DE69527947T2

DE69527947T2 - Cyanidfreies reagens und verfahren zur bestimmung von hämoglobin

Info

Publication number: DE69527947T2
Application number: DE69527947T
Authority: DE
Inventors: Ran Kim; D. Stroupe
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1994-03-11
Filing date: 1995-03-06
Publication date: 2003-05-28
Anticipated expiration: 2015-03-07
Also published as: EP0749583A1; US5612223A; ATE223059T1; WO1995024651A1; JP3523878B2; ES2184795T3; CA2183558A1; AU1984295A; CA2183558C; EP0749583B1; JPH09511575A; DE69527947D1; US5866428A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Reagenzien und Verfahren zur Verwendung bei der Bestimmung der Konzentration von Hämoglobin, das in einer Vollblutprobe vorhanden ist, entweder in manuellen Verfahren oder automatisierten Verfahren. Das spezifische Reagenz wandelt das gesamte Hämoglobin in der Probe schnell um in ein gut definiertes Chromogen zur Detektion und Messung, ohne die Verwendung von Cyanid.

Hintergrund der Erfindung

Die Wissenschaft der Hämatologie hat schon lange die Bedeutung der Messung der Menge von Hämoglobin in einer Blutprobe erkannt, da es das Hämoglobinmolekül ist, welches Sauerstoff von den Lungen zu den verschiedenen Geweben und Organen des Körpers transportiert. Die exakte Messung der Hämoglobinkonzentration im Blut eines Patienten ist möglicherweise der wichtigste Parameter, der in einer Hämatologieanalyse bestimmt wird. Die Hämoglobinkonzentration wird zum Screenen auf Anämie verwendet, welche wiederum ein Zeichen einer zugrundeliegenden Krankheit ist.
In Ländern mit einer "westlichen Ernährung" zeigt eine Hämoglobinkonzentration unter 14 -Gramm pro Deziliter (g/dl) für Männer und 12 g/dl für Frauen Anämie an. Es gibt viele Ursachen für Anämie, und eine niedrige Hämoglobinkonzentration ist ein starkes Signal für eine sorgfältige Bearbeitung durch den Arzt des Patienten. Deshalb ist ein genaues und zuverlässiges Verfahren zur Messung der Hämoglobinkonzentration ein wesentlicher Teil von jedem Hämatologiesystem. Die zwei häufigsten Gründe dafür, dass ein Patienten anämisch ist, sind Blutverlust und Ernährungsmängel an Eisen, Vitamin B12 oder Folsäure. In dem erstgenannten Fall ist es obligatorisch für den Arzt, die Ursache des Blutverlustes zu bestimmen und ihn zu behandeln. Und in dem letztgenannten Fall wiederum wird eine richtige Diagnose benötigt, um die geeignete Behandlung mit Nahrungsergänzung zu definieren.
Zusätzlich zu ihrer Bedeutung als primärer Indikator von Anämie wird die Hämoglobinkonzentration in Zusammenhang mit anderen Blutzell-Parametern verwendet, um mehrere Indizes zu berechnen. Das mittlere korpuskulare Hämoglobin (MCH = Mean Corpuscular Hemoglobin) ist die Masse von Hämoglobin pro rote Blutzelle und wird berechnet durch Dividieren der Hämoglobinkonzentration durch die Zahl der roten Blutzellen in dem Vergleichsvolumen. Die mittlere korpuskulare Hämoglobinkonzentration (MCHC = Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration) ist der Gewichtsanteil von Hämoglobin in einer roten Blutzelle in Prozent und wird berechnet durch Dividieren der Hämoglobinkonzentration durch das Hämatokrit und Umwandeln in Prozent. Sowohl MCH als auch MCHC sind nützliche Parameter in der Diagnose einer Anämie. Deren Bedeutung unterstreicht weiter die Notwendigkeit zur Durchführung einer genauen und zuverlässigen Messung der Hämoglobinkonzentration in einer Blutprobe.
Moderne Verfahren zur Messung des Hämoglobingehaltes nutzen Spektrophotometrie, um die Menge des sauerstofftragenden Proteins in der Probe quantitativ zu bestimmen. Die Anforderungen an jedes beliebige spektrophotometrische Verfahren, Hämoglobin in einer Blutprobe zu messen, sind zweifach:
1. Das Verfahren muss das gesamte Hämoglobin von der roten Blutzelle freisetzen, in welcher es abgesondert ist; und
2. Das Verfahren muss das gesamte Hämoglobin in der Probe in eine einzige chromogene Spezies umwandeln, egal in welcher Form sich das Hämoglobin befindet, wenn die Reaktion begonnen wird.
Die erste Anforderung kann erreicht werden durch viele Mittel; das einfachste ist, die Blutprobe in destilliertem Wasser zu verdünnen, um eine hypotonische Lyse zu bewirken. Jedoch benötigen moderne automatisierte Hämatologieinstrumente eine schnellere Lyse, als mit hypotonischer Lyse erreicht werden kann. Häufig werden oberflächenaktive Stoffe zu dem Lysereagenz hinzugegeben, um die Freisetzung von Hämoglobin zu beschleunigen und jede Trübheit zu klären, die in der Probe wegen eines erhöhten Lipidgehaltes vorhanden sein kann. Verschiedene Arten von oberflächenaktiven Stoffen sind für diese Aufgabe geeignet, einschließlich anionische, nicht-ionische, zwitterionische und kationische Stoffe. Die Menge an oberflächenaktivem Stoff kann sich erstrecken von ungefähr 100 mg/l bis ungefähr 50 g/l, abhängig von der "Wirksamkeit" des oberflächenaktiven Stoffs und der Ionenstärke des Reagenzes.
Die zweite Anforderung erfordert ein Verständnis der Chemie des Hämeisens, welches Sauerstoff trägt, wenn es in einem Globinproteinmolekül gebunden ist. Das Hämeisen wird in dem +2(FeII)-Oxidationszustand in einer normalen Blutprobe gehalten. Da die Blutprobe normalerweise von einer Vene genommen wird, ist das Hämoglobin größtenteils in einem Desoxy-Zustand; das heißt, es ist kein Sauerstoff an das Hämeisen gebunden. Sobald die Probe jedoch in Kontakt mit der Atmosphäre kommt oder in einem sauerstoffhaltigen Puffer oder Lysereagenz verdünnt wird, wird es schnell in Oxyhämoglobin umgewandelt; das Hämeisen bindet Sauerstoff, bleibt aber in dem (reduzierten) FeII-Zustand. In vielen Fällen könnte die Menge von Hämoglobin in der Probe bestimmt werden aus dem Oxyhämoglobinchromogen, welches nach Aussetzen gegenüber Luft natürlich gebildet wird. Jedoch gibt es einige Bedingungen, welche diese einfache Lösung unakzeptabel machen. Bei einigen Krankheiten, genetischen Zuständen oder Vergiftungen kann ein Patient eine signifikante Menge von Methämoglobin im Blutkreislauf