DE2943423C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur direkten Bestimmung
von Eisen in einer Blutserumprobe mit Ferrozin in Gegenwart
eines Reduktionsmittels durch kolorimetrische Bestimmung des
gebildeten Komplexes. Die Erfindung betrifft weiterhin ein
Ferrozin, Thiosemicarbazid und Ascorbinsäure enthaltendes
Reagenz zur Bestimmung von Eisen im Blutserum.
Es sind bereits mehrere Methoden zur Direktbestimmung von
Eisen im Blutserum bekannt. Einige dieser Methoden bauen sich
auf der Möglichkeit auf, daß gefärbte Komplexe zwischen zwei
wertigen Eisenionen und Komplexbildnern, wie z. B. BP (4,7-
Diphenyl-1,10-phenantrolin), TPTZ (2,4,6-Tris-(2-pyridyl)-
s-triazin) und Ferrozin [Dinatriumsalz von 3-(2-Pyridyl)-
5,6-bis-(4-sulfophenyl)-s-triazin; vgl. L. L. Stookey "Analytical
Chemistry" 42, Nr. 7, 779, 1970] gebildet werden und
daß der gebildete Komplex spektrophotometrisch bestimmt
wird. In speziellen Literaturstellen wird festgestellt, daß
Ferrozin besonders gut geeignet ist, da es mit zweiwertigem
Eisen einen gefärbten Komplex mit sehr hoher Absorption (ε =
27, 100), der in Wasser löslich und bei einem pH-Wert zwischen
3,5 und 11 und vorzugsweise zwischen 4 und 9 stabil ist,
bildet.
Die meisten Bestimmungsmethoden für Eisen im Serum, die
bereits bekannt sind, erfordern folgendes: (1) Die Dissoziation
von Eisen vom Serumtransferrin durch Behandlung mit
einer starken Mineralsäure in Gegenwart eines Reduktionsmittels,
(2) die Deproteinisierung von Serum durch Ausfällung
der Proteine, z. B. mit Trichloressigsäure, (3) die
Bestimmung der zweiwertigen Eisenionen, die in der Lösung
zurückbleiben, durch Farbreaktion mit Ferrozin, nachdem der
pH-Wert der Lösung mit Puffer auf einen Wert zwischen 3 und
6 eingestellt worden ist (vgl. P. Carter "Anal. Biochem.",
40, 450, 1971).
Andere Methoden sind als Direktmethoden bekannt, und sie erfordern
keine Ausfällung der Proteine (vgl. z. B. J. P. Persÿn
et al. "Clin. Chim. Acta" 35, 91, 1971; J. M. White et
al. "Clin. Chem.", Band 19, Nr. 5, 526, 1973; R. Ruutu "Chlin.
Chim. Acta" 61, 229, 1975).
Bei diesen Methoden werden im allgemeinen Puffer in einem
pH-Bereich verwendet, der dem isoelektrischen Punkt der meisten
der Serumproteine und daher dem Instabilitätsmaximum
entspricht. Die Ausfällung von Proteinen, die die Analysen
ergebnisse stark stören würde, wird durch Zugabe von ober
flächenaktiven Mitteln verhindert. Diese sollten auch die Ablösung
des Eisens von dem Transferrin bewirken, ohne daß der
pH-Wert erniedrigt wird. Jedoch gestattet die variable Protein
zusammensetzung der verschiedenen Seren nicht in jedem Fall einen
gleichförmigen und stabilen Schutz gegenüber der Ausbildung einer
Trübung. Tatsächlich werden individuelle Unterschiede
nicht dadurch behoben, daß man die Anfangsabsorption
oder diejenige der Blindprobe abliest, weil in manchen
Fällen eine unvorhersehbare Trübung des gefärbten Komplexes
auftreten kann. Dazu kommt noch, daß die Freisetzung des
Eisens von dem Transferrin nicht vollständig sein kann, wodurch
fehlerhaft niedrige Werte erhalten werden. Aus den
obigen Gründen hat das Expertengremium für Eisen des Internationalen
Komitees zur Standardisierung der Hämatologie
als Referenzserumeisenmethode alle derzeit bekannten
zahlreichen Direktmethoden ohne Proteinausfällung zurückgewiesen
(vgl. E. W. Rice et al. "Clin. Chim. Acta" 53, 391, 1974).
