DE1944246A1

DE1944246A1 - Verfahren und Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von chemischen Blutsubstanzen in Blutderivaten

Info

Publication number: DE1944246A1
Application number: DE19691944246
Authority: DE
Inventors: Guehler Paul Frederick
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1968-08-29
Filing date: 1969-08-28
Publication date: 1970-03-05
Also published as: FR2016590A1; US3733179A; BR6911945D0; NL6912626A

Description

Minnesota Mining and Manufacturing Company, Saint Paul,

Minnesota 55101, V.St.A.

Verfahren und Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von chemischen Blutsubstanzen in Blutderivaten

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von chemischen Substanzen,die in diagnostischer Hinsicht von Bedeutung sind, in Blutderivaten.

Abnorm hohe oder niedrige Konzentrationen bestimmter chemischer Blutsubstanzen können das Einsetzen oder Vorhandensein zahlreicher Krankheiten des Körpers anzeigen. Beispielsweise können abnorm niedrige Konzentrationen an Cholesterin eine unzureichende intestinale Absorption von Fetten, eine lebererkrankung sowie eine Überfunktion der Schilddrüse anzeigen. Fortgesetzte abnorm hohe Konzentrationen an Cholesterin können eine Coronarthrombose voraussagen und erbliche Schädigungen des Fettstoffwechsels, eine Unterfunktion der Schilddrüse, Diabetes sowie eine Gelbsucht durch Verstopfung des Gallenganges anzeigen. Abnorme Konzentrationen an Harnsäure im Blut zeigen Gicht oder Nierensteine an oder gehen diesen voraus. Verfahren zur quanti-

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tativen Bestimmung von Cholesterin und anderen chemischen Blutsubstanzen stellen ein bedeutendes klinisches Mittel zur Diagnose von zahlreichen Krankheiten des Körpers dar.

Bisher waren die quantitativen Bestimmungen der chemischen Blutsubstanzen umständlich und kostspielig und erforderten zahlreiche zeitraubende Ausführungsschritte durch erfahrenes klinisches Personal. Bei der Bestimmung des Blutcholesterins nach dem modifizierten Verfahren von Henly et al. (beschrieben in Henry, R.J., "Clinical Chemistry: Principles and Techniques", Harper and Row, NewYork, 1965, Seiten 855-857) muß der Ausführende z.B. bestimmte Mengen eines Blutderivates (z.B. Blutserum) und eine Lösung von Eisenchlorid und Essigsäure abmessen und in einem Reagensglas vereinigen. Die Bestandteile werden durch Bewegung vermischt und 10-15 Minuten lang beiseite gestellt. Das Reagensglas wird dann in einem Wasserbad 2 Minuten lang erwärmt, abgekühlt und zur Abtrennung des ausgefällten Proteins zentrifugiert. In eine abgemessene Menge der überstehenden Flüssigkeit wird dann eine abgemessene Menge an konzentrierter Schwefelsäure hineingegeben und vermischt. Nachdem man wiederum 10 Minuten lang gewartet hat, wird die optische Dichte der erhaltenen Lösung photometrisch gemessen und zu der Cholesterinkonzentration in dem Blutderivat in Beziehung gesetzt.

In ähnlicher Weise waren bei Bestimmungen von Blutchemikalien wie Harnsäure, Bilirubin, Eiweiss, Glucose und Harnstoff mehrere Ausführungsschritte erforderlich, z.B. das Abmessen und Vermischen von mehreren Komponenten, die Herstellung von Standardlösungen direkt vor der Verwendung usw..

Aufgrund der Zeit und Erfahrung, die für die zahlreichen, bisher bei der Analyse von chemischen Blutsubstanzen notwendigen Ausführungsschritte, wie sie oben beispielsweise beschrieben worden sind, erforderlich waren, sind derartige Analysen vornehmlich auf die medizinischen Laboratorien der Krankenhäuser beschränkt gewesen.

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Die vorliegende Erfindung schlägt ein bequemes Verfahren und eine Vorrichtung für quantitative Bestimmungen von diagnostisch wichtigen chemischen Substanzen in Blutderivaten vor. Das Verfahren umfaßt folgende nacheinander auszuführende Schritte:

(1) Erstellung eines ersten Behälters mit einer Lösung, die eine chemische Blutsubstanz aus einem Blutderivat unter Bildung einer Komponente zu extrahieren vermag, welche imstande ist, mit einem Testmaterial unter Bildung einer gefärbten Flüssigkeit mit einer optischen Dichte, die von der Konzentration der chemischen Blut substanz in dem Blutderivat abhängig ist, zu reagieren;

(2) Einbringen einer Probe eines Blutderivates, das die chemische Blutsubstanz enthält, in den ersten Behälter, um die genannte Komponente zu bilden;

(3) Erstellung eines zweiten Behälters, der das Testmaterial enthält;

(4) Zusammenfügen der Behälter durch ein Verbindungsglied, das ein luftdurchlässiges Filtermittel aufweist, welches chemisch beständig gegenüber der Lösung des ersten Behälters und dem Material in dem zweiten Behälter ist und diese normalerweise voneinander trennt, wobei das Filtermittel, wenn es mit einem Behälter verbunden ist, das Hindurchfließen entweder der Komponente oder des Materials unter normalen Schwerkraftbedingungen zu verhindern vermag,und wobei es das Hindurchfließen entweder der Komponente oder des Materials unter Einwirkung-einer Kraft, die wesentlich größer als die normale Schwerkraft ist,z.B. einer durch Zentrifugieren erzeugten Kraft (z.B. bis zum 1500-fachen der normalen Schwerkraft), gestattet;

(5) Zentrifugieren der zusammengefügten Behälter zur Vereinigung der Inhalte und Bildung einer gefärbten Flüssigkeit durch Bewegen; und

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(6) Messung der optischen Dichte der gefärbten Flüssigkeit.