haben. In Methämoglobin ist das Hämeisen in dem oxidierten +3(FeIII)-Zustand. Es kann weder keinen Sauerstoff binden, noch kann es schnell zu FeII reduziert werden, so dass es Sauerstoff binden könnte, um als Oxyhämoglobin gemessen zu werden. Außerdem akkumulieren starke Zigarettenraucher und Arbeiter, die hohen Konzentrationen von Autoabgasen ausgesetzt sind, häufig eine hohe Konzentration von Kohlenmonoxid, das an ihr Hämeisen gebunden ist. Kohlenmonoxid ist fest gebunden und blockiert die Bindung von Sauerstoff, wodurch ein Fehler in der Konzentration von Hämoglobin verursacht wird, falls sie durch das Oxyhämoglobin-Verfahren bestimmt wird. Der am häufigsten verwendete Ansatz zur Messung von Hämoglobin ist, das gesamte Hämeisen in den +3-Zustand zu oxidieren, und einen Liganden einzuführen, welcher an das gesamte Hämeisen quantita tiv bindet, um eine einzige chromogene Spezies zur quantitativen Bestimmung durch Spektrophotometrie zu produzieren.
Das klassische Verfahren ist das von Drabkin. Kurz gesagt, das Hämoglobin wird freigesetzt durch hypotonische Lyse (moderne Anwendungen haben zugesetzte oberflächenaktive Stoffe, um die Lyse zu beschleunigen), das Hämeisen wird oxidiert zu FeIII mittels Kaliumhexacyanoferrat(III), und das Eisen wird umgesetzt mit dem Cyanidanion von Kaliumcyanid. Cyanid bindet sehr fest an FeIII und ergibt ein charakteristisches Chromogen mit einem Peak bei ungefähr 540 nm. Jüngste Anwendungen haben die Streichung des oxidierenden Hexacyanoferrat(III)-Mittels eingeschlossen und sind abhängig von der Oxidation dem Hämeisens durch atmosphärischen Sauerstoff (oder durch sauerstoffausbalancierte Reagenzien) bei erhöhtem pH-Wert in der Anwesenheit von oberflächenaktiven Stoffen; Cyanid wird immer noch als der Hämeisen-Ligand in den meisten Verfahren verwendet, trotz seiner gut bekannten Toxizität.
Viele automatisierte Hämatologie-Analysengeräte nutzen eine Modifikation des Drabkin-Verfahrens. In diesen Verfahren werden rote. Blutzellen durch einen kationischen oberflächenaktiven Stoff bei einem pH-Wert über 10 in der Anwesenheit von Cyanid aufgelöst. Unter diesen Bedingungen bleiben weiße Zellkerne intakt und können durch gängige Impedanzverfahren gezählt werden. Hämoglobin wird gemessen, indem die optische Dichte der gleichen Lösung bei 540 nm gemessen wird, wie dies üblicherweise bei Drabkin-Verfahren erfolgt. Das Verfahren kann falsche Messungen in Proben ergeben, welche eine hohe weiße Zellzahl haben wegen der Trübheit infolge Streuung von Licht durch die Zellkerne. Lipämische und ikterische Proben können, infolge Trübheit oder erhöhter Extinktion der Probe ebenfalls die Messung stören. Die vorliegende Erfindung vermeidet diese Probleme, indem sie ein Reagenz bereitstellt, welches Hämoglobin frei von Störungen infolge von anderen Blutkomponenten misst.
Stroupe, et al., (US-Patent 4.200.435) offenbaren die Verwendung von Imidazol als einem Liganden zur Bestimmung von glykosyliertem Hämoglobin in der Anwesenheit eines allosterischen Effektors. Sie offenbaren auch die Verwendung eines oberflächenaktiven Lysemittels, eines Oxidationsmittels und eines Häm-bindenden Liganden, um die Menge von Hämoglobin in einer Probe zu bestimmen. Stroupe, et al. (US-Patent 4.255.385) offenbaren außerdem Reagenzkits, die die obigen Reagenzien enthalten. Die vorliegende Erfindung unterscheidet, sich von der, die offenbart wurde durch die Patente von Stroupe, et al., insofern, als dass sie kein zugesetztes Oxidationsmittel benötigt, und insofern, als dass die Reaktion innerhalb von 10 Sekunden abgeschlossen ist, im Gegensatz zu ungefähr 10 Minuten in der Erfindung nach dem Stand der Technik.
EP-A-0 444 241 offenbart ein cyanidfreies Hämoglobinreagenz mit einem pH-Wert im Bereich von 3,0 bis 9,0, das Imidazol in dem breiten Konzentrationsbereich von 1 bis 20.000 mg/Liter (0,015 mM bis 0,3 M) oder Pyrazol in dem breiten Konzentrationsbereich von 0,1 bis 10.000 mg/Liter (0,0015 mM bis 0,15 M) enthält. Die höchste Imidazolkonzentration, die in Dl (EP-A-0 444 241) als Beispiel diente, ist nicht größer als 0,015 M. D1 (EP-A-0 444 241) offenbart außerdem die Verwendung eines oberflächenaktiven Stoffs in dem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 15,0 g/Liter (0,01 bis 1,5% (m/V), wobei die möglichen oberflächenaktiven Stoffe Alkylphenoxypolyethoxyethanol einschließen.
Benezra, et al. (US-Patent 4.853.338) offenbaren ein cyanidfreies Hämoglobinreagenz, welches eine sehr hohe Konzentration eines oberflächenaktiven Stoffs (20 bis 50 g/l) und einen pH-Wert zwischen 11,3 und 13,7 umfasst. Von dem erhöhten pH, und der großen Menge an NaOH, die benötigt wird, um den gewünschten pH zu erhalten, kann abgeleitet werden, dass der Häm-bindende Ligand dieser Erfindung das Hydroxidanion ist. Falls der Hydroxidionengehalt des Reagenzes nicht hoch genug ist, wird das Häm nicht stöchiometrisch umgewandelt in ein einziges Chromogen, da Wasser, welches in hoher Konzentration (55 M) vorhanden ist, um die. Eisenbindungsstellen konkurrieren wird und ein fehlerhaftes Ergebnis ergeben kann. Die vorliegende Erfindung vermeidet dieses Problem.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein cyanidfreies Verfahren und Reagenz bereitzustellen zur Bestimmung von Gesamthämoglobin, das in einer Vollblutprobe vorhanden ist. Es ist ein weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein schnelles Verfahren zur Gesamthämoglobinbestimmung bereitzustellen, welches auf automatisierten Instrumenten verwendet werden kann. Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, ein kostenwirksames Reagenz zur Verfügung zu stellen. Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Gesamthämoglobinbestimmung in Vollblut ohne die Störung durch andere Blutkomponenten, bereitzustellen.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung und den folgenden Zeichnungen offensichtlich.