DE2943423A1

DE2943423A1 - Direktes verfahren zur bestimmung von eisen im blutserum

Info

Publication number: DE2943423A1
Application number: DE19792943423
Authority: DE
Inventors: Ferruccio Angelo Robe Ceriotti
Original assignee: RCC RECH CHIM CLINICA
Current assignee: RCC RECH CHIM CLINICA
Priority date: 1978-11-08
Filing date: 1979-10-26
Publication date: 1980-05-22
Also published as: GB2034465A; SE444863B; CA1131114A; BE879914A; US4308027A; GB2034465B; SE7909235L; JPS6259265B2; NL7907912A; CH642750A5; ATA718079A; DE2943423C2; ES485763A1; AT363617B; IT1100475B; LU81862A1; FR2441171B1; JPS5576954A; IT7829543A0; FR2441171A1

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zur direkten Bestimmung von Eisen im Blutserum.

Es sind bereits mehrere Methoden zur Direktbestimmung von Eisen im Blutserum bekannt. Einige dieser Methoden bauen sich auf der Möglichkeit auf, daß gefärbte Komplexe zwischen zweiwertigen Eisenionen und Komplexbildnern, wie z.B. BP (4,7-Diphenyl-1,10-phenantrolin), TPTZ (2,4,6-Tris-(2-pyridyl)-s-triazin) und Ferrozin [Dinatriumsalz von 3-(2-Pyridyl)-5,6-bis-(4-sulfophenyl)-s-triazin; vgl. L.L. Stookey "Analytical Chemistry" 42, Nr. 7, 779, 197O]gebildet werden und daß der gebildete Komplex spektrophotometrisch bestimmt wird. In speziellen Literaturstellen wird festgestellt, daß Ferrozin besonders gut geeignet ist, da es mit zweiwertigem Eisen einen gefärbten Komplex mit sehr hoher Absorption (ε = 27,100), der in Wasser löslich und bei einem pH-Wert zwischen 3,5 und 11 und vorzugsweise zwischen 4 und 9 stabil ist, bildet*.

Die meisten Bestiffiffiungssjethoden für Eisen in Serum, die bereits bekannt sind, erfordern folgendes: (i) die Dissoziation von Eisen vom Serumtrans ferr in durch Behandlung mit einer starken Mineralsäure in Gegenwart eines Reduktionsmittels _t (2) die Beproteinisierung von Serum durch Ausfällung der Proteine, z.B. mit Trichloressigsäure, (3) die Bestimmung der zweiwertigen Eisenionen, die in der Lösung zurückbleiben, durch Farbreaktion mit Ferrozin, nachdem der pH-Wert der Lösung Bit Puffer auf einen Wert zwischen 3 und 6 eingestellt worden ist {vgl. P. Carter "Anal. Biochem.", 40, 450* 1971),

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2 91, 3 A 7 3

Andere Methoden sind als Direktmethoden bekannt und sie erfordern keine Ausfällung der Proteine (vgl. z.B. J.P. Persian et al. "Clin. Chim. Acta" 2£, 91, 1971; J.M. White et al. "Clin. Chem.", Band 19, Nr. 5, 526, 1973; R. Ruutu "Clin. Chim. Acta" 61, 229, 1975).

Bei diesen Methoden werden im allgemeinen Puffer in einem pH-Bereich verwendet, der dem isoelektrischen Punkt der meisten der Serumproteine und daher dem Instabilitätsmaximum entspricht. Die Ausfällung von Proteine, die die Analysenergebnisse stark stören würde, wird durch Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln verhindert. Diese sollten auch die Ablösung des Eisens von dem Transferrin bewirken, ohne daß der pH-Wert erniedrigt wird. Jedoch gestattet die variable Proteinzusammensetzung der verschiedenen Seren keinen gleichförmigen und stabilen Schutz gegenüber der Ausbildung einer Trübung in jedem Falle. Tatsächlich werden individuelle Unterschiede nicht dadurch behoben, daß man die Anfangsabsorption oder diejenige der Blindprobe abliest, weil in manchen Fällen eine unvorhersehbare Trübung auf den gefärbtem Komplex aufgelegt sein kann. Dazu kommt noch, daß die Freisetzung des Eisens von dem Transferrin nicht vollständig sein kann, wodurch fehlerhaft niedrige Werte erhalten werden. Aus den obigen Gründen hat das Expertengremium für Eisen des Internationalen Komitees zur Standardisierung der Hämatologie als Referenzserumeisenmethode alle derzeit bekannten zahlreichen Direktmethoden ohne Proteinausfällung zurückgewiesen (vgl. E.W. Rice et al. "Clin. Chim. Acta" £3., 391, 1974).