Andererseits verlängert die Serumdeproteinisierung die Verfahrens
weise empfindlich, und sie stellt eine kritische Stufe
dar, da die Serumfiltrate nach der Ausfällung der Proteine
nicht vollständig klar sein können. Weiterhin ist ein
konzentrierter Puffer notwendig, um den pH-Wert in einem Bereich
einzustellen, der für die chromogene Reaktion geeignet
ist, was eine Quelle für Eisenverunreinigung sein kann.
Die Anwesenheit von Kupfer, die bei bestimmten pathologischen
Umständen sehr hohe Werte erreichen kann, kann spektrophoto
metrische Methoden, insbesondere diejenigen, die sich auf
der Verwendung von Ferrozin aufbauen, stark stören (vgl.
Hugh et al. "Chlin. Chem." Band 17, Nr. 9, 950, 1971; J. R.
Duffy et al. "Chlin. Biochem." 10, 122, 1977)
Durch die Erfindung wird nun ein Verfahren und ein Reagenz
das in Form eines diagnostischen Bestecks verwendet werden
kann, zur Bestimmung von Eisen in Serum zur Verfügung gestellt,
ohne daß eine Deproteinisierung und Abtrennung von
Eisen erforderlich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren und
die erfindungsgemäßen Reagentien haben auch den Vorteil,
daß die Freisetzung des Eisens von dem Transferrin vollständig
ist und bei einem niederen pH-Wert ohne Zugabe von
Puffern in Gegenwart eines Reduktionsmittels und bei Versuchs
bedingungen erhalten wird, die eine vollständige und
rasche Entwicklung des gefärbten Komplexes ohne Bildung
einer Trübung gestatten, wodurch die Verwendung von tensio
aktiven bzw. oberflächenaktiven Mitteln vermieden wird. Das
erfindungsgemäße Verfahren ist sehr einfach und kann leicht
automatisiert werden.
Der Erfindung liegen folgende überraschende Feststellungen
zugrunde: 1) Bei Zugabe von Salzsäure zu Serum, um einen
pH-Wert von 2,1 oder niedriger zu erreichen, bildet sich
keine Trübung; und 2) die Reaktion zwischen Ferrozin und
Eisen ist selbst bei diesem pH-Wert vollständig, wodurch
sehr genaue Messungen des Eisengehalts im Serum durch kolo
rimetrische Bestimmungen gestattet werden.
Es wurde weiterhin gefunden, daß die Anwesenheit von Thiose
micarbazid bei diesen Bedingungen alle Störungen durch Kupfer
eliminiert, ohne daß die Eisenbestimmung negativ beeinflußt
oder in ungeeigneter Weise kompliziert wird.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur direkten
Bestimmung von Eisen in einer Blutserumprobe mit
Ferrozin in Gegenwart eines Reduktionsmittels durch kolo
rimetrische Bestimmung des gebildeten Komplexes, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß zu der Probe auch Thiosemicarbazid
und Salzsäure hinzugefügt werden und daß man die
Umsetzung bei einem pH-Wert zwischen 1,7 und 2,1 unter
Vermeidung einer Zugabe von Puffern und oberflächenaktiven
Mitteln durchführt.
Im einzelnen geht man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
so vor, daß eine Probe, die das zu bestimmende Eisen
enthält, mit Salzsäure versetzt wird, um den pH-Wert
auf einen Wert zwischen 1,7 und 2,1 zu bringen. Ein
Reduktionsmittel, damit die Eisenionen in zweiwertige
Form gebracht werden, Ferrozin und Thiosemicarbazid
werden gleichfalls zu der zu testenden Serumprobe gegeben.
Nach beendigter Zugabe dieser Reagenzien wird die
Probe sorgfältig vermischt, und hierauf wird nach 5- bis
20minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur der Eisengehalt
der Probe kolorimetrisch mittels des gefärbten
Komplexes bestimmt.
