JPH02167476A - 不飽和鉄結合能の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は不飽和鉄結合能の測定方法に関し、さらに詳細
には、臨床検査の分野等での使用を目的とする血清中の
不飽和鉄結合能の測定方法に関する。

〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉生体内
の鉄総量は約４ｇといわれ、そのうち約２／３は血液中
に、残りの約１／３は肝臓、牌臓、骨髄等に貯蔵鉄とし
て存在する。血液中の鉄の大半は赤血球ヘモグロビン構
成因子であり、血清中の鉄は極微量である。血清中の鉄
は全て血清蛋白のβ１−グロブリンに属するトランスフ
ェリンと結合した血清鉄として存在し、血清鉄は骨髄の
赤芽球での造血に利用される。血清中のトランスフェリ
ンは組織の鉄貯蔵部より骨髄の赤芽球への鉄の運搬体と
しての機能を果たし、健常人ではトランスフェリンの約
１／３が血清鉄として鉄と結合しているのみで、残りは
不飽和の状態である。この不飽和トランスフェリンに結
合しうる鉄量は不飽和鉄結合能と称され、血清鉄と不飽
和鉄結合能の和は総鉄結合能と称されている。総鉄結合
能、血清鉄及び不飽和鉄結合能は、赤血球の生成や崩壊
と密接な関係を有し造血機能を反映すると共にトランス
フェリンを生成する肝臓の疾患や鉄貯蔵部における疾患
とも関係するので、これらの測定は臨床上重要視され、
例えば、鉄欠乏性貧血、慢性出血性貧血、真性多血症等
においては不飽和鉄結合能の上昇が、再生不良性貧血、
悪性腫瘍、慢性感染症等では不飽和鉄結合能の低下が認
められる。

このように不飽和鉄結合能の測定は臨床上重要な意義を
有するので、従来、その測定方法として種々の方法が提
案されている。例えば、血清に過剰の鉄溶液を加えた後
、トランスフェリンと結合しなかった余分の鉄を、炭酸
マグネシウムに吸着させ遠心分離により除去し、上清中
のトランスフェリン結合鉄を測定して総鉄結合能を求め
、別途測定した血清鉄との差から不飽和鉄結合能を求め
る方法（以下、炭酸マグネシウム法という）が知られて
いるが、この方法では液層との分離に困難をきたすこと
があり、操作も煩雑である。また炭酸マグネシウムの代
りにイオン交換樹脂を用いる方法も知られている。この
方法によれば、液層との分離は簡便であるが、イオン交
換樹脂は活性度が一定せず、鉄除去能と添加量との関係
も不安定であるという問題がある。

また、不飽和鉄結合能の国際標準測定法は、５９Ｆｅを
用いるラジオアッセイ法であるが、この方法は放射性物
質を用いるため特別な設備を必要とし且つ試薬も高価と
なる。

このような問題から、現在広く用いられている方法は、
血清に塩基性緩衝液及び過剰の鉄溶液（例えば、アスコ
ルビン酸等の還元剤を含有する硫酸第一鉄アンモニウム
溶液）を加え、トランスフェリンと結合し切れなかった
遊離の鉄量をバソフェナンスロリンスルホン酸、クロマ
ズロール等の鉄発色試薬で発色させて測定する方法（５
ｃｈａｄｅ法）である。またこの方法において、使用さ
れる鉄溶液の安定性を向上させるため、ニトリロ三酢酸
を添加する方法も知られている（特公昭５２９１６０号
公報参照）。上記の５ｈａｄｅ法及びその改良法によれ
ば、遠心分離操作や除蛋白操作が不要となるので、簡便
な操作にて測定することかできるが、上記方法は、■測
定感度が低いので、臨床検査の分野で用いる測定法とし
ては比較的多量の試料（血清）を必要とする；■発色に
少なくとも１０分を要するので、測定時間が長くなり、
迅速に処理することができないという問題がある。

特に、現今の臨床検査の分野では多数の検体を短時間に
処理することが要求され、そのために自動分析装置が広
く用いられているが、上記の従来法は、感度、測定時間
の問題から自動化には適合し難いという問題がある。