Andererseits verlängert die Serumdeproteinisierung die Verfahrensweise empfindlich und sie stellt eine kritische Stufe dar, da die Serumfilträte nach der Ausfällung der Proteine nicht vollständig klar sein können. Weiterhin ist ein kon-

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zentrierter Puffer notwendig, um den pH-Wert in einem bereich einzustellen, der für die chromogene Reaktion geeignet ist, was eine Quelle für Eisenverunreinigung sein kann. Die Anwesenheit von Kupfer, die bei bestimmten pathologischen Umständen sehr hohe Werte erreichen kann, kann spektrophotometrische Methoden, insbesondere diejenigen, die sich auf der Verwendung von Ferrozin aufbauen, stark stören (vgl. Hugh et al. "Clin. Chem.", Band 17, Nr. 9, 950, 1971; J.R. Duffy et al. "Clin. Biochem." ,10, 122, 1977).

Durch die Erfindung wird nun ein Verfahren und ein Mittel, das in Form eines diagnostischen Bestecks verwendet werden kann, zur Bestimmung von Eisen in Serum zur Verfügung gestellt, ohne daß eine Deproteinisierung und Abtrennung von Eisen erforderlich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Reagentien haben auch den Vorteil, daß die Freisetzung des Eisens von dem Transferrin vollständig ist und bei einem niederen pH-Wert ohne Zugabe von Puffern in Gegenwart eines Reduktionsmittels und bei Versuchsbedingungen erhalten wird, die eine vollständige und rasche Entwicklung des gefärbten Komplexes ohne Bildung einer Trübung gestatten, wodurch die Verwendung von tensioaktiven bzw. oberflächenaktiven Mitteln vermieden wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr einfach und kann leicht automatisiert werden.

Der Erfindung liegen folgende überraschende Feststellungen zugrunde: 1) Bei Zugabe von Salzsäure zu Serum, um einen pH-Wert von 2,1 oder niedriger zu erreichen, bildet sich keine Trübung! und 2) die Reaktion zwischen Ferrozin und Eisen ist selbst bei diesem pH-Wert vollständig, wodurch sehr genaue Messungen des Eisengehalts im Serum durch kolor!metrische Bestimmungen gestattet werden.

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Es wurde weiterhin gefunden, daß die Anwesenheit von Thiosemicarbazid bei diesen Bedingungen alle Störungen durch Kupfer eliminiert, ohne daß die Eisenbestimmung negativ beeinfluß oder in ungeeigneter Weise kompliziert wird.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Direktverfahren wird eine Probe, die das zu bestimmende Eisen enthält, mit Salzsäure versetzt, um den pH-Wert auf einen Wert zwischen 1,6 und 4,0, vorzugsweise zwischen 1,7 und 2,1, zu bringen. Ein Reduktionsmittel, damit die Eisenionen in zweiwertige Form gebracht werden, Ferrozin und Thiosemicarbazid werden gleichfalls zu der zu testenden Serumprobe gegeben. Nach beendigter Zugabe dieser Reagentien wird die Probe sorgfältig vermischt und hierauf wird nach 5- bis 20-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur der Eisengehalt der Probe kolorimetrisch mittels des gefärbten Komplexes bestimmt.

Demgemäß wird die Absorption bei 562 nm gegen eine Reagenzblindprobe, d.h. eine Probe, die das gleiche Gemisch wie oben, jedoch ohne Ferrozin enthält, gemessen. Die Bestimmung des Eisengehalts erfolgt anhand einer Standardkurve, die aus wäßrigen Lösungen erhalten worden ist, welche zu dem gleichen pH-Wert wie die Testprobe gepuffert worden sind und die die obigen Reagentien und eine abgewogene Menge von Eisen enthalten. Die Salzsäure, die der Serumprobe zur Loslösung des Eisens von dem Transferrin zugesetzt wird, damit der gewünschte pH-Wert erhalten wird, wird im allgemeinen in einer solchen Menge zugesetzt, daß ihre Konzentrationen in der Testprobe 0,04 bis 0,15 Mol/l, vorzugsweise 0,05 bis 0,12 Mol/l, betragen. Als Reduktionsmittel wird vorzugsweise Ascorbinsäure verwendet. Konzentrationen, die so niedrig sind wie 1,5 mg/ml, in der Testprobe sind ausreichend, um eine vollständige Farbentwicklung zu bewirken. Bei der

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üblichen Praxis werden vorteilhafterweise Konzentrationen von 5 bis 10 mg/ml verwendet. Die Farbe nimmt zu, wenn die Ferrozinkonzentration bis zu 0,4 mg/ml in der Testprobe erhöht wird. Jedoch kann eine vollständige Farbentwicklung auch schon bei niedrigeren Konzentrationen beobachtet werden, wenn die Ablesung mindestens 20 min nach Durchführung der Reaktion erfolgt.