Demgemäß wird die Absorption bei 562 nm gegen eine Reagenz
blindprobe, d. h. eine Probe, die das gleiche Gemisch wie
oben, jedoch ohne Ferrozin enthält gemessen. Die Bestimmung
des Eisengehalts erfolgt anhand einer Standardkurve,
die aus wäßrigen Lösungen erhalten worden ist welche auf den
gleichen pH-Wert wie die Testprobe gepuffert worden sind und
die die obigen Reagentien und eine abgewogene Menge von
Eisen enthalten. Die Salzsäure, die der Serumprobe zur Loslösung
Loslösung des Eisens von dem Transferrin zugesetzt wird, damit
der gewünschte pH-Wert erhalten wird, wird im allgemeinen
in einer solchen Menge zugesetzt, daß ihre Konzentrationen
in der Testprobe 0,04 bis 0,15 Mol/l, vorzugsweise 0,05 bis
0,12 Mol/l betragen. Als Reduktionsmittel wird vorzugsweise
Ascorbinsäure verwendet. Konzentrationen in der Testprobe, die so
niedrig sind wie 1,5 mg/ml sind ausreichend, um
eine vollständige Farbentwicklung zu bewirken. Bei der
üblichen Praxis werden vorteilhafterweise Konzentrationen
von 5 bis 10 mg/ml verwendet. Die Farbe nimmt zu, wenn die
Ferrozinkonzentration bis 0,4 mg/ml in der Testprobe erhöht
wird. Jedoch kann eine vollständige Farbentwicklung
auch schon bei niedrigeren Konzentrationen beobachtet werden,
wenn die Ablesung mindestens 20 min nach Durchführung
der Reaktion erfolgt.
Für praktische Zwecke wird die Konzentration von Ferrozin
in der Testprobe im allgemeinen von etwa 0,4 bis etwa 1 mg/ml
gehalten.
Thiosemicarbazid verhindert selbst bei sehr niedrigen Konzen
trationen in der Testprobe volllständig eine Störung durch
Kupfer im pH-Bereich zwischen 1,7 und 2,1. Bei dem obigen
pH-Bereich ist Thiosemicarbazid wirksamer als andere Mittel,
wie Thioharnstoff, und es setzt sich nicht mit dem Eisen um.
Die Konzentrationen an Thiosemicarbazid, die gewöhnlich gemäß
einer Ausführungsform dieser Erfindung verwendet werden,
liegen im allgemeinen zwischen 0,5 und 1 mg/ml.
Die Umsetzung der Reagentien mit dem Serum erfolgt im allgemeinen
in der Weise, daß man zu einem Volumen von Serum zwei
Volumina einer salzsauren Lösung, die Ascorbinsäure, Ferrozin und
Thiosemicarbazid in geeigneter Konzentration
enthält, zusetzt. Diese letztgenannte Lösung
wird hergestellt, bevor man den Test durchführt, und sie
ist bis zu 2 h stabil.
Die Ablesung gegen die Blindprobe kann auch in der gleichen
Küvette, in der die Reaktion zwischen den Reagentien und
dem Serum durchgeführt wird, erfolgen. In diesem Falle wird
das Serum zuerst mit der Lösung der Reagentien mit Ausnahme
von Ferrozin versetzt und es wird eine erste Ablesung bei
562 nm für die Blindprobe durchgeführt.
Sodann wird Ferrozin in genügender Menge zugesetzt, und es
erfolgt eine zweite Ablesung bei der gleichen Wellenlänge
zur Bestimmung des Eisengehaltes. Diese Möglichkeit, daß
Ablesungen von Konzentrationsdifferenzen in einer einzigen
Küvette durchgeführt werden können, vermindert sowohl die Menge
des Serums als auch die Anzahl der erforderlichen Verfahrensstufen.
Bei einer alternativen Verfahrensweise können die festen
Reagentien auch in Form von kleinen Tabletten zu dem Gemisch
aus Serum und Salzsäure gegeben werden. Diese Tabletten
können die erforderliche Menge an Ascorbinsäure und Ferrozin
oder die erforderliche Menge von Thiosemicarbazid mit üblichen
Bindemitteln bzw. Trägern, wie Kohlenhydratderivaten
und hochmolekularen Polyäthylenglycolen, enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert sehr zufriedenstellende
Ergebnisse, wenn Tests zur Bestätigung der Reproduzier
barkeit mit Seren von unterschiedlichen Konzentrationen
durchgeführt werden.