本発明は、上記従来技術の欠点を解消すべく創案された
もので、迅速且つ高精度で不飽和鉄結合能が測定でき、
特に自動分析化に適した不飽和鉄結合能の測定方法を提
供することを目的とする。

く課題を解決するための手段及び作用〉上記の課題を解
決すべくなされた、本発明の不飽和鉄結合能の測定方法
は、血清に鉄含有溶液を加え、トランスフェリンと結合
していない過剰の鉄を鉄発色試薬を用いて測定し、血清
中の不飽和鉄結合能を測定する方法であって、イミノ二
酢酸、エチレンジアミン−Ｎ、Ｎ−−二酢酸、エチレン
ジアミン−Ｎ、Ｎ−ｍ＝プロピオン酸及びニトリロ三プ
ロピオン酸並びにそれらの塩から選ばれた少なくとも一
種のキレート剤の存在下に測定することを特徴とするも
のである。

本発明は上記の構成よりなり、鉄に対して比較的弱いキ
レート力を有するキレート剤を使用しているので、トラ
ンスフェリンと鉄との反応及び鉄発色試薬と過剰の鉄と
の反応を阻害せず、迅速に反応が進行し、不飽和鉄結合
能の測定を短時間で終了させることができる。

本発明の測定方法は、試料である血清に、所定量の鉄と
、イミノ二酢酸、エチレンジアミン−Ｎ。

Ｎ′−二酢酸、エチレンジアミン−Ｎ、Ｎ−ｍ＝プロピ
オン酸及びニトリロ三プロピオン酸並びにそれらの塩か
ら選ばれた少なくとも一種のキレート剤を含有する緩衝
液を添加し、所定時間、所定温度で反応させることによ
り、血清中の不飽和トランスフェリンを鉄で飽和させる
。次いで、この溶液に鉄発色試薬を添加し過剰の鉄を発
色させて吸光度を測定することにより行われる。このよ
うにして得られた吸光度と予め作成された検量線と対比
することにより、又は不飽和鉄結合能が既知の試料を用
いて得られた吸光度から計算することにより、試料中の
不飽和鉄結合能が求められる。

上記の方法において、鉄及びキレート剤を溶解する緩衝
液としては、トランスフェリンと鉄との結合の安定性の
点から、ｐＨが７．５〜９．０程度、好ましくは８．０
〜８．５程度の緩衝液が用いられ、通常トリス塩酸緩衝
液が用いられる。

また鉄としては、通常、硫酸第一鉄アンモニウム、塩化
第−鉄等が使用され、その濃度は通常３．５〜５■／ρ
程度、好ましくは４，０〜４．５■／ρ程度に調整され
る。

キレート剤としては、イミノ二酢酸、エチレンジアミン
−Ｎ、Ｎ−二酢酸、エチレンジアミンＮ、Ｎ−−二プロ
ピオン酸及びニトリロ三プロピオン酸並びにそれらの塩
から選ばれた少なくとも一種が使用され、塩としては、
例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩
等の塩基付加塩、塩酸塩、酢酸塩等の酸付加塩が挙げら
れる。上記キレート剤のうち、イミノ二酢酸及びその塩
はキレート力が適度で本発明方法には好適に使用される
。これらのキレート剤は、通常５０μＭ以上の濃度で使
用され、好ましくは０．５ｍＭ〜１０ｍＭ程度に調整さ
れ、また１０ｍＭ以上の濃度で使用して緩衝液としての
作用を兼ねて用いることもできる。

また鉄発色試薬としては、例えば、バソフエナンスロリ
ンスルホン酸、２，４．６−）リピリジル−８−）リア
ジン、３−ピリジル−５，６−ジフェニル−１，２，４
−１リアジン、３−　（２−ピリジル）−５，６−ビス
（４−スルホフェニル）１．２．４−トリアジン、３−
（２−ピリジル）５．６−ビス［２−（５−スルホフリ
ル）］１．２．４−トリアジン（以下、フェレンという
）、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ＝スルホプ
ロピルアミノ）フェノール、及びそれらの塩が例示され
、塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等の
アルカリ金属塩等が挙げられる。上記鉄発色試薬のうち
、フェレン及びその塩は分子吸光係数が大きく、測定精
度の向上に寄与できると共に試薬の使用量を少なくする
ことができるので好適に使用される。