Für praktische Zwecke wird die Konzentration von Ferrozin in der Testprobe im allgemeinen von etwa 0,4 bis etwa 1 mg/ml gehalten.

Thiosemicarbazid verhindert selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen in der Testprobe vollständig eine Störung durch Kupfer im pH-Bereich zwischen 1,7 und 2,1. Bei dem obigen pH-Bereich ist Thiosemicarbazid wirksamer als andere Mittel, wie Thioharnstoff, und es setzt sich nicht mit dem Eisen um. Die Konzentrationen an Thiosemicarbazid, die gewöhnlich gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung verwendet werden, liegen im allgemeinen zwischen 0,5 und 1 mg/ml.

Die Umsetzung der Reagentien mit dem Serum erfolgt im allgemeinen in der Weise, daß man zu einem Volumen von Serum zwei Volumina einer Lösung, die Ascorbinsäure, Ferrozin und Thiosemicarbazid in bestimmten Mengen in HCl geeigneter Konzentration enthält, zusetzt. Diese letztgenannte Lösung wird hergestellt, bevor man den Test durchführt, und sie ist bis zu 2 h stabil.

Die Ablesung gegen die Blindprobe kann auch in der gleichen Küvette* in der die Reaktion zwischen den Reagentien und dem Serum durchgeführt wird, erfolgen. In diesem Falle wird das Serum zuerst mit der Lösung der Reagentien mit Ausnahme

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" ^ " 2 Π A 3 /₊ 2

von Ferrozin versetzt und es wird eine erste Ablesung bei 562 nm für die Blindprobe durchgeführt.

Sodann wird Ferrozin in genügender Menge zugesetzt und es erfolgt eine zweite Ablesung bei der gleichen Wellenlänge zur Bestimmung des Eisengehalts. Diese Möglichkeit, daß Differentialablesungen in einer einzigen Küvette durchgeführt werden können, vermindert sowohl die Menge des Serums als auch die Anzahl der erforderlichen Verfahrensstufen. Bei einer alternativen Verfahrensweise können die festen Reagentien auch in Form von kleinen Tabletten zu dem Gemisch aus Serum und Salzsäure gegeben werden. Diese Tabletten können die erforderliche Menge von Ascorbinsäure und Ferrozin oder die erforderliche Menge von Thiosemicarbazid mit üblichen Bindemitteln bzw. Trägern, wie Kohlenhydratderivaten und hochmolekularen Polyäthylenglycolen, enthalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert sehr zufriedenstellende Ergebnisse, wenn Tests zur Bestätigung der Reproduzierbarkeit mit Seren von unterschiedlichen Konzentrationen durchgeführt werden.

Wenn weiterhin zu Proben von gepoolten Seren Standardeisenlösungen zugesetzt werden, um die Probenkonzentrationen zu erhöhen, dann läuft die Kurve der Absorptionswerte für die zugefügten Eisenkonzentrationen durch den Punkt der Nullzugabe. Somit kann die ursprüngliche Eisenkonzentration der Probe bestimmt werden, indem man auf die Abszisse extrapoliert, was die Genauigkeit des Verfahrens beweist. Die Absorption, die aus den Zugabeversuchen errechnet wird, steht mit derjenigen im Einklang, die mit Standardeisenlösungen festgestellt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit anderen bekannten Methoden, die sowohl eine Deproteinisie-

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rung als auch eine Direktbestimmung einschließen, verglichen. Die Atomabsorption (AA) wurde (nachdem ihre Verläßlichkeit durch Reproduzierbarkeits- und Wiedergewinnungsversuche bestätigt worden war) als Vergleichsmethode ausgewählt, da sie zweifelsfrei von einer Kupferstörung frei ist. Eisen wurde in 26 Seren bestimmt, die einen weiten Konzentrationsbereich umfaßten. Dies geschah 1) durch eine automatisierte Fließmethode (AT) (B. Zak et al. "Clin.", Band 11, Nr. 6, 6A1, 1965), bei der eine Ablösung des Eisens von dem Transferrin, eine Dialyse und die Komplexbildung mit Ferrozin erfolgten; 2) durch das erfindungsgemäße Verfahren (DRC), die Atomabsorptionsmethode (AA) mit einer Deproteinisierung, ein handelsübliches Direktverfahren, das als DM1 bezeichnet wird, -und ein handelsübliches Direktverfahren, das als DM2 bezeichnet wird.

