JP3523878B2 - ヘモグロビンの定量用無シアン化物試薬及び方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は一般には、手動方法又は自動方法のいずれか
で全血試料中に存在するヘモグロビン濃度を定量するの
に使用する試薬及び方法に関する。特定試薬は、シアン
化物を使用せずに試料中の全ヘモグロビンを検出及び測
定のために明確に定義された色素原に迅速に変換する。

発明の背景 ヘモグロビン分子は肺から種々の身体組織及び器官に
酸素を輸送するので、血液試料中のヘモグロビンの量を
測定することの重要性は血液科学で旧来から認められて
いる。患者の血液中のヘモグロビン濃度の正確な測定値
は、血液分析で測定される最も重要なパラメーターであ
ると言える。ヘモグロビン濃度は、内在疾患の徴候であ
る貧血をスクリーニングするために使用される。

「西洋食」の国々では、ヘモグロビン濃度が男子では
14g/dL、女子では12g/dLを下回ると貧血であると判断さ
れる。貧血の原因は多様であるが、ヘモグロビン濃度が
低い場合には患者の主治医は精密検査を行う必要があ
る。従って、ヘモグロビン濃度の正確で確実な測定方法
は血液学系の根幹である。患者が貧血に陥る最も一般的
な２つの理由は、血液損失と、食物接取における鉄、ビ
タミンB12又は葉酸の欠乏である。前者の場合には医師
は血液損失の原因を調べて治療しなければならない。後
者の場合にも適切な栄養補給治療を決定するために正し
い診断が必要である。

貧血の一次指標としての重要さに加え、ヘモグロビン
濃度は数種の指数を計算するために他の血球パラメータ
ーと組み合わせて使用される。平均赤血球ヘモグロビン
量（MCH）は赤血球１個当たりのヘモグロビンの質量で
あり、ヘモグロビン濃度を同等容量中の赤血球の数で除
することにより計算される。平均赤血球ヘモグロビン濃
度（MCHC）は赤血球中のヘモグロビンの重量百分率であ
り、ヘモグロビン濃度をヘモクリットで除して百分率に
変換することにより計算される。MCHとMCHCはいずれも
貧血の診断に有用なパラメーターである。これらのパラ
メーターの重要さにより、血液試料中のヘモグロビン濃
度を正確で確実に測定する必要は一層重視される。

ヘモグロビン濃度の最近の測定法では、試料中の酸素
輸送タンパク質の量を定量するために分光光度法を利用
している。血液試料中のヘモグロビンを測定するため
に、分光光度法は、 1.全ヘモグロビンを封鎖している赤血球から放出しなけ
ればならず、 2.反応開始時のヘモグロビンの形態に関係なく、試料中
の全ヘモグロビンを単一色素原種に変換しなければなら
ない という２つの要件を満たさなければならない。

第１の要件は多くの手段により満たすことができ、最
も簡単な手段は低張溶解を生じるように血液試料を蒸留
水で希釈する方法である。しかし、最近の自動血液分析
器具は低張溶解で達せられるよりも迅速な溶解を必要と
する。多くの場合には、溶解剤に界面活性剤を加えてヘ
モグロビンの放出を速めると共に、高脂質濃度により試
料中に生じ得る濁りを澄ませている。アニオン、非イオ
ン、両性イオン及びカチオンを含む種々の界面活性剤が
この作業に適している。界面活性剤の必要量は界面活性
剤の「力価」と試薬のイオン強度に依存して約100mg/L
〜約50g/Lであり得る。

