SE444863B - Forfarande for bestemning av jern i blodserum med ferrozinkomplex - Google Patents

Description

s\~..-<--.-._ 7909235-9 De flesta metoder för bestämning av järn i serum som beskri- vits tidigare kräver (l) dissociation av järn från serumtrans- ferrin genom behandling med starka oorganiska syror i närvaro av reduktionsmedel (2) deproteinisering av serum genom ut- fällning av proteiner, exempelvis med trikloroättiksyra, (3) bestämning av kvarvarande tvåvärd järnjon i lösningen genom färgreaktion med ferrozin sedan lösningens pH-värde justerats till ett värde mellan 3 och 6 med buffert (se P. Carter: Anal. Biochem. 40, 450, l97l).

Andra metoder är kända som "direkta" metoder som icke kräver utfällning av proteinerna (se exempelvis J.P. Persijn et al., Clin. Chim. Acta 35, 91, 1971; J.M. White et al., Clin. Chem. vol. 19, nr 5, 526, 1973; R. Ruutu: Clin. Chim. Acta 61, 229, 1975).

Dessa metoder som i allmänhet innefattar användning av buffer- tar i ett pH-område motsvarande den isoelektriska punkten för de flesta serumproteiner och därför motsvarande dessas insta- bilitetsmaximum utfäller av proteiner som skulle störa analys- resultaten kraftigt undvikes genom tillsats av detergenter.

Dessa bör även åstadkomma lösgöring av järn från transferrin utan sänkning av pH-värdet. Den varierande proteinsamman- sättningen hos olika sera tillåter emellertid icke ett lik- formigt och stabilt skydd mot grumlingsbildning i samtliga fall. Enskilda skillnader undvikes icke genom avläsning av den ursprungliga absorptionsförmågan eller av blindprovet (blank) eftersom i många fall en oförutsägbar grumling kan pålagras på det färgade komplexet. Vidare kan frigörandet av järn från transfc°rin vara ofullständigt vilket ger felaktigt låga värden. Av de ovan angivna skälen har “Expert Panel on Iron of the International Committee for Standardization in Haematology“ såsom referensserumjärnmetod avvisat alla de "direkta" metoderna som arbetar utan proteinutfällning och som är tidigare kända. (Se E.W. Rice et al., Clin. Chim. Acta 53, 39l,l974). 7909235-9 Å andra sidan medför deproteinisering av serum en väsentlig förlängning av metoden och utgör ett kritiskt steg eftersom serumfiltraten efter utfällning av proteiner eventuellt icke är fullständigt klara, och vidare erfordras en koncentrerad buffert för justering av pH inom ett område som är lämpat för kromogen reaktion och detta kan utgöra en källa för järnföro- rening. Närvaron av koppar som, under vissa patologiska betingelser, kan nå mycket höga nivåer, kan kraftigt störa spektrofotometriska metoder, i synnerhet de som är baserade på användning av ferrozin (se Hugh et al., Clin. Chem. vol. l7, nr 9, 950, 1971; J.R. Duffy et al., Clin. Biochem. 10, 122, 1977).

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande, som kan genom- föras med en diagnossats, för bestämning av järn i serum utan att kräva deproteinisering och separation av järn. Förfarandet enligt uppfinningen har även den fördelen, att frígöring från transferrin är fullständig och erhålles vid ett lågt pH-värde utan tillsats av buffertar i närvaro av ett reduktionsmedel under experimentbetingelser som möjliggör fullständig och hastig bildning av det färgade komplexet utan bildning av grum- lighet, varigenom man undviker användning av ytaktiva medel.

Detta förfarande är mycket enkelt och lätt anpassningsbart till automatisering.

Det fundamentala med uppfinningen är den överraskande iakt- tagelsen att: l) med tillsats av saltsyra till serum till ett pH-värde av 2,1 eller lägre bildas icke någon grumling, och: 2) reaktionen mellan ferrozin och järn är fullständig även vid detta låga pH-värde vilket möjliggör mycket exakta mätningar av järnhalten i serum genom kolorimetriska bestämningar.