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein cyanidfreies Reagenz zur Verwendung in einem Hämoglobinbestimmungsverfahren umfasst eine wässrige Lösung von (i) einem cyanidfreien Liganden gewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Imidazolderivaten, N-Hydroxyacetamid, N-Hydroxylamin, Pyridin, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin und Isochinolin, und der in einer 0,1 bis 2,0 molaren Konzentration vorhanden ist, und (ii) einen stark erythrolytischen oberflächenaktiven Stoff gewählt aus der Gruppe bestehend aus Lauryldimethylaminoxid und Octylphenoxypolyethoxyethanol, und der in einer Menge von ungefähr 0,1% bis ungefähr 1,0% (m/V) vorhanden ist, wobei der pH-Wert des Reagenzes auf 11-14 eingestellt ist, vorzugsweise mit einer monovalenten Base. Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird das cyanidfreie Reagenz schnell mit der Blutprobe gemischt, um ein Chromogen zu bilden. Die Extinktion, oder optische Dichte, des resultierenden Chromogens wird dann gemessen als ein Hinweis auf die Konzentration von Hämoglobin. Das in diesem Verfahren gebildete Chromogen kann in ungefähr zehn (10) Sekunden erhalten werden, wodurch es besonders gut zur Verwendung in automatisierten Instrumenten geeignet ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Spektrum von einer Probe, das unter Verwendung des Verfahrens und des Reagenzes der vorliegenden Erfindung angefertigt wurde.
Fig. 2 ist eine Korrelationsaufzeichnung von Hämoglobindaten, die unter Verwendung eines cyanidhaltigen Hämoglobinverfahrens erhalten wurden, das auf einem Cell-Dyn®-Analysengerät durchgeführt wurde, gegen das cyanidfreie Hämoglobinverfahren dieser Erfindung, welches auf einem experimentellen, automatisierten Hämatologie-Analysengerät durchgeführt wurde.
Fig. 3 ist eine Korrelationsaufzeichnung von Hämoglobindaten, die unter Verwendung des cyanidhaltigen Hämoglobinverfahrens erhalten wurden, das auf einem Coulter® STKS durchgeführt wurde, gegen das sofortige cyanidfreie Hämoglobinverfahren, welches auf einem experimentellen, automatisierten Hämatologie- Analysengerät durchgeführt wurde.
Fig. 4 ist eine Korrelationsaufzeichnung der Hämoglobindaten für eine frisch zubereitete Kontrolle des cyanidfreien Hämoglobinreagenzes dieser Erfindung gegen eine sechs (6) Monate alte Zubereitung des cyanidfreien Reagenzes.
Fig. 5A und Fig. 5B zeigen die Kinetik der Reaktion für eine Kontrolle und für das cyanidfreie Hämoglobinreagenz der vorliegenden Erfindung, wenn es bei 45ºC drei (3) Monate lang gelagert wurde.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das Reagenz der vorliegenden Erfindung wurde entwickelt zur Gesamthämoglobinanalyse, wenn sie auf einem automatisierten Hämatologieinstrument mit hohem Durchsatz verwendet wird.
Ein Reagenz, das zur Hämoglobinbestimmung nützlich ist, muss in der Lage sein, die Erythrozyten schnell aufzulösen und schnell mit dem Hämoglobin Komplexe zu bilden, so dass eine detektierbare Farbstruktur gebildet wird zur Detektion und Messung. Die vorliegende Erfindung ist besonders vorteilhaft, da der Komplex schnell gebildet wird und für einen Zeitraum stabil bleibt, der für automatisierte Instrumente angemessen ist. Der Reaktant ist viele Wochen lang stabil. Die vorliegende Erfindung ist außerdem besonders vorteilhaft, da das resultierende Chromogen frei von Störungen durch andere Blutkomponenten zu sein scheint und gemessen werden kann bei Wellenlängen im Spek tralbereich von automatisierten Hämatologieinstrumente, die bereits auf dem Gebiet existieren. Für Vergleichszwecke, das Cyanmethämoglobin-Verfahren misst typischerweise die Extinktion bei 540 nm. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein rötlichbraunes Chromogen gebildet werden, welches ein Absorptionsmaximum bei ungefähr 544 nm besitzt.
Das Reagenz der vorliegenden Erfindung ist eine wässrige Lösung einer Ligand-bildenden Verbindung wie Imidazol und Imidazolderivate. Die Ligand-bildende Verbindung ist in Konzentrationen von 0,1 bis 2,0 M vorhanden. Imidazol, aus der vorliegenden Erfindung, ligiert mit dem Hämoglobin, welches von den Erythrozyten in der Probe freigesetzt ist. Andere Ligandbildende Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen N-Hydroxyacetamid, M-Hydroxylamin, Pyridin, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin und Isochinolin. Anionen, welche das oxidierte Eisenhäm binden können, umfassen Cyanat, Fluorid, Azid, Nitrit, Hydroxid, Acetat und Format; akzeptable Salze von diesen Anionen umfassen Natrium, Kalium, Ammonium und dergleichen.
Das Reagenz enthält weiter einen oberflächenaktiven Stoff mit einer stark erythrolytischen Fähigkeit. Lauryldimethylaminoxid (Ammonix L. O.) [Stepan Chemical Company, Nortrifield, Illinois] und Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X 100) oder andere starke Detergenzien können als die oberflächenaktive Komponente des Lysereagenzes verwendet werden. Der oberflächenaktive Stoff sollte in Konzentrationen von ungefähr 0,1% bis ungefähr 1,0% (m/V) vorhanden sein. Der pH-Wert des Reagenzes sollte auf zwischen 11 und 14, vorzugsweise 12,5, eingestellt sein. Monovalente Basen wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid können zur pH-Einstellung verwendet werden.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das Lysereagenz mit einer Vollblutprobe im Verhältnis von ungefähr 50-1000 : 1 Reagenz zu Blut gemischt. Die Probe und das Reagenz können schnell gemischt werden, um Erythrolyse und Umwandlung von Hämoglobin in das Chromogen zu erreichen. Das Proben- und Reagenzgemisch kann dann einem Extinktions-Spektrophotometer präsentiert werden, worin die optische Dichte des gebildeten Chromogens gemessen wird. Wenn der Ligand Imidazol ist, kann die Messung zwischen 540 nm und 550 nm vorgenommen werden. Die Gesamthämoglobinkonzentration in der Probe wird auf die optische Dichte des umgewandelten Chromogens bezogen.
Die Erfindung wird jetzt beschrieben mit Bezug auf Beispiele, die beabsichtigt sind, den Umfang der beanspruchten Erfindung zu veranschaulichen und nicht zu begrenzen.

