JP2632989B2

JP2632989B2 - 不飽和鉄結合能の測定方法

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Publication number: JP2632989B2
Application number: JP32276188A
Authority: JP
Inventors: 由紀乃神田; 秀敏田代; 正光高橋
Original assignee: KOKUSAI SHAKU KK
Current assignee: KOKUSAI SHAKU KK
Priority date: 1988-12-21
Filing date: 1988-12-21
Publication date: 1997-07-23
Anticipated expiration: 2012-07-23
Also published as: JPH02167476A

Description

【発明の詳細な説明】＜産業上の利用分野＞本発明は不飽和鉄結合能の測定方法に関し、さらに詳
細には、臨床検査の分野等での使用を目的とする血清中
の不飽和鉄結合能の測定方法に関する。

＜従来の技術及び発明が解決しようとする課題＞生体内の鉄総量は約4gといわれ、そのうち約2/3は血
液中に、残りの約1/3は肝臓、脾臓、骨髄等に貯蔵鉄と
して存在する。血液中の鉄の大半は赤血球ヘモグロビン
構成因子であり、血清中の鉄は極微量である。血清中の
鉄は全て血清蛋白のβ_１−グロブリンに属するトランス
フェリンと結合した血清鉄として存在し、血清鉄は骨髄
の赤芽球での造血に利用される。血清中のトランスフェ
リンは組織の鉄貯蔵部より骨髄の赤芽球への鉄の運搬体
としての機能を果たし、健常人ではトランスフェリンの
約1/3が血清鉄として鉄と結合しているのみで、残りは
不飽和の状態である。この不飽和トランスフェリンに結
合しうる鉄量は不飽和鉄結合能と称され、血清鉄と不飽
和鉄結合能の和は総鉄結合能と称されている。総鉄結合
能、血清鉄及び不飽和鉄結合能は、赤血球の生成や崩壊
と密接な関係を有し造血機能を反映すると共にトランス
フェリンを生成する肝臓の疾患や鉄貯蔵部における疾患
とも関係するので、これらの測定は臨床上重要視され、
例えば、鉄欠乏性貧血、慢性出血性貧血、真性多血症等
においては不飽和鉄結合能の上昇が、再生不良性貧血、
悪性腫瘍、慢性感染症等では不飽和鉄結合能の低下が認
められる。

このように不飽和鉄結合能の測定は臨床上重要な意義
を有するので、従来、その測定方法として種々の方法が
提案されている。例えば、血清に過剰の鉄溶液を加えた
後、トランスフェリンと結合しなかった余分の鉄を、炭
酸マグネシウムに吸着させ遠心分離により除去し、上清
中のトランスフェリン結合鉄を測定して総鉄結合能を求
め、別途測定した血清鉄との差から不飽和鉄結合能を求
める方法（以下、炭酸マグネシウム法という）が知られ
ているが、この方法では液層との分離に困難をきたすこ
とがあり、操作も煩雑である。また炭酸マグネシウムの
代りにイオン交換樹脂を用いる方法も知られている。こ
の方法によれば、液層との分離は簡便であるが、イオン
交換樹脂は活性度が一定せず、鉄除去能と添加量との関
係も不安定であるという問題がある。

また、不飽和鉄結合能の国際標準測定法は、⁵⁹Feを用
いるラジオアッセイ法であるが、この方法は放射性物質
を用いるため特別な設備を必要とし且つ試薬も高価とな
る。

このような問題から、現在広く用いられている方法
は、血清に塩基性緩衝液及び過剰の鉄溶液（例えば、ア
スコルビン酸等の還元剤を含有する硫酸第一鉄アンモニ
ウム溶液）を加え、トランスフェリンと結合し切れなか
った遊離の鉄量をバソフェナンスロリンスルホン酸、ク
ロマズロール等の鉄発色試薬で発色させて測定する方法
（Schade法）である。またこの方法において、使用され
る鉄溶液の安定性を向上させるため、ニトリロ三酢酸を
添加する方法も知られている（特公昭52−9160号公報参
照）。上記のShade法及びその改良法によれば、遠心分
離操作や除蛋白操作が不要となるので、簡便な操作にて
測定することができるが、上記方法は、測定感度が低
いので、臨床検査の分野で用いる測定法としては比較的
多量の試料（血清）を必要とする；発色に少なくとも
10分を要するので、測定時間が長くなり、迅速に処理す
ることができないという問題がある。特に、現今の臨床
検査の分野では多数の検体を短時間に処理することが要
求され、そのために自動分析装置が広く用いられている
が、上記の従来法は、感度、測定時間の問題から自動化
には適合し難いという問題がある。