第２の要件は、グロブリンタンパク質分子内で錯形成
して酸素を輸送するヘム鉄の化学機構を説明する必要が
ある。ヘム鉄は正常血液試料中では＋２（Fe^II）酸化状
態に維持されている。血液試料は通常は静脈から採取さ
れるので、ヘモグロビンは一般にデオキシ状態であり、
即ちヘム鉄に酸素は結合していない。しかし、試料は大
気と接触するか又は酸素を含有する緩衝液もしくは溶解
試薬で希釈されるや否やオキシヘモグロビンに迅速に変
換され、ヘム鉄は酸素と結合するが、Fe^II（還元）状態
に止まる。多くの場合、試料中のヘモグロビンの量は空
気に触れると自然に形成されるオキシヘモグロビン色素
原から決定することができる。しかし、この試料溶液を
許容できないような条件もある。ある種の疾患、遺伝条
件又は中毒によっては、患者が循環中に有意量のメトヘ
モグロビンをもつ場合がある。メトヘモグロビンではヘ
ム鉄は＋３（Fe^III）酸化状態である。ヘム鉄は酸素に
結合することができず、また、オキシヘモグロビンとし
て測定するために酸素と結合できるようにFe^IIに容易に
還元することもできない。また、ヘビースモーカーや、
高濃度の自動車排気ガスにさらされる労働者には、ヘム
鉄と結合した高濃度の一酸化炭素が蓄積しがちである。
一酸化炭素は強く結合して酸素の結合を妨げるので、オ
キシヘモグロビン法により測定する場合にはヘモグロビ
ンの濃度に誤りが生じる。ヘモグロビンの測定に最も一
般に使用されているアプローチは、全ヘム鉄を＋３状態
に酸化させ、全ヘム鉄と定量可能に結合して分光光度法
による定量のために単一色素原種を生成する配位子を導
入する方法である。

古典的な方法はドラブキン法である。要約すると、ヘ
モグロビンを低張溶解により放出させ（最近の改良法で
は溶解を速めるために界面活性剤を加えている）、フェ
リシアン化カリウムによりヘム鉄をFe^IIIに酸化させ、
鉄をシアン化カリウムのシアン化物アニオンと反応させ
る。シアン化物はFe^IIIと非常に強く結合し、約540nmに
ピークをもつ示差的色素原を与える。最近の改良法では
フェリシアン化物酸化剤を使用せずに、界面活性剤の存
在下で高pHでヘム鉄を大気酸素（又は酸素平衡試薬）に
より酸化させる方法もあるが、ほとんどの方法ではその
周知の毒性にも拘らず、依然としてシアン化物がヘム鉄
配位子として使用されている。

多くの自動血液分析器はドラブキン法の変形を使用し
ている。これらの方法では、シアン化物の存在下でpH＞
10でカチオン界面活性剤により赤血球を溶解している。
これらの条件下では白血球核は無傷のままであり、通常
のインピーダンス法により計数することができる。ヘモ
グロビンはドラブキン法で通常実施されるように、540n
mで同一溶液の光学密度を読み取ることにより測定され
る。この方法は、核による光の散乱によって濁りが生じ
るため、白血球数の高い試料中では測定値に誤りを生じ
ることがある。試料の濁り度即ち吸光度の増加により脂
肪血症及び黄疸試料も干渉しかねない。本発明は、他の
血液成分による干渉を受けずにヘモグロビンを測定する
試薬を提供することにより、これらの問題を回避する。

Stroupeら（米国特許第4,200,435号）は、アロステリ
ックエフェクターの存在下でグリコシル化ヘモグロビン
を定量するために配位子としてイミダゾールを使用する
ことを開示している。同著者らは試料中のヘモグロビン
の量を測定するために、界面活性剤溶解剤、酸化剤及び
ヘム結合配位子を使用することも開示している。Stroup
eら（米国特許第4,255,385号）は上記試薬を含む試薬キ
ットも開示している。本発明は、酸化剤を加える必要が
ないという点と、従来技術の発明の約10分間に比較して
10秒以内で反応が完了するという点で、Stroupeらの特
許により開示されている発明と相違する。

Benezraら（米国特許第4,853,338号）は界面活性剤濃
度が非常に高く（20〜50g/L）、pHが11.3〜13.7の無シ
アン化物ヘモグロビン試薬を開示している。pHが高いこ
とと、所望のpHに達するために多量のNaOHが必要である
ことから、この発明のヘム結合配位子は水酸化物アニオ
ンであると考えられる。試薬の水酸化物イオン濃度が十
分に高くないと、ヘムは単一色素原に化学量論的に変換
されず、高濃度（55M）で存在する水が鉄結合部位と競
合して誤った結果を生じる恐れがある。本発明はこの問
題を回避する。