Beispiel 1

0,4 Mol Imidazol (27,2 g) (Sigma Chemical Company) und 0,1 Mol Natriumhydroxid (4,0 g) (Fisher Chemical Company) wurden zu ungefähr 900 ml destilliertem Wasser in einem Messzylinder hinzugegeben. Die Reagenzien wurden gelöst unter Verwendung eines Magnetrührers. 3,3 ml Lauryldimethylaminoxid (nicht- ionischer oberflächenaktiver Stoff, 30%ige Lösung, Stepan Chemical Company, Nortrifield, Illinois) wurde unter Rühren hinzugegeben und das Volumen auf 1000 ml durch Zugabe von destilliertem Wasser eingestellt. Die Lösung wurde durch ein 0,2-Micron-Nalgene-Filter filtriert und bei Raumtemperatur bis zur Verwendung aufbewahrt. Diese Formulierung wird nachfolgend als Imidazol 0.4 bezeichnet.
Weitere Reagenzien wurden auf die gleiche Art und Weise hergestellt, außer dass die Menge von Imidazol zwischen 0,1 Mol (6,8 g) und 1,0 Mol (68,1 g) variiert wurde. Diese Formulierungen werden nachfolgend als Imidazol "X" bezeichnet, wobei "X" auf die molare Konzentration verweist.

Beispiel 2

Zwölf Mikroliter (12 ul) Vollblut wurden mit 3,0 ml Imidazol 0.4 gemischt. Das Absorptionsspektrum wurde von 780 nm bis 480 nm mit einem Hewlett Packard 8452 A Dioden-Array- Spektrophotometer ("HP") aufgezeichnet. Fig. 1 zeigt einen Peak bei 544 nm mit einer Schulter um 580 nm herum. Zum Vergleich sind die Spektren von Oxy- und -Desoxyhämoglobin bei der gleichen Konzentration eingeschlossen.

Beispiel 3

Zwölf Mikroliter (12 ul) Vollblut wurden mit 3,0 ml Imidazolreagenzien im Bereich von 0,1 bis 1,0 M schnell gemischt. Die Extinktion wurde bei 544 nm 60 Sekunden lang überwacht. Die Änderung der Extinktion zwischen 10 Sekunden nach dem Mischen und 60 Sekunden nach dem Mischen wurde gemessen und als "Drift" tabellarisiert.