Det har vidare visat sig att närvaron av tiosemikarbazid under dessa betingelser eliminerar varje störning av koppar utan att negativt påverka eller på ett oacceptabelt sätt komplicera metoden för bestämning av järn. Enligt den direkta metoden 7909235-9 enligt uppfinningen sätter man till serum som innehåller järn, vilket skall bestämmas, saltsyra så att pH-värdet uppnår ett värde mellan 1,7 och 2,1. Ett reduktionsmedel för att över- föra järnjon i tvåvärd form, ferrozin och tiosemikarbazid tillsättes även till serumprovet som skall undersökas. Sedan tillsatsen av dessa reaktionskomponenter avslutats blandas provet omsorgsfullt, varefter järnhalten hos provet, sedan detta fått stå vid rumstemperatur, t.ex. under 5 - 20 minuters tid, bestämmes kolorimetriskt med hjälp av det färgade komp- lexet av järn och ferrozin mot ett reagensblindprov.

Sålunda mätes absorptionen vid 562 nm mot ett reagensblind- prov, d v s ett prov innehållande samma blandning som angivits ovan med uteslutande av ferrozin. Värdering av järnhalten göres med hjälp av en standardkurva erhållen från vattenlös- ningar buffrade vid samma pH-värde som det undersökta provet och innehållande de ovan angivna reaktionskomponenterna samt en uppvägd mängd järn. Saltsyran som tillsättes till serum- provet för frigöring av järn från transferrin så att det öns- kade pH-värdet uppnås tillföres vanligen i sådan mängd att halten i det undersökta provet varierar från 0,04 mol/l till 0,15 mol/l, företrädesvis från 0,05 mol/l till 0,12 mol/l.

Askorbinsyra-användes företrädesvis såsom reduktionsmedel.

Så låga koncentrationer som 1,5 mg/ml i det undersökta provet är tillräckliga för att ge en fullständig färgutveckling.

Vid vanlig tillämpning användes företrädesvis koncentrationer från 5 till 10 mg/ml. Färgen ökar genom ökning av ferrozin- halten upp till 0,4 mg/ml i det undersökta provet. Emellertid kan fullständig färgutveckling iakttagas även vid lägre kon- centrationer om avlägsningen göres minst 20 minuter efter reaktionens genomförande.

Av praktiska skäl hâlles halten av ferrozin i det undersökta provet vanligen från ca 0,4 till ca l mg/ml.

Tiosemikarbazid förhindrar även vid mycket låga koncentratio- ner i det undersökta provet fullständigt att koppar stör vid N790923S-9 ett pH-värde mellan l,7 och 2,1. Vid detta pH-intervall är tiosemikarbazid effektivare än andra medel, exempelvis tio- karbamid och reagerar icke med järn. Koncentrationen av tio- semikarbazid som vanligen användes enligt en utföringsform av uppfinningen ligger i allmänhet mellan 0,5 och l mg/ml.

Reaktionen av reaktionskomponenterna med serum åstadkommes vanligen genom tillsats till en volym serum av två volymer av en lösning innehållande askorbinsyra, ferrozin och tiosemikar- bazid i bestämda mängder i HCl av lämplig sammansättning. Den sistnämnda lösningen beredes före genomförande av provningen och är stabil upp till två timmar.

Avläsningarna mot blindprovet kan även genomföras i samma kuvett i vilket reaktionen mellan reaktionskomponenterna och serum genomföres. I detta fall tillsättes serum först med lösningen av reaktionskomponenterna med undantag av ferrozin och ett första värde avläses vid 562 nm för blindprovet.