本発明の目的は、全血試料中に存在する合計ヘモグロ
ビンを定量するための無シアン化物法及び試薬を提供す
ることである。本発明の別の目的は、自動器具で使用で
きる迅速な合計ヘモグロビン定量法を提供することであ
る。本発明の別の目的は、費用効率の高い試薬を提供す
ることである。本発明の別の目的は、他の血液成分の干
渉を受けずに全血中の合計ヘモグロビンを定量する方法
を提供することである。

本発明の上記及び他の目的は、以下の説明及び図面か
ら当業者に自明である。

発明の概要 ヘモグロビン定量法で使用する無シアン化物試薬は、
（ｉ）イミダゾール、イミダゾール誘導体、Ｎ−ヒドロ
キシアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシルアミン、ピリジ
ン、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリミジ
ン、プリン、キノリン及びイソキノリンから構成される
群から選択される無シアン化物配位子の濃度0.1〜2.0モ
ルと、（ii）ラウリルジメチルアミンオキシド及びオク
チルフェノキシエタノールから構成される群から選択さ
れる強溶血性界面活性剤の約0.1％〜約1.0％（w/v）の
水溶液からなり、該試薬のpHは好ましくは１価塩基で11
〜14に調整されている。本発明の方法によると、無シア
ン化物試薬を血液試料と迅速に混合して色素原を形成す
る。次に、得られた色素原の吸光度即ち光学密度をヘモ
グロビンの濃度の指標として測定する。この方法で形成
される色素原は約10秒以内で得られるので、自動器具で
使用するのに特に好適である。

図面の簡単な説明 図１は本発明の方法及び試薬を使用して調製した試料
のスペクトルである。

図２は、Cell−Dyn（登録商標）分析器でシアン化物
含有ヘモグロビン法を実施して得られたヘモグロビンデ
ータと、実験用自動血液分析器で本発明の無シアン化物
ヘモグロビン法を実施して得られたヘモグロビンデータ
の相関プロットである。

図３は、Coulter（登録商標）STKSでシアン化物含有
ヘモグロビン法を実施して得られたヘモグロビンデータ
と、実験用自動血液分析器で本発明の無シアン化物ヘモ
グロビン法を実施して得られたヘモグロビンデータの相
関プロットである。

図４は、本発明の無シアン化物ヘモグロビン試薬の新
鮮な調製物（対照）のヘモグロビンデータと、無シアン
化物試薬の６カ月調製物のヘモグロビンデータの相関プ
ロットである。

図5A及びＢは、対照と、45℃で３カ月間保存したとき
の本発明の無シアン化物ヘモグロビン試薬の反応速度を
示す。

発明の詳細な説明 本発明の試薬は、高処理量自動血液分析器具で合計ヘ
モグロビン分析を行うために開発された。

ヘモグロビン定量に有用な試薬は、検出及び測定のた
めに検出可能な色素原構造を形成するように、赤血球を
迅速に溶解でき、ヘモグロビンと迅速に錯形成できなけ
ればならない。本発明は、錯体が迅速に形成され、自動
器具に適合可能な時間にわたって安定に維持されるので
特に有用である。反応体は何週間にもわたって安定であ
る。本発明は、得られる色素原が他の血液成分により干
渉されず、現場に既存の自動血液分析器具のスペクトル
範囲内の波長で測定できるという点でも特に有利であ
る。これに対して、シアンメトヘモグロビン法は通例54
0nmで吸光度を測定する。本発明によると、約544nmに吸
収最大値をもつ赤みがかった茶色の色素原を形成するこ
とができる。