Beispiel 4

Eine Reihe von Formulierungen mit variierenden Konzentrationen von NaOH, oberflächenaktivem Stoff und Imidazol wurden hergestellt und auf Vollständigkeit der Lyse und Stabilität des Signals getestet. Zwölf Mikroliter (12 ul) Vollblut wurden mit Reagenz gemischt. Die Extinktion wurde beobachtet bei 700 nm auf Vollständigkeit der Lyse und bei 544 nm auf Vollständigkeit der Umwandlung in Chromogen. Eine Vollständigkeit der Lyse wird angezeigt durch ein "+"; die Anwesenheit einer Drift wird angezeigt durch ein "+"; "++" zeigt deutliche Drift an.
Obwohl es wünschenswert ist, dass die Reaktion innerhalb eines kurzen Zeitraums vollständig ist, das heißt vollständige Lyse und Fehlen einer Drift, ist es möglich, ein driftendes Signal zu verwenden, falls der Zeitpunkt von Reagenz-Zugabe und Extinktionsmessung gesteuert wird.

Beispiel 5

Für dieses Beispiel und die Beispiele 6 und 7 wurde ausschließlich Imidazol 0.4 verwendet. Manipulierte Blutproben wurden hergestellt, um einen Bereich von Hämatokritwerten zu ergeben. Die Proben wurden hergestellt, indem eine mit EDTA gerinnungsgehemmte Blutprobe bei 500 g 10 Minuten lang zentrifugiert wurde. Das Plasma wurde zu einer normalen Blutprobe hinzugegeben, um eine verringerte Hämatokritprobe herzustellen. Die Leukozyten- und Thrombozytenschicht wurde aufgehoben, um eine Probe mit erhöhter weißer Blutzellzahl mit einem normalen Hämatokritwert zu ergeben. Die sedimentierten roten Blutzellen wurden als eine erhöhte Hämatokritprobe analysiert. Hämatokritwerte und weiße Blutzellzahlen wurden auf einem Baker 4000 Analysengerät bestimmt. Die Extinktion der Probe, die 1 : 251 mit Imidazol 0.4 verdünnt war, wurde bei 540 nm auf einem Hewlett Packard 8452A Dioden-Array-Spektrophotometer abgelesen. Die Ergebnisse sind unten angezeigt.

Beispiel 6

Ein Kit zur Bestimmung von Hämoglobin durch das Verfahren von Drabkin wurde verwendet, um die Leistung des Imidazol-0.4- Reagenzes mit einem eingeführten Referenzverfahren zu vergleichen. Der Kit, Katalog-Nr. 525-A, wurde erhalten von Sigma Diagnostics, P. O. Box 14508, St. Louis, Missouri, 63178, und wurde gemäß den Anweisungen zur ursprünglichen Konzentration verdünnt und verwendet.
Eine normale Probe von Vollblut wurde manipuliert, um Hämoglobinkonzentrationen von null bis ungefähr 20 g/dl zu ergeben. Proben wurden durch das Drabkin-Verfahren und unter Verwendung von Imidazol 0.4 analysiert. Die Drabkin-Probe wurde bei einem Verhältnis von 1 zu 251 umgesetzt und das Imidazol 0.4 bei einem Verhältnis von 1 zu 101. Alle Reaktionsgemische wurden bei 540 nm in einem Hewlett Packard Dioden-Array-Spektrophotometer abgelesen. Obwohl die Imidazol-0.4-Reaktion innerhalb von 10 Sekunden vollständig ist, wurden die Reaktionsgemische ungefähr 30 Minuten lang vor dem Ablesen aus Bequemlichkeit inkubieren gelassen.
Der Korrelationskoeffizient des Imidazol-0.4-Reagenzes mit dem Drabkin-Reagenz ist r = +0,9976, die Steigung ist 75,2 mA/g/dl, und der Achsenabschnitt ist -12,0 mA. Die hervorragende lineare Korrelation des A540-Wertes, der durch das Imidazol-0.4- Reagenz geliefert wird, mit dem Standard-Drabkin-Reagenz zeigt die Gleichwertigkeit von Ergebnissen durch die beiden Verfahren und erlaubt die Verwendung der ungiftigen Formulierung der gegenwärtigen Erfindung anstelle des cyanidhaltigen Standard- Verfahrens.

Beispiel 7

Das Imidazol-0.4-Reagenz wurde verglichen mit einem kommerziell erhältlichen, halbautomatisierten Hämatologie-Analysengerät, dem Coulter®b JT, unter Verwendung der Reagenzien Lysis S® III (welches Kaliumcyanid enthält) und Isoton® III [alle von Coulter Diagnostics, Hialeah, Florida]. Eine Reihe von manipulierten Vollblutproben wurde wie oben hergestellt, mit Hämoglobinkonzentrationen im Bereich von 0 bis ungefähr 25 g/dl. Die Proben wurden auf dem Coulter® JT-Analysengerät analysiert, wie in dem Gerätehandbuch beschrieben. Das Imidazol-0.4-Reagenz wurde umgesetzt mit Proben bei einem Verhältnis von 1 zu 126, indem 40 Mikroliter (40 ul) Blutprobe unter Verwendung einer positiven Verdrängungspipette (Absoluter Pipettor, Tri-Continent Scientific Company, Grass Valley, Kalifornien) in ein Röhrchen abgegeben wurden und 5,0 ml des Imidazol-0.4-Reagenzes mit einem Eppendorf-Repipettor (Brinkman Instruments, Inc., Westbury, N. Y.) hinzugegeben wurden. Die Extinktion der umgesetzten Proben bei 540 nm wurde abgelesen auf einem Beckman DU-7 Spektrophotometer (Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornien), der mit einem Nipper ausgerüstet war. Die Bestimmungen mit dem Imidazol 0.4 wurden zweifach durchgeführt und die Ergebnisse gemittelt.
Die starke lineare Korrelation (Korrelationskoeffizient r = 0,9998; Steigung m = 49,94 mA/g/dl, Achsenabschnitt b = 4,4 mA) zeigt, das die gegenwärtige Erfindung Ergebnisse liefert, die völlig vergleichbar sind mit denen des bekannten kommerziellen Instrumentes.