Därefter tillsättes ferrozin i tillräcklig mängd och en andra avläsning genomföres vid sama våglängd för järnhaltsbestäm- ning. Denna möjlighet att genomföra differensavläsningar i en enda kuvett minskar både mängden serum och antalat erforderli- ga operationer. Enligt en alternativ metod kan de fasta reak- tionskomponenterna även tillsättas i form av små tabletter till blandningen av serum och saltsyra. Dessa tabletter kan innehålla den erforderliga mängden askorbinsyra och ferrozin eller den erforderliga mängden tiosemikarbazid tillsammans med vanliga excipienter, såsom kolhydratderivat och polyetylen- glykoler med hög molekylvikt.

Förfarandet enligt uppfinningen ger mycket tillfredsställande resultat vid provning för fastställande av reproducerbarheten på sera vid olika koncentrationer.

När proverna av sammaförda (pooled) sera-standardjärnlösningar tillsättas för att öka provkoncentrationerna passerar kurvan över adsorptionsvärdena för de tillsatta järnkoncentfationerna 7909235-9 genom punkten för nolltillsats. Den ursprungliga järnkoncent- rationen i provet kan därför bestämmas genom extrapolering till abskissan vilket visar noggrannheten hos metoden. Den absorption som beräknas från tillsatsförsök sammanfaller med den som fastställes med standard-järnlösningen. Förfarandet enligt uppfinningen har jämförts med andra tidigare kända metoder, både innefattande deproteinisering och direkt metod.

Atomabsorption (AA) valdes (sedan man fastställt pâlitligheten genom försök med reproducerbarhet och återvinning) såsom metoden för jämförelse eftersom denna metod otvivelaktigt är fri från störning av koppar. Järn bestämdes på 26 sera som täckte ett mycket stort koncentrationsintervall genom 1) en automatiserad flödesmetod (AT) (B. Zak et al., Clin. Vol. ll, nr 6, 641, 1965), innefattande frigöring av järn från trans- ferrin, dialys och komplexbildning med ferrozin; 2) förfaran- det enligt föreliggande uppfinning (DRC); atomabsorptionsmeto- den (AA) innefattande deproteinisering; en kommersiell direkt metod betecknad DMl och en kommersiell direkt metod betecknad DM2.

De båda sistnämnda metoderna är väsentligen baserade på den metod beskrives av K. Lauber (Zeit.Klin. Chem. 3, 96, 1965).

Resultaten anges i följande tabell I.

Resultaten i tabell I visar att det finns en mycket god korre- lation mellan förfarandet enligt uppfinningen och atomabsorp- tionsmetoden (AA) genom hela koncentrationsområdet. _För kon- centrationer understigande 60 pg/dl och över l604pg/dl ger AT mindre tillfredsställande korrelation med AA än förfarandet enligt uppfinningen. Med satsen DMI iakttages ofta grumling vilket i vissa fall orsakar felaktigt höga värden. Med satsen DM2 utvecklas i vissa prover mycket hastigt ökande grumling som förhindrar avlägsning, och även en ringa grad av hemolys har visat sig ge upphov till störning. Vidare är de funna värdena vanligen lägre än de som erhållas med de andra meto- derna. ~7909235-9 7 119 järn per 100 ml serum Serum nr AT AA DRC DR 1 DR 2, 1 4 10 11 . - 70 - 'åäsbarc 2 15 17 16 _ 17 20 3 24 34 36 a 45 :läsbart 4 33 48' so " 45 40 5 40 40 I 39 .45 35 6 44- 45 44,- 45 - 45 7 _51_ 52 - 52_ 39 -48 8_ 55 ä 55 _ '55 150 O 40 9 59 60 ' - 58 V 55 I so 10 '66 70 75 55 53 '11 73 72 _ 72 - 67 60 12 79 70 66 _ 78- 75' 13 82 84 Å 83 ' 72 ' 60 14 87 88 875 83 70 . 15 91_- - -93 97 ' 83 75 16 94 . . 90 \ 92 89 75 17 98 96 98 ..133 100 18 108 110 108 105 85 19 Å120 125 128 *128 110 20 128. _*127 126 122 112 21 V 140 ; 140 138 4,200 _125 22 150 145 145 134 125 23 163 _ 155 152' 8.172 140 24 180 175 180 167 155 25 213 210 217 194_ 175 28 241 238 239 228 225 öšáildning av grumlighet n: àßildning av hastigt ökande grumlighet n Svag hemolys ""79o92s5-9~ 8 I det följande anges en detaljerad beskrivning av förfarandet enligt uppfinningen.