本発明の試薬は、イミダゾールやイミダゾール誘導体
等の配位子形成化合物の水溶液である。配位子形成化合
物は0.1M〜2.0Mの濃度で存在する。本発明の試薬からの
イミダゾールは、試料中の赤血球から放出されるヘモグ
ロビンと結合する。本発明で有用な他の配位子形成化合
物としては、Ｎ−ヒドロキシアセトアミド、Ｎ−ヒドロ
キシルアミン、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、
ピラゾール、ピリミジン、プリン、キノリン及びイソキ
ノリンが挙げられる。酸化鉄ヘムと結合可能なアニオン
としては、シアン酸、フッ化物、アジ化物、亜硝酸、水
酸化物、酢酸及びギ酸が挙げられ、これらのアニオンの
許容可能な塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム等が挙げられる。

試薬は更に、強い溶血能をもつ界面活性剤を含有す
る。ラウリルジメチルアミンオキシド（Ammonix L.
O.）［Stepan Chemical Company,Northfield,イリノ
イ州］及びオクチルフェノキシポリエトキシエタノール
（Triton Ｘ 100）又は他の強力洗浄剤を溶解剤（lys
ing reagent）の界面活性剤成分として使用することが
できる。界面活性剤は約0.1％〜約1.0％（w/v）の濃度
で存在すべきである。試薬のpHは11〜14、好ましくは1
2.5に調整すべきである。水酸化ナトリウムや水酸化カ
リウム等の１価塩基をpH調整に使用することができる。

本発明の方法によると、試薬と血液の比が約50〜100
0:1となるように溶解剤を全血試料と混合する。試料と
試薬を迅速に混合し、溶血と、ヘモグロビンから色素原
への変換を行う。次に試料と試薬の混合物を吸光度分光
光度計に加え、形成された色素原の光学密度を測定す
る。配位子がイミダゾールであるときには、540nm〜550
nmで測定することができる。試料中の合計ヘモグロビン
濃度は、変換された色素原の光学密度と相関する。

以下、本発明を実施例により説明するが、これらの実
施例は例示の目的に過ぎず、請求の範囲を制限するもの
ではない。

実施例１ 目盛り付きシリンダーに入れた約900mlの蒸留水に0.4
モルのイミダゾール（27.2g）（Sigma Chemical Comp
any）と0.1モルの水酸化ナトリウム（4.0g）（Fisher
Chemical Company）を加えた。磁気撹拌機を使用して
試薬を溶かした。ラウリルジメチルアミンオキシド（非
イオン界面活性剤、30％溶液、Stepan Chemical Comp
any,Northfield,イリノイ州）3.3mlを撹拌下に加え、蒸
留水を加えて容量を1000mlに調整した。溶液を0.2ミク
ロンNalgeneフィルターで濾過し、使用時まで室温で保
存した。この調製物を以下の文中ではイミダゾール0.4
と呼ぶ。

イミダゾールの量を0.1モル（6.8g）〜1.0モル（68.1
g）とした以外は同様にして他の試薬を調製した。これ
らの調製物を以下の文中ではイミダゾールＸ（Ｘはモル
濃度を表す）と呼ぶ。

実施例２ 全血12μｌを3.0mlのイミダゾール0.4と混合した。He
wlett Packard 8452A Diode Array Spectrophotom
eter（HP）を使用して780nmから480nmまでの吸収スペク
トルを記録した。図１は544nmにピークを示し、580nm付
近に肩を示す。比較のために、同一濃度のオキシ及びデ
オキシヘモグロビンのスペクトルも示す。

実施例３ 全血12μｌを0.1〜1.0Mのイミダゾール試薬3.0mlと迅
速に混合した。吸光度を544nmで60秒間モニターした。
混合後10秒から混合後60秒までの吸光度の変化を測定
し、「変動」の欄に示した。

実施例４ NaOH、界面活性剤及びイミダゾールの各濃度を種々変
化させた一連の調製物を調製し、溶解の完全性とシグナ
ルの安定性を試験した。全血12μｌを試薬と混合した。
溶解の完全性については700nmの吸光度を観察し、色素
原への変換の完全性については544nmの吸光度を観察し
た。溶解の完全性を「＋」で示し、変動の存在を「＋」
で示し、「＋＋」は顕著な変動を示す。