Die zwei letztgenannten Methoden bauen sich im wesentlichen auf der Methode auf, die von K* Lauber ("Zeit. Klin, Chem,", 2, 96, 1965) besenrieben wird.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

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	/ig 'AT	Eisen pro	Tabelle I	DR 1	DIi 2
Serum	4	AA	100 ml Serum	**70	*·^>; nicht ablesbar
Nr.	15	10	DRC	17	20
1	24	17	11	*45	+ nicht ablesbar
2	33	34	16	45	40
3	40	48	36	*45	35
4	44	40	50	45	45
5	51	45	39	39	48
6	55	52	44	50	40
7	59	55	52	55	50
8	66	60	55	55	53
9	73	70	58	67	60
10	79	72	75	78	75
11	82	70	72	72	60
12	87	84	66	83	70
13	91	88	83	83	75
14	94	93	87	89	75
15	98	90	97	**133	100
16	108	96	92	105	85
17	120	110	98	*128	110
18	128	125	108	122	112
19	140	127	128	**200	125
20	150	140	126	134	125
21	163	145	138	**172	140
22	180	155	145	167	155
23	213	175	152	194	175
24	241	210	180	228	225
25		238	217
26	239

* Bildung einer Trübung ** Bildung einer rasch zunehmenden Trübung + geringfügige Hämolyse

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Die Ergebnisse der Tabelle I zeigen, daß eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Atomabsorptions(AA)methode über den gesamten Konzentrationsbereich besteht. Für Konzentrationen von weniger als 60 u g/dl und über 160 u g/dl steht AT in einer weniger zufriedenstellenden Korrelation mit AA als das erfindungsgemäße Verfahren. Bei dem Testbesteck DM1 wird häufig eine Trübung beobachtet, die in manchen Fällen für fehlerhaft hohe Werte verantwortlich ist. Bei dem Testbesteck DM2 entwickelt sich bei gelegentlichen Proben eine sehr rasch zunehmende Trübung, die jede Ablesemöglichkeit verhindert. Es hat sich gezeigt, daß bereits eine geringfügige Hämolyse zu Störungen Anlaß gibt. Dazu kommt noch, daß die gefundenen Werte gewöhnlich niedriger sind als diejenigen, die mit anderen Methoden erhalten werden,

Nachstehend wird die Durchführung der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode näher erläutert.

Lösungen:

1) 100 mg Thiosemicarbazid, 1 g Ascorbinsäure und 100 mg Ferrozin werden in einen 100-ml-Kolben eingegeben und sodann mit 0,1-solarer HCl aufgelöst. Die Losnmg wird mit 0,1-molarer HCl auf das Volumen gebracht.

2) Die ,gleiche Lösung mit Ausnahme des Ferrozins wird für die Blindprobe hergestellt.

Die Lösungen werden innerhalb von 2 h verwendet.

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3) Für Arbeitsstandardlösungen werden 100 mg Thiosemicarbazid, 1 g Ascorbinsäure und 100 mg Ferrozin in einem 0,1-molaren Glycinpuffer mit einem pH-Wert von 2,1 aufgelöst und mit dem gleichen Puffer auf ein Volumen von 100 ml gebracht.

4) Eisenarbeitsstandards werden durch geeignete Auflösungen einer Vorratsstandardlösung, die 100 li g/ml von 99,9% Eisen enthält, hergestellt. Lösungen mit der gewünschten Konzentration von 25 bis 400 ii g/dl werden täglich hergestellt.

Verfahrensweise:

Zu 2 ml Lösung (1) wird 1 ml Serum in einer Küvette gegeben. Die Küvette wird mit einem inerten Kunststoffilm (z.B. Parafilm) bedeckt und die Lösung wird durch Umkehren gemischt. Nach 5-minütigem Stehenlassen wird die Lösung wiederum gemischt und nach weiteren 5 min wird die Absorption bei 562 nm gegen eine Blindprobe abgelesen, welche dadurch hergestellt worden ist, daß 1 ml Serum zu 2 ml der Lösung (2) gegeben worden sind.