本発明は、上記従来技術の欠点を解消すべく創案され
たもので、迅速且つ高精度で不飽和鉄結合能が測定で
き、特に自動分析化に適した不飽和鉄結合能の測定方法
を提供することを目的とする。

＜課題を解決するための手段及び作用＞上記の課題を解決すべくなされた、本発明の不飽和鉄
結合能の測定方法は、血清に鉄含有溶液を加え、トラン
スフェリンと結合していない過剰の鉄を鉄発色試薬を用
いて測定し、血清中の不飽和鉄結合能を測定する方法に
おいて、イミノ二酢酸、エチレンジアミン−N,N′−二
酢酸、エチレンジアミン−N,N′−二プロピオン酸及び
ニトリロ三プロピオン酸並びにそれらの塩から選ばれた
少なくとも一種のキレート剤の存在下に測定することを
特徴とするものである。

本発明は上記の構成よりなり、鉄に対して比較的弱い
キレート力を有するキレート剤を使用しているので、ト
ランスフェリンと鉄との反応及び鉄発色試薬と過剰の鉄
との反応を阻害せず、迅速に反応が進行し、不飽和鉄結
合能の測定を短時間で終了させることができる。

本発明の測定方法は、試料である血清に、所定量の鉄
と、イミノ二酢酸、エチレンジアミン−N,N′−二酢
酸、エチレンジアミン−N,N′−二プロピオン酸及びニ
トリロ三プロピオン酸並びにそれらの塩から選ばれた少
なくとも一種のキレート剤を含有する緩衝液を添加し、
所定時間、所定温度で反応させることにより、血清中の
不飽和トランスフェリンを鉄で飽和させる。次いで、こ
の溶液に鉄発色試薬を添加し過剰の鉄を発色させて吸光
度を測定することにより行われる。このようにして得ら
れた吸光度と予め作成された検量線と対比することによ
り、又は不飽和鉄結合能が既知の試料を用いて得られた
吸光度から計算することにより、試料中の不飽和鉄結合
能が求められる。

上記の方法において、鉄及びキレート剤を溶解する緩
衝液としては、トランスフェリンと鉄との結合の安定性
の点から、pHが7.5〜9.0程度、好ましくは8.0〜8.5程度
の緩衝液が用いられ、通常トリス塩酸緩衝液が用いられ
る。

また鉄としては、通常、硫酸第一鉄アンモニウム、塩
化第一鉄等が使用され、その濃度は通常3.5〜5mg/程
度、好ましくは4.0〜4.5mg/程度に調整される。

キレート剤としては、イミノ二酢酸、エチレンジアミ
ン−N,N′−二酢酸、エチレンジアミン−N,N′−二プロ
ピオン酸及びニトリロ三プロピオン酸並びにそれらの塩
から選ばれた少なくとも一種が使用され、塩としては、
例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩
等の塩基付加塩、塩酸塩、酢酸塩等の酸付加塩が挙げら
れる。上記キレート剤のうち、イミノ二酢酸及びその塩
はキレート力が適度で本発明方法には好適に使用され
る。これらのキレート剤は、通常50μＭ以上の濃度で使
用され、好ましくは0.5mM〜10mM程度に調整され、また1
0mM以上の濃度で使用して緩衝液としての作用を兼ねて
用いることもできる。