短時間で反応が完了すること、即ち短時間で完全に溶
解し且つ変動のないことが望ましいが、試薬添加と吸光
度測定のタイミングを調節するならば変動シグナルを使
用することも可能である。

実施例５ 本実施例と実施例６及び７ではイミダゾール0.4のみ
を使用した。一定範囲のヘマトクリット値を与えるよう
に操作した血液試料を調製した。これらの試料は、EDTA
抗凝血剤で処理した血液試料を500gで10分間遠心分離す
ることにより調製した。血漿を正常血液試料に加え、低
ヘマトクリット試料を調製した。バフィーコートを保存
し、正常ヘマトクリットをもつ高白血球数試料を得た。
沈降した赤血球を高ヘマトクリット試料として分析し
た。ヘマトクリット及び白血球数をBaker 4000分析器
で測定した。イミダゾール0.4で1:251に希釈した試料の
吸光度をHewlett−Packard 8452A Diode Array Spe
ctrophotometerで540nmで読み取った。結果を下表に示
す。

実施例６ ドラブキン法によるヘモグロビン定量用キットを使用
し、従来確立されている参照方法とイミダゾール0.4試
薬の性能を比較した。カタログ番号525−ＡのキットはS
igma Diagnostics,P.O.Box 14508,St.Louis,ミズーリ
州,63178から入手し、指示に従って再構成及び使用し
た。

０〜約20g/dLのヘモグロビン濃度を与えるように全血
の正常試料を操作した。試料をドラブキン法及びイミダ
ゾール0.4を使用して分析した。ドラブキンの試料は1:2
51の比で反応させ、イミダゾール0.4は1:101の比で反応
させた。全反応混合物をHewlett Packard Diode Arr
ay Spectrophotometerで540nmで読み取った。イミダゾ
ール0.4の反応は10秒以内に完了するが、便宜のために
反応混合物を約30分間インキュベートさせてから読み取
った。

イミダゾール0.4試薬とドラブキン試薬の相関係数は
ｒ＝＋0.9976であり、傾きは75.2mA/g/dLであり、切片
は−12.0mAである。イミダゾール0.4試薬と標準ドラブ
キン試薬により与えられるA540の優れた線形相関は、こ
れらの２種の方法による結果が等価であることを立証
し、シアン化物含有標準方法の代わりに本発明の方法の
非毒性調製物を使用できることが明らかである。

実施例７ 市販の半自動血液分析器Coulter（登録商標）β JT
でLysis Ｓ（登録商標）III（シアン化カリウム含有）
とIsoton（登録商標）III試薬（いずれもCoulter Diag
nostics,Hialeah,フロリダ州の製品）を使用し、イミダ
ゾール0.4試薬と比較した。０〜約25g/dLのヘモグロビ
ン濃度をもつ一連の全血処置試料を上記のように調製し
た。試料をCoulter（登録商標）JT分析器で器具マニュ
アルに記載されているように分析した。ポジティブディ
スプレースメントピペット（Absoluter Pipettor,Tri
−Continent Scientific Company,Grass Valley,カ
リフォルニア州）を使用して血液試料40μｌを試験管に
分配し、Eppendorf Repipettor（Brinkman Instrumen
ts,Inc.,Westbury,N.Y.）でイミダゾール0.4試薬5.0ml
を加えることにより、イミダゾール0.4試薬を試料と1:1
26の比で反応させた。シッパーを備えるBeckman DU−
７ Spectrophotometer（Beckman Instruments,Fuller
ton,カリフォルニア州）で540nmにおける反応試料の吸
光度を読み取った。イミダゾール0.4による定量を２回
繰り返し、結果を平均した。

強い線形相関（相関計数ｒ＝0.9998、傾きｍ＝49.94m
A/g/dL、切片＝4.4mA）は、本発明が公知市販器具と厳
密に同等の結果を与えることを立証するものである。