Für die Standardkurve wird zu 2 ml der Lösung (3) 1 ml der verschiedenen Eisenlösungen (4) gegeben. Nach dem Vermischen werden die relativen Absorptionen gegen die Blindprobe abgelesen, wobei zu 2 ml der Lösung (1) 1 ml Glycinpuffer gegeben wird, weil selbst in dem reinsten Glycin Eisenspuren vorhanden sein können. Die Absorptionen werden gegen die Standardeisenkonzentrationen aufgetragen.

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Wenn die Reaktion in einer einzigen Küvette durchgeführt wird, dann wird 1 ml Serum zu 2 ml Lösung (2) gegeben und es wird eine erste Ablesung bei 562 nm durchgeführt. Hierauf werden 100 u1 einer 2-g/dl-Lösung von Ferrozin zugesetzt und nach dem Vermischen durch wiederholtes Umkehren und 10-minütigem Stehenlassen wird eine zweite Ablesung bei 562 nm durchgeführt.

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Claims

KRAUS & VVEISERT

PATENTANWÄLTE /. ^ 4 .> 4 / J

DR WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER DRING ANNEKÄTE WEISERT DIPL ING FACHRICHl LJNG CHEMIL IRMGARDSTRASSE 15 D-8OOO MÜNCHEN 71 ■ TELEFON 089/797077-797078 TELEX 05-2121!% kpat d

TELEGRAMM KRAUSPATENT

2351 WK/rm

R.C.C. SOCIETA RICERCHE DI CHIMICA CLINICA S.r.l.

Mailand / Italien

Direktes Verfahren zur Bestimmung von Eisen im Blutserum

Patentansprüche

1J Direktes Verfahren zur Bestimmung von Eisen im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) das Blutserum mit Ferrozin in Gegenwart eines Reduktionsmittels, um die Eisenionen in zweiwertige Form zu bringen, von Thiosemicarbazid und Salzsäure bei einem pH— Wert zwischen 1,7 und 2,1 ohne Zugabe von Puffern und tensioaktiven Mitteln umsetzt und daß man (b) kolorimetrisch den Eisengehalt der Probe mittels des gefärbten Komplexes, der aus den Eisenionen und Ferrozin gebildet worden ist, gegen eine Reagenzblindprobe bestimmt.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reduktionsmittel Ascorbinsäure verwendet.
3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Salzsäure in der Testprobe, die der kolorimetrischen Messung unterworfen wird, zwischen 0,05 und 0,12 Mol/l liegt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Ferrozin in der Testprobe, die der kolorimetrischen Bestimmung unterworfen wird, 0,4 bis 1 mg/ml beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Tnioseisicarbazid in der Testprobe, die der kolorimetrischen Bestimmung unterworfen wird, 0,5 bis 1 mg/ml beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Ascorbinsäure in der Testprobe mindestens 1,5 mg/ml beträgt.
7. Reagenz zur Bestimmung von Eisen im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß es Ferrozin,
Thiosemicarbazid und Ascorbinsäure enthält.
8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in Salzsäure gelöst ist*
9· Besteck für die kolor!metrische Bestimmung von Eisen

im Blutserum onne Proteinausfällung, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenzgemisch für die kolori-

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metrische Bestimmung Salzsäure, Ascorbinsäure, Ferrozin und Thiosemicarbazid enthält und daß es keine Zugabe von tensioaktiven Mitteln erfordert.
10. Besteck nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenzgemisch in einer solcher. Art und Weise hergestellt worden ist, daß in der der kolorimetrischen Messung unterworfenen Testprobe die Konzentration an Salzsäure zwischen 0,05 und 0,12 Mol/l liegt, die Konzentration von Ascorbinsäure zwischen 5 und 10 mg/ml liegt, die Konzentration von Ferrozin zwischen 0,4 und 1 mg/ml liegt und die Konzentration von Thiosemicarbazid zwischen 0,5 und 1 mg/ml liegt.
11. Besteck nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz Ferrozin als konzentrierte Lösung zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt worden ist und daß zwei photometrische Ablesungen der Probe durchgeführt werden, wobei die eine vor und die andere nach der Zugabe von Ferrozin erfolgt.
12. Besteck nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagentien Ferrozin und Ascorbinsäure und das Thiosemicarbazid zu dem Gemisch aus Serum und Salzsäure in Form von Tabletten zugefügt werden.
13. Tablette zur Verwendung beim Besteck nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß sie Ferrozin und Ascorbinsäure zusammen mit einem inerten Träger enthält.

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