なお、本発明の測定方法において、トランスフェリンと
結合しなかった過剰の鉄と鉄発色試薬との反応を、ｐＨ
７，５〜９．０程度の領域で完結させるために、還元剤
の存在下に行なうのが好ましく、還元剤としては、例え
ば、アスコルビン酸、ヒドロキシルアミン、及びその塩
等が挙げられ、これら還元剤は０．５〜４Ｗ／’Ｖ％程
度の濃度で使用される。

次に、本発明の測定方法の一例をより具体的に説明する
と、試料である血清に、鉄と前記キレート剤を含有する
緩衝液（例えば、硫酸第一鉄アンモニウムとイミノ二酢
酸を含有するトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８，５程度）を添
加し、約３７℃で４〜５分程度放置する。次いで、鉄発
色試薬溶液（例えば、アスコルビン酸、塩酸ヒドロキシ
ルアミン等の還元剤を含有するフェレン溶液）を添加し
、１０〜３０秒程度放置することにより過剰の鉄を発色
させ、吸光度を測定する。一方、不飽和鉄結合能が既知
の溶液を順次希釈して希釈試料液列を形成し、各希釈試
料液を上記血清の代りに用い、同様な操作により吸光度
を測定し、各希釈液の不飽和鉄結合能に対してプロット
し検量線を作成する。得られた検量線と上記の血清を試
料として得られた吸光度を対比することにより、血清中
の不飽和鉄結合能が求められる。また検量線を作成する
代りに、不飽和鉄結合能が既知のコントロール液を用い
、上記操作と同様にして吸光度を求め、計算により試料
中の不飽和鉄結合能を求めることもできる。

上記のように、本発明の１ｆｌ１１定方法は短時間で反
応が終了し、その操作も簡便であるので、自動分折装置
を用いる不飽和鉄結合能の測定に適している。

〈実施例〉 以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、以下の実施例において、特に明示のない限り、％は
Ｗ／Ｖ％を示す。

実施例１ （１）試薬 （釦緩衝液： ４．４■／ρの硫酸第一鉄アンモニウムと１ｍＭのイミ
ノ二酢酸を含有する０、２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，５） （ｂ）鉄発色試液： ０．５％フェレンと２．５％塩酸ヒドロキシルアミンを
含有する水溶液 （２）操作方法 緩衝液２　ｍｌに血清２００μＤを添加し、混和した後
３７℃で５分間加温した。次いで、鉄発色試液０．５ｍ
ｌを添加し、波長６００ｎｍでの吸光度の変化を精製水
を対照として測定した。また比較として、上記緩衝液か
らイミノ二酢酸を除いたものを使用して同様な操作によ
り吸光度変化を測定した。その結果を第１図に示す。第
１図中、（Ｉ）はイミノ二酢酸含有緩衝液、（Ｉ［）は
イミノ二酢酸を含有しない緩衝液を示す。

第１図から明らかなように、イミノ二酢酸を含有する緩
衝液を使用した場合には約１分で反応が終了しているの
に対し、イミノ二酢酸を含有しない緩衝液を使用した場
合には約８分経過後においても反応の完結は認められな
かった。

実施例２ （１）試薬 実施例１に示された緩衝液及び鉄発色試液を用いた。

（２）操作方法 不飽和鉄結合能が４９０μｇ　／　ｄ　ｉｔであるコン
トロール血清及びこれを段階希釈することにより不飽和
鉄結合能が各々９８．１９６．２９４．３９２μｇ　／
　ｄ　、１１１である溶液を調製した（以下、コントロ
ール血清試料という）。