実施例８ 12g/dL〜17.5g/dLのヘモグロビン濃度をもつ52個の臨
床試料を、Abbott Laboratories,Diagnostics Divisi
on,Santa Clara,CA.より現在市販されている全自動血
液分析器である較正Cell−Dyn（登録商標）3500システ
ムと、本発明で開発された全自動実験用血液分析器（本
発明の試薬及び方法を利用できるように任意の自動血液
分析器を容易に改造することができる）で分析した。Ce
ll−Dyn（登録商標）3500ヘモグロビン試薬はシアン化
カリウムを含有しており、血液ヘモグロビンの反応体は
シアンメトヘモグロブリンである。ヘモグロビン測定に
用いた全血希釈比は1:301であり、反応体の検出波長は5
40nmである。実験用ヘモグロビン試薬は脱イオン水中に
0.4モルのイミダゾール、0.1モルの水酸化ナトリウム及
び0.1％（w/v）のラウリルジメチルアミンオキシドを含
有する。無調整時の試薬のpHは13.0であった。市販シス
テムでCell−Dyn（登録商標）3500によるヘモグロビン
測定に用いた全血希釈比は1:125であり、反応時間は10
秒間である。変換された色素原の検出波長は540nmであ
る。次に、実験用分析器のヘモグロビン結果を線形回帰
分析によりCell−Dyn（登録商標）3500の結果と比較し
た。

図２の回帰統計から明らかなように、２種の方法の性
能はほぼ等価である。相関係数＝0.99、傾き＝0.97、及
びＹ切片＝0.34。

強い線形相関は、本発明が公知市販器具と厳密に同等
の結果を与えることを立証するものである。

実施例９ 12g/dL〜17.5g/dLのヘモグロビン濃度をもつ52個の臨
床試料を、市販の全自動血液分析器である較正Coulter
（登録商標）STKSシステムと、（実施例８に記載したよ
うな）本発明で開発された較正実験用血液分析器で分析
した。Coulter（登録商標）STKSヘモグロビン試薬はシ
アン化カリウムを含有し、血液ヘモグロビンの反応体は
シアンメトヘモグロビンである。反応体の検出波長は54
0nmである。実験用ヘモグロビン試薬は0.4モルのイミダ
ゾール、0.1モルの水酸化ナトリウム及び0.1％（w/v）
のラウリルジメチルアミンオキシドを含有する。無調整
時の試薬のpHは13.0であった。市販システムでヘモグロ
ビン測定に用いた全血希釈比は1:125であり、反応時間
は10秒間である。変換された色素原の検出波長は540nm
である。次に、実験用分析器のヘモグロビン結果を線形
回帰分析によりCoulter（登録商標）STKSの結果と比較
した。図３の回帰統計から明らかなように、２種の方法
の性能はほぼ等価である。相関係数＝0.98、傾き＝1.0
2、及びＹ切片＝−0.21。

強い線形相関は、本発明が周知の市販血液分析器具の
シアン化メトヘモグロビン法と厳密に同等の結果を与え
ることを立証するものである。

実施例10 脱イオン水中に0.4モルのイミダゾール、0.1モルの水
酸化ナトリウム及び0.1％（w/v）のラウリルジメチルア
ミンオキシドを含有するヘモグロビン試薬を新たに調製
し、この試薬を使用して、7.0〜17.6g/dLのヘモグロビ
ン濃度をもつ12個の臨床試料を（実施例８に記載したよ
うな）較正実験用分析システムで分析した。無調整時の
試薬のpHは13.0であった。同一の12個の試料を再較正せ
ずに、室温で６カ月間老化させた同一組成のヘモグロビ
ン試薬で再試験し、試薬の安定性を評価した。

対照試薬の結果を調製後６カ月の試験試薬の結果と比
較し、図４に線形回帰データを示す。２つの試験の間に
有意差は認められず、試薬は少なくとも６カ月間は室温
で安定であることが判明した。相関係数＝0.998、傾き
＝1.01、及びＹ切片＝−0.27。