また鉄発色試薬としては、例えば、バソフェナンスロ
リンスルホン酸、2,4,6トリピリジル−Ｓ−トリアジ
ン、３−ピリジル−5,6−ジフェニル−1,2,4−トリアジ
ン、３−（２−ピリジル）−5,6−ビス（４−スルホフ
ェニル）−1,2,4−トリアジン、３−（２−ピリジル）
−5,6−ビス［２−（５−スルホフリル）］−1,2,4−ト
リアジン（以下、フェレンという）、２−ニトロソ−５
−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノ
ール、及びそれらの塩が例示され、塩としては、例え
ば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩等が
挙げられる。上記鉄発色試薬のうち、フェレン及びその
塩は分子吸光係数が大きく、測定精度の向上に寄与でき
ると共に試薬の使用量を少なくすることができるので好
適に使用される。

なお、本発明の測定方法において、トランスフェリン
と結合しなかった過剰の鉄と鉄発色試薬との反応を、pH
7.5〜9.0程度の領域で完結させるために、還元剤の存在
下に行なうのが好ましく、還元剤としては、例えば、ア
ルコルビン酸、ヒドロキシルアミン、及びその塩等が挙
げられ、これら還元剤は0.5〜4W/V％程度の濃度で使用
される。

次に、本発明の測定方法の一例をより具体的に説明す
ると、試料である血清に、鉄と前記キレート剤を含有す
る緩衝液（例えば、硫酸第一鉄アンモニウムとイミノ二
酢酸を含有するトリス塩酸緩衝液、pH8.5程度）を添加
し、約37℃で４〜５分程度放置する。次いで、鉄発色試
薬溶液（例えば、アルコルビン酸、塩酸ヒドロキシルア
ミン等の還元剤を含有するフェレン溶液）を添加し、10
〜30秒程度放置することにより過剰の鉄を発色させ、吸
光度を測定する。一方、不飽和鉄結合能が既知の溶液を
順次希釈して希釈試料液列を形成し、各希釈試料液を上
記血清の代りに用い、同様な操作により吸光度を測定
し、各希釈液の不飽和鉄結合能に対してプロットし検量
線を作成する。得られた検量線と上記の血清を試料とし
て得られた吸光度を対比することにより、血清中の不飽
和鉄結合能が求められる。また検量線を作成する代り
に、不飽和鉄結合能が既知のコントロール液を用い、上
記操作と同様にして吸光度を求め、計算により試料中の
不飽和鉄結合能を求めることもできる。

上記のように、本発明の測定方法は短時間で反応が終
了し、その操作も簡便であるので、自動分析装置を用い
る不飽和鉄結合能の測定に適している。

＜実施例＞以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、特に明示のない限り、％
はW/V％を示す。

実施例１（１）試薬（ａ）緩衝液： 4.4mg/の硫酸第一鉄アンモニウムと1mMのイミノ二
酢酸を含有する0.2Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5）（ｂ）鉄発色試液： 0.5％フェレンと2.5％塩酸ヒドロキシルアミンを含有
する水溶液（２）操作方法緩衝液2mlに血清200μを添加し、混和した後37℃で
５分間加温した。次いで、鉄発色試液0.5mlを添加し、
波長600nmでの吸光度の変化を精製水を対照として測定
した。また比較として、上記緩衝液からイミノ二酢酸を
除いたものを使用して同様な操作により吸光度変化を測
定した。その結果を第１図に示す。第１図中、〔Ｉ〕は
イミノ二酢酸含有緩衝液、〔II〕はイミノ二酢酸を含有
しない緩衝液を示す。

第１図から明らかなように、イミノ二酢酸を含有する
緩衝液を使用した場合には約１分で反応が終了している
のに対し、イミノ二酢酸を含有しない緩衝液を使用した
場合には約８分経過後においても反応の完結は認められ
なかった。

実施例２（１）試薬実施例１に示された緩衝液及び鉄発色試液を用いた。

（２）操作方法不飽和鉄結合能が490μg/dlであるコントロール血清
及びこれを段階希釈することにより不飽和鉄結合能が各
々98、196、294、392μg/dlである溶液を調製した（以
下、コントロール血清試料という）。

