ〕の２の試料を使用した。
３．測定
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を使用し、当該試薬の添付文書等で指定された方法に従って、前記２の試料の測定を行い、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の濃度を求めた。

なお、前記の各試料の測定は１２重測定を行った。
〔ＩＩ〕．ＰＲ法
１．試薬
ＰＲ法による試料中のタンパク質の測定試薬である「プロテインアッセイラピッドキット」（和光純薬工業）を用いた。
２．試料
前記〔Ｉ〕の２の試料を使用した。
３．測定
当該試薬の添付文書等で指定された方法に準じ、マイクロプレート法により、前記２の試料の測定を行い、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の濃度を求めた。

なお、前記の各試料の測定は１２重測定を行った。
〔ＩＩＩ〕．ＳＳＡ法
１．試薬
ＳＳＡ法による試料中のタンパク質の測定試薬である「スルホサリチル酸」（和光純薬工業）を用いた。
２．試料
前記〔Ｉ〕の２の試料を使用した。
３．測定
当該試薬の添付文書等で指定された方法に準じ、マイクロプレート法により、前記２の試料の測定を行い、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の濃度を求めた。なお、当該試薬は検量線の範囲が狭いため、前記試料を２〜１０倍純水で希釈して測定した。

この前記の各試料の測定は１２重測定を行った。
〔ＩＶ〕．検出限界及び定量限界
前記〔Ｉ〕の本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬、前記〔ＩＩ〕の免疫比濁法、前記〔ＩＩＩ〕のＰＲ法、並びに前記〔ＩＶ〕のＳＳＡ法のそれぞれにおける、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の１２重測定の測定値より標準偏差を算出し、検出限界（３σ）及び定量限界（１０σ）を求めた。

これを、表４に示した。

４．測定結果
この表４より、本発明の試料中のタンパク質の測定試薬及び測定方法における検出限界及び定量限界は、他法のＰＲ法及びＳＳＡ法の検出限界及び定量限界よりもはるかに優れ、免疫比濁法の検出限界及び定量限界にも勝るものであることが分かる。

このことよりも、本発明の試料中のタンパク質の測定試薬及び測定方法は、その測定に掛かるコストが低いものでありながら、免疫比濁法に勝る測定の感度を有し、尿試料中のアルブミンのような試料中に微量にしか存在しないタンパク質を、精確に測定することができるものであることが確かめられた。

本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬において、界面活性剤を接触、含有させないときの吸収曲線を示した図である。 本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬において、非イオン性界面活性剤であるトライトンＸ−１００を接触、含有させたときの吸収曲線を示した図である。 本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬において、非イオン性界面活性剤であるツイーン２０を接触、含有させたときの吸収曲線を示した図である。 本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬において、陽イオン性界面活性剤であるゼフィラミンを接触、含有させたときの吸収曲線を示した図である。 本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、非イオン性界面活性剤であるトライトンＸ−１００の濃度とその効果との関係を示した図である。 本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、陽イオン性界面活性剤であるゼフィラミンの濃度とその効果との関係を示した図である。 本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、効果とｐＨとの関係を示した図である。 本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、検量線を示した図である。

Claims (12)

1. 試料、エリスロシンＢ及び界面活性剤を接触させ、この試料、エリスロシンＢ及び界面活性剤を含む混合液の吸光度を測定することからなる、試料中のタンパク質の測定方法。
2. 試料及びエリスロシンＢを接触させた後、少なくともこの試料及びエリスロシンＢを含む混合液のｐＨをｐＨ５．０以下とすることを特徴とする請求項１記載の試料中のタンパク質の測定方法。
3. 混合液のｐＨをｐＨ５．０以下とすることを、当該混合液に酸性溶液を添加することにより行うことを特徴とする請求項２記載の試料中のタンパク質の測定方法。
4. 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤及び／又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の試料中のタンパク質の測定方法。
5. 界面活性剤が、混合液中で当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の試料中のタンパク質の測定方法。
6. タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の試料中のタンパク質の測定方法。
7. エリスロシンＢ及び界面活性剤を含有する、試料中のタンパク質の測定試薬。
8. 少なくともエリスロシンＢを含有する溶液からなる第１試薬と、酸性溶液からなる第２試薬との組み合わせよりなり、界面活性剤が当該第１試薬及び／又は当該第２試薬に添加されていることを特徴とする請求項７記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
9. 酸性溶液からなる第２試薬が、試料及び第１試薬を混合した混合液に当該第２試薬を添加することにより、当該混合液のｐＨをｐＨ５．０以下とすることができるものであることを特徴とする請求項８記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
10. 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤及び／又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
11. 界面活性剤が、混合液中において当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度となるような濃度に設定されていることを特徴とする請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
12. タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする請求項７〜請求項１１のいずれか１項に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。

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