実施例11 脱イオン水中に0.4モルのイミダゾール、0.1モルの水
酸化ナトリウム及び0.1％（w/v）のラウリルジメチルア
ミンオキシドを含有する本発明の試薬の安定性を調べる
ために、調製後１カ月未満の試薬での変換時間及び変換
された色素原のスペクトルを、45℃で３カ月間保存した
試薬と比較した。この試験では、新鮮な正常血液24μｌ
をキュベットに入れ、適当な試薬3.0mlを血清用ピペッ
トから迅速に加えた。次に、反応混合物をパスツールピ
ペットにより２回の吸引／分配サイクルで混合した。

結果を図５に示す。同図から明らかなように、混合は
10秒以内で完了した。反応を544（吸収最大）、580
（肩）、500（谷）及び700（濁り度標準）nm（頂部から
底部までのスペクトル）で追跡した。700nmの読み取り
値は溶解の完全性を示す。対照と45℃で保存した試薬は
同一の反応速度をもつことが明らかである。変換時間は
10秒未満であった。これらのデータからアレニウスの外
挿によると、本発明の試薬調製物は室温で１年間以上安
定であると推定される。

実施例12 較正Cell−Dyn（登録商標）3500システムで測定した
場合に15.8g/dLのヘモグロビン濃度をもつ正常血液試料
を使用し、本発明で脂肪血症試料がヘモグロビン測定値
に及ぼす濁り度干渉レベルを評価した。これは、ICSHシ
アンメトヘモグロビン法を含む多くの方法によるヘモグ
ロビン測定で周知の問題である。Lipid−Trol（PN＃L26
48）をSigma Chemical Companyから入手した。この製
品はトリグリセリド1330mg/dLとコレステロール840mg/d
Lを含有していた。臨床範囲を十分にカバーするように
下表に示すトリグリセリドとコレステロールの最終濃度
まで等張塩類溶液で製品の５種の希釈液を調製した。こ
れらの溶液20μｌ（対照調製物には塩類溶液20μｌを加
えた）を、実施例10に記載したような本発明のヘモグロ
ビン試薬で1:125に希釈した血液試料の希釈液に加え、
混合し、1cmキュベットを使用してTurner Model 690
分光光度計で540nm（ヘモグロビン）及び700nm（濁り
度）で各試料の光学密度を測定した。対照のヘモグロビ
ン値（同一血液試料のCell−Dyn（登録商標）3500シス
テムヘモグロビン値）を使用して各調製物中のヘモグロ
ビンの濃度を計算した。

本発明により変換された色素原の光学密度（O.D.）は
ヘモグロビンの濃度と線形関係があることに留意された
い。

データが示すように、これらの試料調製物にトリグリ
セリドとコレステロールを加えても、濁り度（700nmO.
D.）測定値にもヘモグロビン値（540nmO.D.）にも有意
差は観察されなかった。

実施例13 較正Cell−Dyn3500システムで測定した場合に15.6g/d
Lのヘモグロビン濃度をもつ正常血液試料を使用し、本
発明でビリルビン過剰血症患者の試料がヘモグロビン測
定値に及ぼすビリルビン干渉レベルを評価した。これ
は、NCCLSシアンメトヘモグロビン法を含む多くの方法
によるヘモグロビン測定で周知の問題である。ビリルビ
ン標準（カタログ番号550−11）をSigma Chemical Co
mpanyから入手した。この製品は、バイアル中の合計内
容物を脱イオン水1.5mlで再構成したときにビリルビン3
0mg/dLを含有していた。臨床範囲を十分にカバーするよ
うに下表に示すビリルビンの最終濃度まで等張塩類溶液
で製品の５種の希釈液を調製した。これらの溶液20μｌ
（対照調製物には塩類溶液20μｌを加えた）を、実施例
10に記載したような本発明のヘモグロビン試薬で1:125
に希釈した血液試料の希釈液に加え、混合し、1cmキュ
ベットを使用してTurner Model 690分光光度計で540n
m（ヘモグロビン）及び700nm（濁り度）で各試料の光学
密度を測定した。対照のヘモグロビン値（同一血液試料
のCell−Dyn3500システムヘモグロビン値）を使用して
各調製物中のヘモグロビンの濃度を計算した。本発明に
より変換された色素原のO.D.はヘモグロビンの濃度と線
形関係にあることに留意されたい。