Wenn weiterhin zu Proben von gepoolten Seren Standardeisen
lösungen zugesetzt werden, um die Probenkonzentrationen zu
erhöhen, dann läuft die Kurve der Absorptionswerte für die
zugefügten Eisenkonzentrationen durch den Punkt der Nullzugabe.
Somit kann die ursprüngliche Eisenkonzentration der Probe
bestimmt werden, indem man auf die Abszisse extrapoliert,
was die Genauigkeit des Verfahrens beweist. Die Absorption,
die aus den Zugabeversuchen errechnet wird, steht
mit derjenigen im Einklang, die mit Standardeisenlösungen
festgestellt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit
anderen bekannten Methoden, die sowohl eine Deproteinisierung
als auch eine Direktbestimmung einschließen verglichen.
Die Atomabsorption (AA) wurde (nachdem ihre Verläßlichkeit
durch Reproduzierbarkeits- und Wiedergewinnungsversuche
bestätigt worden war) als Vergleichsmethode ausgewählt, da sie
von einer Störung durch Kupfer frei ist. Eisen wurde
in 26 Seren bestimmt, die einen weiten Konzentrationsbereich
umfaßten. Dies geschah 1) durch eine automatisierte Fließ
methode (AT) (B. Zak et al. "Clin.", Band 11, Nr. 6, 641, 1965),
bei der eine Ablösung des Eisens von dem Transferrin, eine
Dialyse und die Komplexbildung mit Ferrozin erfolgten; 2)
durch das erfindungsgemäße Verfahren (DRC), die Atomabsorptions
methode (AA) mit einer Deproteinisierung, ein handels
übliches Direktverfahren, das als DM1 bezeichnet wird, und
ein handelsübliches Direktverfahren, das als DM2 bezeichnet
wird.
Die zwei letztgenannten Methoden bauen sich im wesentlichen
auf der Methode auf, die von K. Lauber ("Zeit. Klin. Chem.",
3, 96, 1965) beschrieben wird.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammen
gestellt.
Die Ergebnisse der Tabelle I zeigen, daß eine ausgezeichnete
Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und der
Atomabsorptions(AA)methode über den gesamten Konzentrations
bereich besteht. Für Konzentrationen von weniger als 60 µg/dl
und über 160 µg/dl steht AT in einer weniger zufriedenstellenden
Korrelation mit AA als das erfindungsgemäße Verfahren.
Bei dem Testbesteck DM1 wird häufig eine Trübung beobachtet,
die in manchen Fällen für fehlerhaft hohe Werte verantwortlich
ist. Bei dem Testbesteck DM2 entwickelt sich bei gelegentlichen
Proben eine sehr rasch zunehmende Trübung, die
jede Ablesemöglichkeit verhindert. Es hat sich gezeigt, daß
bereits eine geringfügige Hämolyse zu Störungen Anlaß gibt.
Dazu kommt noch, daß die gefundenen Werte gewöhnlich niedriger
sind als diejenigen, die mit anderen Methoden erhalten
werden.
Nachstehend wird die Durchführung der erfindungsgemäßen
Bestimmungsmethode näher erläutert.
- 1) 100 mg Thiosemicarbazid, 1 g Ascorbinsäure und 100 mg Ferrozin werden in einem 100-ml-Kolben eingegeben und sodann mit 0,1-molarer HCl aufgelöst. Die Lösung wird mit 0,1-molarer HCl auf das Volumen gebracht.
- 2) Die gleiche Lösung mit Ausnahme des Ferrozins wird für die Blindprobe hergestellt.
- Die Lösungen werden innerhalb von 2 h verwendet.
- 3) Für Arbeitsstandardlösungen werden 100 mg Thiosemicarbazid, 1 g Ascorbinsäure und 100 mg Ferrozin in einem 0,1- molaren Glycinpuffer mit einem pH-Wert von 2,1 aufgelöst und mit dem gleichen Puffer auf ein Volumen von 100 ml gebracht.
- 4) Eisenarbeitsstandards werden durch geeignete Auflösungen einer Vorratsstandardlösung, die 100 µg/ml von 99,9% Eisen enthält hergestellt. Lösungen mit der gewünschten Konzentration von 25 bis 400 µg/dl werden täglich hergestellt.
Zu 2 ml Lösung (1) wird 1 ml Serum in einer Küvette gegeben.