Beispiel 8

Zweiundfünfzig klinische Proben, deren Hämoglobinkonzentration von 12 g/dl bis 17,5 g/dl reichte, wurden auf einem kalibrierten Cell-Dyn® 3500-System analysiert, einem voll automatisierten Hämatologie-Analysengerät, das derzeit verkauft wird durch Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Santa Clara, CA., und ebenfalls auf einem voll automatisierten experimentellen Hämatologie-Analysengerät, das zusammen mit der gegenwärtigen Erfindung in Entwicklung ist. (Jedoch könnte jedes beliebige automatisierte Hämatologie-Analysengerät leicht ange passt werden, um das Reagenz und das Verfahren dieser Erfindung zu akzeptieren.) Das Hämoglobinreagenz von Cell-Dyn® 3500 enthält Kaliumcyanid und der Reaktant von Bluthämoglobin ist Cyanmethämoglobin. Der Vollblutverdünnungsfaktor zur Hämoglobin- Messung ist 1 : 301 und die Detektionswellenlänge des Reaktanten ist 540 nm. Das experimentelle Hämoglobinreagenz enthält 0,4 Mol Imidazol, 0,1 Mol Natriumhydroxid und 0,1% (m/V) Lauryldimethylaminoxid in deionisiertem Wasser. Der pH-Wert des Reagenzes war 13,0 ohne Einstellung. Der Vollblutverdünnungsfaktor für die Cell-Dyn® 3500-Hämoglobin-Messung in dem System ist 1 : 125 und die Reaktionszeit ist 10 Sekunden. Die Detektionswellenlänge des umgewandelten Chromogens ist 540 nm. Die Hämoglobinergebnisse des experimentellen Analysengerätes wurden dann mit denen des Analysengerätes Cell-Dyn® 3500 durch lineare Regressionsanalyse verglichen.
Wie in der Regressionsstatistik in der Fig. 2 gesehen werden kann, ist die Leistung der zwei Verfahren im Wesentlichen gleichwertig. Korrelationskoeffizient = 0,99; Steigung = 0,97; und Y-Achsenabschnitt = 0,34.
Die starke lineare Korrelation zeigt, dass die gegenwärtige Erfindung Ergebnisse liefert, die völlig vergleichbar sind mit denen des bekannten kommerziellen Instrumentes.

Beispiel 9

Zweiundfünfzig klinische Proben, deren Hämoglobinkonzentration von 12 g/dl bis 17,5 g/dl reichte, wurden auf einem kalibrierten Coulter® STKS-System analysiert, einem voll automatisierten Hämatologie-Analysengerät auf dem Markt, und ebenfalls auf einem kalibrierten experimentellen Hämatologie-Analysengerät, das zusammen mit der gegenwärtigen Erfindung in Entwicklung ist (wie in Beispiel 8). Das Hämoglobinreagenz von Coulter® STKS enthält Kaliumcyanid und der Reaktant von Bluthämoglobin ist Cyanmethämoglobin. Die Detektionswellenlänge des Reaktanten ist 540 nm. Das experimentelle Hämoglobinreagenz enthält 0,4 Mol Imidazol, 0,1 Mol Natriumhydroxid und 0,1% (m/V) Lauryldimethylaminoxid. Der pH-Wert des Reagenzes war 13,0 ohne Einstellung. Der Vollblutverdünnungsfaktor für Hämoglobin in dem System ist 1 : 125 und die Reaktionszeit ist 10 Sekunden. Die Detektionswellenlänge des umgewandelten Chromogens ist 540 nm. Die Hämoglobinergebnisse des experimentellen Analysengerätes wurden dann mit denen des Analysengerätes Coulter® STKS durch lineare Regressionsanalyse verglichen. Wie in der Regressionsstatistik in der Fig. 3 gesehen werden kann, ist die Leistung der zwei Verfahren im Wesentlichen gleichwertig. Korrelationskoeffizient = 0,98; Steigung = 1,02; und Y-Achsenabschnitt = -0,21.
Die starke lineare Korrelation zeigt, dass die gegenwärtige Erfindung Ergebnisse liefert, die völlig vergleichbar sind mit denen des Cyanmethämoglobin-Verfahrens des gut bekannten kommerziellen Instrumentes.

Beispiel 10

Zwölf klinische Proben, deren Hämoglobinkonzentration von 7,0 bis 17,6 g/dl reichte, wurden auf einem kalibrierten experimentellen Analysengerätesystem (wie in Beispiel 8) analysiert, und zwar unter Verwendung eines frisch hergestellten Hämoglobinreagenzes, das 0,4 Mol Imidazol, 0,1 Mol Natriumhydroxid und 0,1% (m/V) Lauryldimethylaminoxid in deionisiertem Wasser enthält. Der pH-Wert des Reagenzes war 13,0 ohne Einstellung. Die gleichen zwölf Proben wurden wieder laufen gelassen, ohne Neukalibrierung, mit einem Hämoglobinreagenz der gleichen Zusammensetzung, das aber bei Raumtemperatur sechs Monate lang gealtert war, um die Stabilität des Reagenzes zu bewerten.
Die Ergebnisse des Kontrollreagenzes wurden mit denen des sechs Monate alten Testreagenzes verglichen und die linearen Regressionsdaten sind in der Fig. 4 dargestellt. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den zwei Läufen festgestellt, wodurch angezeigt wird, dass das Reagenz mindestens sechs Monate bei Raumtemperatur stabil ist. Korrelationskoeffizient = 0,998; Steigung = 1,01; und Y-Achsenabschnitt = -0,27.