上記コントロール血清試料20μに、緩衝液350μ
を添加し、37℃で４分30秒放置した後600nmの吸光度を
測定した。その20秒後に鉄発色試液75μを添加し、さ
らに５分後に600nmの吸光度を測定した。なお、測定に
は自動分析機（日立7050型）を使用した。各コントロー
ル血清試料の不飽和鉄結合能（μg/dl）に対し、その吸
光度をプロットして検量線を作成した。その結果を第２
図に示す（なお、第２図においては、便宜上、不飽和鉄
結合能の大きい程吸光度が大きくなるように表示し
た）。第２図に示されるように、検量線は原点を通る直
線となり、良好な定量性を示した。

実施例３（１）試薬実施例１に示された緩衝液及び鉄発色試液を用いた。

（２）操作方法 20検体の血清から各20μを採取し、各々に緩衝液35
0μを添加し、37℃で４分30秒放置した後600nmの吸光
度を測定した。その20秒後に鉄発色試液75μを添加
し、さらに５分後に600nmの吸光度を測定し、実施例２
で得られた検量線より、血清中の不飽和鉄結合能を求め
た。なお、測定には自動分析機（日立7050型）を使用し
た。

一方、同じ20検体の血清について、従来法である下記
炭酸マグネシウム法にて不飽和鉄結合能を測定した。

炭酸マグネシウム法血清0.2mlに塩化第二鉄溶液（Fe³⁺0.5μg/ml）1mlを
添加して混合した後、室温にて約５分間放置した。これ
に炭酸マグネシウム0.15gを添加して、さらに蒸溜水0.5
mlを加え、混合した後30分間放置した。遠心分離により
炭酸マグネシウムを除去した後、上清0.5mlを採取し、
緩衝液（５％ラウリル硫酸ナトリウムを含有する0.1M酢
酸塩緩衝液、pH6.0）2.0ml及びＬ−アスコルビン酸15mg
を添加して混合した。次いで、0.2％バソフェナンスロ
リンスルホン酸ナトリウム溶液１滴を添加し、室温で５
分間放置した後、535nmの吸光度を測定することによ
り、総鉄結合能を求めた。また、従来法により血清中の
血清鉄値を別途求め、総鉄結合能から血清鉄を差し引く
ことにより、付飽和鉄結合能を算出した。

本発明方法及び炭酸マグネシウム法で得られた不飽和
鉄結合能の結果を第１表に示す。

第１表に示されるように、本発明方法と従来法とはよ
い相関を示した。

＜発明の効果＞以上のように、本発明の不飽和鉄結合能の測定方法に
よれば、操作が簡便であると共に測定が短時間で終了す
るので多数の検体を迅速に処理することができ、また感
度が高いので血清、試薬等の使用量を少なくすることが
でき、特に臨床検査の分野で要求されている自動分析化
が図れるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるキレート剤の有無による発色
時間の相違を示す図で、〔Ｉ〕はキレート剤含有（イミ
ノ二酢酸1mM）緩衝液、〔II〕はキレート剤を含有しな
い緩衝液を示す。第２図は実施例２で得られた検量線を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】血清に鉄含有溶液を加え、トランスフェリ
ンと結合していない過剰の鉄を鉄発色試薬を用いて測定
し、血清中の不飽和鉄結合能を測定する方法において、
イミノ二酢酸、エチレンジアミン−N,N′−二酢酸、エ
チレンジアミン−N,N′−二プロピオン酸及びニトリロ
三プロピオン酸並びにそれらの塩から選ばれた少なくと
も一種のキレート剤の存在下に測定することを特徴とす
る不飽和鉄結合能の測定方法。
【請求項２】キレート剤がイミノ二酢酸又はその塩であ
る請求項１記載の不飽和鉄結合能の測定方法。
【請求項３】鉄発色試薬が３−（２−ピリジル）−5,6
−ビス［２−（５−スルホフリル）］−1,2,4−トリア
ジン又はその塩である請求項１又は２のいずれかに記載
の不飽和鉄結合能の測定方法。