Die Küvette wird mit einem inerten Kunststoffilm (z. B. Parafilm)
bedeckt, und die Lösung wird durch Umkehren gemischt.
Nach 5-minütigem Stehenlassen wird die Lösung wiederum
gemischt, und nach weiteren 5 min wird die Absorption bei 562 nm
gegen eine Blindprobe abgelesen, welche dadurch hergestellt
worden ist, daß 1 ml Serum zu 2 ml der Lösung (2) gegeben
worden sind.
Für die Standardkurve wird zu 2 ml der Lösung (3) 1 ml der
verschiedenen Eisenlösungen (4) gegeben. Nach dem Vermischen
werden die relativen Absorptionen gegen die Blindprobe abgelesen,
wobei zu 2 ml der Lösung (1) 1 ml Glycinpuffer gegeben
wird, weil selbst in dem reinsten Glycin Eisenspuren
vorhanden sein können. Die Absorptionen werden gegen die
Standardeisenkonzentrationen aufgetragen.
Wenn die Reaktion in einer einzigen Küvette durchgeführt
wird, dann wird 1 ml Serum zu 2 ml Lösung (2) gegeben und
es wird eine erste Ablesung bei 562 nm durchgeführt. Hierauf
werden 100 µl einer 2-g/dl-Lösung von Ferrozin zugesetzt,
und nach dem Vermischen durch wiederholtes Umkehren und
10-minütigen Stehenlassen wird eine zweite Ablesung bei
562 nm durchgeführt.
Claims (12)
1. Verfahren zur direkten Bestimmung von Eisen in
einer Blutserumprobe mit Ferrozin in Gegenwart eines
Reduktionsmittels durch kolorimetrische Bestimmung des
gebildeten Komplexes, dadurch gekennzeichnet,
daß zu der Probe auch Thiosemicarbazid und
Salzsäure hinzugefügt werden und daß man die Umsetzung
bei einem pH-Wert zwischen 1,7 und 2,1 unter Vermeidung
einer Zugabe von Puffern und oberflächenaktiven
Mitteln durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Reduktionsmittel Ascorbin
säure verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Konzentration der Salzsäure
in der Testprobe, die der kolorimetrischen Messung unter
worfen wird, zwischen 0,05 und 0,12 Mol/l liegt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Konzentration von Ferrozin
in der Testprobe, die der kolorimetrischen Bestimmung
unterworfen wird, 0,4 bis 1 mg/ml beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Konzentration von Thiosemi
carbazid in der Testprobe, die der kolorimetrischen
Bestimmung unterworfen wird, 0,5 bis 1 mg/ml beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Konzentration der Ascorbinsäure
in der Testprobe mindestens 1,5 mg/ml beträgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagenzien
Ferrozin und Ascorbinsäure und das Thiosemicarbazid zu
dem Gemisch aus Serum und Salzsäure in Form von Tabletten
zugefügt werden.
8. Tablette zur Verwendung beim Verfahren nach Anspruch
7, dadurch gekennzeichnet, daß
sie Ferrozin und Ascorbinsäure zusammen mit einem inerten
Träger enthält.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß das Reagenz
Ferrozin als konzentrierte Lösung zu dem Gemisch der
Probe mit den übrigen Reagenzien zugesetzt wird und daß
zwei photometrische Ablesungen der Probe durchgeführt
werden, wobei die eine vor und die andere nach der
Zugabe von Ferrozin erfolgt.
10. Reagenz zur Bestimmung von Eisen im Blutserum,
dadurch gekennzeichnet, daß es Ferrozin,
Thiosemicarbazid und Ascorbinsäure enthält.
11. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß es in Salzsäure gelöst ist.
12. Reagenz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reagenzgemisch in einer solchen
Konzentration vorliegt, daß in der der kolorimetrischen
Messung unterworfenen Testprobe die Konzentration an Salz
säure zwischen 0,05 und 0,12 Mol/l liegt, die Konzentration
von Ascorbinsäure zwischen 5 und 10 mg/ml liegt, die
Konzentration von Ferrozin zwischen 0,4 und 1 mg/ml liegt und
die Konzentration von Thiosemicarbazid zwischen 0,5 und 1 mg/
ml liegt.
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