Beispiel 11

Um die Stabilität des Reagenzes der vorliegenden Erfindung zu prüfen, das 0,4 Mol Imidazol, 0,1 Mol Natriumhydroxid und 0,1% (m/V) Lauryldimethylaminoxid in deionisiertem Wasser enthält, wurden die Umwandlungszeit und das Spektrum des umgewandelten Chromogens bei einem weniger als einem Monat alten Reagenz verglichen mit denen des Reagenzes, das drei Monate lang bei 45ºC aufbewahrt wurde. Für diese Untersuchung wurden vier- undzwanzig Mikroliter (24 ul) von frischem normalen Blut in eine Küvette gebracht und 3,0 ml des jeweiligen Reagenzes aus einer serologischen Pipette schnell hinzugegeben. Dann wurde das Reaktionsgemisch durch zwei Ansaug-/Abgabezyklen mit einer Pasteur- Pipette gemischt.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 5 dargestellt. Wie durch die Aufzeichnung nachgewiesen war das Mischen innerhalb von 10 Sekunden abgeschlossen. Die Reaktion wurde bei 544 (max. Absorption), 580 (Schulter), 500 (Tal) und 700 (Trübung s prüfung) nm verfolgt (Linien von oben nach unten). Die 700-nm-Ablesung zeigt die Vollständig der Lyse an. Sowohl das Kontrollreagenz als auch das bei 45ºC gelagerte Reagenz scheinen identische Kinetiken der Reaktion zu haben. Die Umwandlungszeit war kleiner als 10 Sekunden. Arrhenius-Extrapolation aus diesen Daten zeigt an, dass die Reagenzzubereitung der gegenwärtigen Erfindung über ein Jahr lang bei Raumtemperatur stabil ist.

Beispiel 12

Eine normale Blutprobe mit einer Hämoglobinkonzentration von 15,8 g/dl, wie bestimmt auf einem kalibrierten Cell-Dyn® 3500-System, wurde verwendet, um den Anteil der Trübungsstörung bei der Hämoglobin-Messung einer lipämischen Probe in der gegenwärtigen Erfindung zu bewerten. Das ist ein bekanntes Problem bei der Hämoglobin-Messung durch viele Verfahren einschließlich dem ICSH-Cyanmethämoglobin-Verfahren. Lipid-Trol (PN-Nr. L2648) wurde von Sigma Chemical Company erhalten. Das Produkt enthielt 1330 mg/dl Triglycerid und 840 mg/dl Cholesterol. Fünf (5) Verdünnungen des Produktes wurden mit isotonischer Salzlosung vorgenommen bis zu den Endkonzentrationen für Triglycerid und Cholesterol, die in der Tabelle unten angezeigt sind, um den klinischen Bereich ausreichend abzudecken. Zwanzig Mikroliter (20 ul) dieser Lösungen (20 Mikroliter (20 ul) Salzlösung wurde zu der Kontroll Zubereitung hinzugegeben) wurden zu der 1 : 125- Verdünnung der Blutprobe mit dem Hämoglobinreagenz der gegenwärtigen Erfindung wie in Beispiel 10 hinzugegeben, gemischt, und die optischen Dichten von jeder Probe wurden unter Verwendung einer 1-cm-Kuvette bei 540 nm (auf Hämoglobin) und 700 nm (auf Trübheit) in einem Turner Model 690-Spektrophotometer gemessen. Die Konzentration von Hämoglobin in jeder Zubereitung wurde unter Verwendung des Hämoglobinwertes der Kontrolle (Cell-Dyn® 3500-System-Hämoglobinwert für die gleiche Blutprobe) berechnet.
Beachten Sie, dass die optische Dichte (O. D.) des umgewandelten Chromogens der gegenwärtigen Erfindung ein lineares Verhältnis zu der Konzentration von Hämoglobin aufweist.
Wie die Daten zeigen, wurde kein signifikanter Unterschied weder bei der Trübungsmessung (O. D. bei 700 nm) noch bei dem Hämoglobinwert (O. D. bei 540 nm) infolge der Zugabe von Triglycerid und Cholesterol in diesen Probenzubereitungen beobachtet.