Lösningar: 1) 100 mg tiosemikarbazid,l g askorbinsyra och 100 mg ferrozin införas i en volymeterkolv med volymen 100 ml och upplösas därefter med 0,l-molar HCl. Lösningen kompletteras till öns- kad volym med 0,1-molar HCl. 2) Samma lösning, med uteslutande av ferrozin, beredes för blindprovet.

Lösningarna användas inom två timmars tid. 3) För arbetsstandardlösningar upplösas 100 mg tiosemikarba- zid, l g askorbinsyra och 100 mg ferrozin med en 0,1-molar glicin-buffert vid pH 2,1 och bringas till volymen 100 ml med samma buffert. 4) Järn-arbetsstandards beredas genom lämplig utspädning av lagerstandardlösning innehållande 100 pg/ml av 99,9 % järn.

Lösningar med önskade koncentrationer av 25 till 400 pg/dl beredas dagligen.

Tillvägagângssätt:~ _ Till 2 ml lösning (l) tillsättes l ml serum i en kuvet - kuvetten täckes med en inert plastfilm (t.ex. Parafilmzï) och lösningen blandas genom invertering. Efter förfaring under S minuters tid blandas lösningen igen och efter ytterligare 5 minuter avläses_absorptionen vid 562 nm mot ett blindprov framställt genom tillsats av l ml serum till 2 ml lösning (2).

För standardkurvan sättes till 2 ml av lösning (3) l ml av de olika järnlösningarna (4). Efter blandning avläses de relati- va absorptionerna mot blindprovet genom tillsats till 2 ml av lösning l av l ml glycinbuffert, eftersom spår av järn kan närvara även i det renaste glycin. Absorptionsvärdena av- 7909235-9 sättas mot standardjärnkoncentrationerna.

När reaktionen genomföres i enda kuvett tillsättes l ml serum till 2 ml lösning (2) och en första avläsning göres vid 562 nmr Därefter tillsättes l00 um av 2 g/dl lösning av ferrozin och efter sammanblandning genom upprepad invertering och för- varing under l0 minuters tid göres en andra avläsning vid 562 flm.

Claims (5)

1. 7909235-9 10 Patentkrav l. Direkt förfarande för bestämning av järn i blodserum, k ä n n e t e c k n a t därav, att man (a) reagerar blodserum med ferrozin i närvaro av ett reduktionsmedel för överförande av järnjon till tvåvärd form, tiosemikarbazid och saltsyra vid ett pH-värde mellan 1,7 och 2,1, utan tillsats av buffert och ytaktiva medel, samt (b) bestämmer kolorimetriskt järnhalten i provet med hjälp av det färgade komplex som bildas mellan järn- jon och ferrozin mot ett reagensblindprov.

2. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att reduktionsmedlet utgöres av askorbinsyra, företrä- desvis i en mängd av minst l,5 mg/ml i försöksprovet.

3. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att halten av saltsyra i försöksprovet som underkastas kolorimetrisk mätning ligger mellan Ö,O5 och 0,12 mol/l.

4. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n - n e t e c k n a t därav, att halten av_ferrozin i försökspro- vet som underkastas kolorimetrisk bestämning ligger inom in- tervallet 0,4 - l mg/ml.

5. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n - n e t e c k n a t därav, att koncentrationen av tiosemikarba- zid i försöksprovet som underkastas kolorimetrisk bestämning ligger inom intervallet 0,5 - 1 mg/ml.