上記コントロール血清試料２０μρに、緩衝液３５０μ
ｇを添加し、３７℃で４分３０秒放置した後６００ｎｍ
の吸光度を測定した。その２０秒後に鉄発色試液７５μ
ρを添加し、さらに５分後に６００μｍの吸光度を測定
した。なお、測定には自動分析機（日立７０５０型）を
使用した。各コントロール血清試料の不飽和鉄結合能（
μｇ／ｄ、ｌ））に対し、その吸光度をプロットして検
量線を作成した。その結果を第２図に示す（なお、第２
図においては、便宜上、不飽和鉄結合能の大きい程吸光
度が大きくなるように表示した）。第２図に示されるよ
うに、検量線は原点を通る直線となり、良好な定量性を
示した。

実施例３ （１）試薬 実施例１に示された緩衝液及び鉄発色試液を用いた。

（２）操作方法 ２０検体の血清から各２０μρを採取し、各々に緩衝液
３５０μρを添加し、３７℃で４分３０秒放置した後６
００ｎｍの吸光度を測定した。その２０秒後に鉄発色試
液７５μρを添加し、さらに５分後に６００μｍの吸光
度を測定し、実施例２で得られた検量線より、血清中の
不飽和鉄結合能を求めた。なお、測定には自動分析機（
日立７０５０型）を使用した。

一方、同じ２０検体の血清について、従来法である下記
炭酸マグネシウム法にて不飽和鉄結合能を測定した。

炭酸マグネシウム法 血清０．２ｍｌに塩化第二鉄溶液（Ｆｅ”０．５μｇ／
ｍｌ）１ｍｌを添加して混合した後、室温にて約５分間
放置した。これに炭酸マグネシウム０．１５ｇを添加し
、さらに蒸溜水０．５ｍｌを加え、混合した後３０分間
放置した。遠心分離により炭酸マグネシウムを除去した
後、上清０．５ｍｌを採取し、緩衝液（５％ラウリル硫
酸ナトリウムを含有する０、１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ６
，０）２．０ｍｌ及びＬ−アスコルビン酸１５■を添加
して混合した。次いで、０．２％バソフェナンスロリン
スルホン酸ナナトリウム溶液１を添加し、室温で５分間
放置した後、５３５ｎｍの吸光度を測定することにより
、総鉄結合能を求めた。また、従来法により血清中の血
清鉄値を別途求め、総鉄結合能から血清鉄を差し引くこ
とにより、不飽和鉄結合能を算出した。

本発明方法及び炭酸マグネシウム法で得られた不飽和鉄
結合能の結果を第１表に示す。

第１表に示されるように、本発明方法と従来法とはよい
相関を示した。

（以下余白） 〈発明の効果〉 以上のように、本発明の不飽和鉄結合能の測定方法によ
れば、操作が簡便であると共に測定が短時間で終了する
ので多数の検体を迅速に処理することができ、また感度
が高いので血清、試薬等の使用量を少なくすることがで
き、特に臨床検査の分野で要求されている自動分析化が
図れるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるキレート剤の有無による発色
時間の相違を示す図で、（１）はキレート剤含有（イミ
ノ二酢酸１ｍＭ）緩衝液、［■］はキレート剤を含有し
ない緩衝液を示す。 第２図は実施例２で得られた検量線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血清に鉄含有溶液を加え、トランスフェリンと結合
   していない過剰の鉄を鉄発色試薬を用いて測定し、血清
   中の不飽和鉄結合能を測定する方法において、イミノ二
   酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−二酢酸、エチレン
   ジアミン−Ｎ，Ｎ′−二プロピオン酸及びニトリロ三プ
   ロピオン酸並びにそれらの塩から選ばれた少なくとも一
   種のキレート剤の存在下に測定することを特徴とする不
   飽和鉄結合能の測定方法。 ２、キレート剤がイミノ二酢酸又はその塩である請求項
   １記載の不飽和鉄結合能の測定方法。 ３、鉄発色試薬が３−（２−ピリジル）−５，６−ビス
   ［２−（５−スルホフリル）］−１，２，４−トリアジ
   ン又はその塩である請求項１又は２のいずれかに記載の
   不飽和鉄結合能の測定方法。