Beispiel 13

Eine normale Blutprobe mit einer Hämoglobinkonzentration von 15,6 g/dl, wie bestimmt auf einem kalibrierten Cell-Dyn® 3500-System, wurde verwendet, um den Anteil der Bilirubinstörung bei der Hämoglobin-Messung einer Probe eines hyperbilirubinämischen Patienten in der gegenwärtigen Erfindung zu bewerten. Das ist ein bekanntes Problem bei der Hämoglobin-Messung durch viele Verfahren einschließlich dem NCCLS-Cyanmethämoglobin-Verfahren. Ein Bilirubin-Standard (Katalog-Nr. 550-11) wurde erhalten von Sigma Chemical Company. Das Produkt enthielt 30 mg/dl Bilirubin, wenn der gesamte Inhalt in dem Glasfläschchen mit 1,5 ml deionisiertem Wasser zur ursprünglichen Konzentration verdünnt wurde. Fünf Verdünnungen des Produktes wurden mit isotonischer Salzlösung bis zu den Endkonzentrationen für Bilirubin, die in der Tabelle unten angezeigt sind, vorgenommen, um den klinischen Bereich ausreichend abzudecken. Zwanzig Mikroliter (20 ul) dieser Lösungen (20 Mikroliter (20 ul) Salzlösung wurde zu der Kontroll Zubereitung hinzugegeben) wurden zu der 1 : 125-Verdünnung der Blutprobe mit dem Hämoglobinreagenz der gegenwärtigen Erfindung wie in Beispiel 10 hinzugegeben, gemischt, und die optischen Dichten von jeder Probe wurden gemessen unter Verwendung einer 1-cm-Küvette bei 540 nm (auf Hämoglobin) und 700 nm (auf Trübheit) in einem Turner Model 690-Spektrophotometer. Die Konzentration von Hämoglobin in jeder Zubereitung wurde berechnet unter Verwendung des Hämoglobinwertes der Kontrolle (Cell-Dyn® 3500-System-Hämoglobinwert für die gleiche Blutprobe). Beachten Sie, dass die optische Dichte (O. D.) des umgewandelten Chromogens der gegenwärtigen Erfindung ein lineares Verhältnis zu der Konzentration von Hämoglobin aufweist.
Wie die Daten zeigen, wurde kein signifikanter Unterschied weder bei der Trübheit (O. D. bei 700 nm) noch bei dem Hämoglobinwert (O. D. bei 540 nm) infolge der Zugabe von Bilirubin in diesen Probenzubereitungen beobachtet. Die Ergebnisse zeigen an, dass Proben von hyperbilirubinämischen Patienten mit der gegenwartigen Erfindung die Bestimmung der Gesamtbluthämoglobinkonzentration nicht stören werden.
Während bestimmte repräsentative Ausführungsformen und Details zum Zweck der Veranschaulichung der Erfindung gezeigt wurden, können verschiedene Änderungen und Modifikationen darin vorgenommen werden, ohne sich vom Schutzumfang der Erfindung zu lösen, die in den Ansprüchen definiert ist.

Claims

1. Ein cyanidfreies Reagenz zur Verwendung in der Gesamthämoglobin-Messung, das eine wässerige Lösung umfasst, die aus folgendem besteht:

(a) einen cyanidfreien Liganden gewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Imidazolderivaten, N-Hydroxyacetamid, N- Hydroxylamin, Pyridin, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin und Isochinolin, und der Ligand ist in einer 0,1 bis 2,0 molaren Konzentration vorhanden; und

(b) einen oberflächenaktiven Stoff gewählt aus der Gruppe bestehend aus Lauryldimethylaminoxid und Octylphenoxypolyethoxyethanol, vorhanden in einer Konzentration von 0,1% bis 1,0% (m/V), wobei der pH-Wert des Reagenzes auf zwischen 11 und 14 eingestellt ist.

2. Das Reagenz von Anspruch 1, worin der oberflächenaktive Stoff Lauryldimethylaminoxid ist.

3. Das Reagenz von Anspruch 2, worin das Lauryldimethylaminoxid in einer Konzentration von ungefähr 0,1% (m/V) vorhanden ist.

4. Das Reagenz von Anspruch 1, worin der Ligand Imidazol ist.

5. Das Reagenz von Anspruch 1, worin das Imidazol in einer Konzentration von ungefähr 0,4 M vorhanden ist.

6. Das Reagenz von Anspruch 1, worin der Ligand Imidazol ist und der oberflächenaktive Stoff Lauryldimethylaminoxid ist.

7. Das Reagenz von Anspruch 1, worin der pH-Wert des Reagenzes eingestellt ist unter Verwendung einer monovalenten Base.

8. Ein cyanidfreies Verfahren zur Bestimmung der Gesamthämoglobin-Konzentration in einer Vollblut-Probe, das folgende Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen eines cyanidfreien Reagenzes, das eine wässerige Lösung umfasst, die aus folgendem besteht:

(i) einem cyanidfreien Liganden gewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Imidazolderivaten, N-Hydroxyacetamid, N- Hydroxylamin, Pyridin, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin und Isochinolin, worin der Ligand in einer 0,1 bis 2,0 molaren Konzentration vorhanden ist; und

(ii) einem oberflächenaktiven Stoff gewählt aus der Gruppe bestehend aus Lauryldimethylaminoxid und Octylphenoxypolyethoxyethanol, wobei der oberflächenaktive Stoff in einer Konzentration von 0,1% bis 1,0% (m/V) vorhanden ist, wobei der pH-Wert des Reagenzes mit einer monovalenten Base auf zwischen 11 und 14 eingestellt ist;

(b) Schnelles Mischen einer Vollblutprobe mit dem cyanidfreien Reagenz, um eine Probe-Reagenz-Mischung zu bilden, die ein Chromogen enthält;

(c) Zuführen der Probe-Reagenz-Mischung, die das Chromogen enthält, an einen Absorptionsspektrometer;

(d) Messen der Extinktion des Probe-Reagenz-Chromogens; und

(e) Bestimmen der Gesamthämoglobin-Konzentration in der Probe aus der gemessenen Extinktion des Probe-Reagenz-Chromogens.

9. Das Verfahren von Anspruch 8, worin die Messung der Extinktion bei 540 nm und 550 nm durchgeführt wird.

10. Das Verfahren von Anspruch 8, worin der cyanidfreie Ligand Imidazol ist.

11. Das Verfahren von Anspruch 10, worin das Imidazol in einer Konzentration von 0,4 M vorhanden ist.

12. Das Verfahren von Anspruch 8, worin der oberflächenaktive Stoff Lauryldimethylaminoxid ist.

13. Das Verfahren von Anspruch 12, worin das Lauryldimethylaminoxid in einer Konzentration von 0,1% (m/V) vorhanden ist.

14. Das Verfahren von Anspruch 8, worin der cyanidfreie Ligand Imidazol ist und der oberflächenaktive Stoff des Reagenzes Lauryldimethylaminoxid ist.