データが示すように、これらの試料調製物にビリルビ
ンを加えても、濁り度（700nmO.D.）測定値にもヘモグ
ロビン値（540nmO.D.）にも有意な増加は観察されなか
った。この結果から明らかなように、ビリルビン過剰血
症患者の試料は本発明による全血ヘモグロビン濃度の測
定に干渉しない。

以上、本発明の例示の目的で所定の代表的な態様と詳
細を説明したが、請求の範囲に記載する発明の範囲内で
種々の変更及び変形が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ストループ，ステイーブン・デイー アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リ バテイービル、ルーズベルト・ドライ ブ・606 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/72

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】合計ヘモグロビン測定用無シアン化物試薬
   であって、 （ａ）濃度0.1〜2.0モルのイミダゾール、イミダゾール
   誘導体、Ｎ−ヒドロキシアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシ
   ルアミン、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、ピラ
   ゾール、ピリミジン、プリン、キノリン及びイソキノリ
   ンから構成される群から選択される無シアン化物配位子
   と、 （ｂ）濃度0.1％〜1.0％（w/v）の、ラウリルジメチル
   アミンオキシド及びオクチルフェノキシエタノールから
   構成される群から選択される界面活性剤 の水溶液からなり、試薬のpHが11〜14に調整されている
   ことを特徴とする前記試薬。
2. 【請求項２】界面活性剤がラウリルジメチルアミンオキ
   シドである請求項１に記載の試薬。
3. 【請求項３】ラウリルジメチルアミンオキシドが0.1％
   （w/v）の濃度で存在する請求項２に記載の試薬。
4. 【請求項４】配位子がイミダゾールである請求項１に記
   載の試薬。
5. 【請求項５】イミダゾールが0.4Mの濃度で存在する請求
   項１に記載の試薬。
6. 【請求項６】配位子がイミダゾールであり且つ界面活性
   剤がラウリルジメチルアミンオキシドである請求項１に
   記載の試薬。
7. 【請求項７】１価塩基を使用して試薬pHを調整する請求
   項１に記載の試薬。
8. 【請求項８】全血試料中の合計ヘモグロビン濃度を定量
   する無シアン化物方法であって、 （ａ）（ｉ）イミダゾール、イミダゾール誘導体、Ｎ−
   ヒドロキシアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシルアミン、ピ
   リジン、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリ
   ミジン、プリン、キノリン及びイソキノリンから構成さ
   れる群から選択される無シアン化物配位子と、（ii）ラ
   ウリルジメチルアミンオキシド及びオクチルフェノキシ
   エタノールから構成される群から選択される界面活性剤
   の水溶液からなり、１価塩基でpHを11〜14に調整した無
   シアン化物試薬を提供する段階と、 （ｂ）試料を無シアン化物試薬と迅速に混合して色素原
   を形成する段階と、 （ｃ）色素原を含む試料−試薬混合物を吸光度分光光度
   計に加える段階と、 （ｄ）試料−試薬色素原の光学密度を測定する段階と、 （ｅ）試料−試薬色素原の光学密度測定値から試料中の
   合計ヘモグロビン濃度を決定する段階を含む前記方法。
9. 【請求項９】光学密度の測定を540nm〜550nmで実施する
   請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】試薬配位子がイミダゾールである請求項
    ８に記載の方法。
11. 【請求項１１】イミダゾールが0.4Mの濃度で存在する請
    求項10に記載の方法。
12. 【請求項１２】試薬界面活性剤がラウリルジメチルアミ
    ンオキシドでる請求項８に記載の方法。
13. 【請求項１３】ラウリルジメチルアミンオキシドが0.1
    ％（w/v）の濃度で存在する請求項12に記載の方法。
14. 【請求項１４】試薬配位子がイミダゾールであり且つ試
    薬界面活性剤がラウリルジメチルアミンオキシドである
    請求項８に記載の方法。