Die Vorrichtung zur Ausführung der vorliegenden Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung erläutert.

Fig. 1 ist eine Querschnittsansicht der bevorzugten Vorrichtung gemäß der Erfindung unmittelbar vor dem Zentrifugieren}

Fig. 2 ist eine Querschnittsansicht der Vorrichtung von Fig.1 . entlang der linie 2-2 in Fig. 1; und

Fig. 3 ist eine perspektivisch auseinandergezogene Ansicht der Vorrichtung gemäß Fig. 1.

Die Bezeichnung "chemische Blutsubstanz^w, wie sie hier verwendet wird,bezieht sich auf Cholesterin und weitere diagnostisch wichtige chemische Bestandteile des Blutes,wie z.B. Harnsäure» Bilirubin, Eiweiss, Glucose, Harnstoff usw..

Gemäß der vorliegenden Erfindung können die zur chemischen Blutanalyse benötigten Umsetzungsteilnehmer dem !abortechniker in abgemessenen Mengen in geeigneten Behältern übermittelt werden, der dann lediglich in einen der Behälter eine Probe eines Blutderivates hineingibt,die beiden Behälter durch das Filtermittel zusammenfügt, diese Anordnung zentrifugiert und die optische Dichte der erhaltenen gefärbten Flüssigkeit mißt, wobei die Notwendigkeit zur Abmessung und Übertragung der verschiedenen Umsetzungsteilnehmer von Hand ausgeschaltet wird und somit die mit solchen Arbeiten verbundenen individuellen Fehler vermindert werden.

Das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung sind zur Verwendung für chemische Blutsubstanzen geeignet, deren Bestimmung auf die folgende Arbeitsweise begrenzt wird:

(1) Zubereitung einer Flüssigkeit,die die zu analysierende

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chemische Blutsubstanz in umsetzungsfähiger Form enthält; d.h. in einer Form,die mit einem Testmaterial unter Bildung einer gefärbten Flüssigkeit mit einer optischen Dichte zu reagieren vermag, die von der Konzentration der chemischen Blutsubstanz abhängt;

(2) Vereinigen dieser Flüssigkeit mit dem Testmaterial, um die gefärbte Flüssigkeit zu bilden; und

(3) photometrische Messung der optischen Dichte der gefärbten Flüssigkeit.

Die Bestimmung des "Gesamt"-Cholesterins gemäß dem in "Henry" (vgl. oben,Seite 855) beschriebenen Verfahren kann z.B. gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt durchgeführt werden:

Eine abgemessene Probe des Blutserums,welches das Cholesterin enthält, wird in eine erste Kammer, z.B. eine Glasflasche,die eine zuvor abgemessene Menge Eisen-III-chlorid-Essigsäure-Reagenz enthält,eingebracht. Dieses Reagenz fällt Eiweiss aus und extrahiert Cholesterin und Cholesterinester aus dem Serum. Ein Verbindungsglied mit einem Filtermittel wird dann mit der ersten Kammer verbunden und diese Anordnung wird dann mit einem zweiten Behälter,z.B. einer zweiten Glasflasche, zusammengefügt, die eine zuvor abgemessene Menge an konzentrierter Schwefelsäure enthält. Das Filtermittel gestattet es, die Anordnung während des Verbindens mit dem zweiten Behälter umzudrehen, wobei das Entweichen des Inhaltes des ersten Behälters vermieden und ein Verschütten von Schwefelsäure aus dem zweiten Behälter verhindert wird. Das Zentrifugieren verursacht das Hineinfiltrieren des Inhaltes des ersten Behälters in den zweiten Behälter, wobei zwei Schichten gebildet werden, die, wenn sie anschließend durch vorsichtiges Bewegen vermischt werden,eine gefärbte Flüssigkeit bilden. Die optische Dichte der gefärbten Flüssigkeit wird dann gemessen und in Beziehung zur Konzentration des "Gesamt"-Cholesterins gemäß bekannten rechnerischen oder graphischen Methoden gesetzt.

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Wenn nur die Konzentration der Cholesterinester im Blut bestimmt werden soll,wird ein Blutderivät,das Cholesterin nur in Esterform enthält, gegen die Blutprobe in dem obigen Beispiel ausgetauscht.Ein solches Blutderivat kann beispielsweise durch Ausfällung des freien Cholesterins aus einer Probe des Blutserums in einem Äthanol-Äther-Lösungsmittel mittels Zugabe von Digitonin, Einengen" der Lösung bis zur Trockne,Extraktion der Cholesterinester aus dem Rückstand mit Petroläther, Verdampfen des Petroläthers und Auflösen der zurückbleibenden Cholesterinester in Essigsäure hergestellt werden.Dieses Verfahren wird genauer in "Henry" (vgl. oben, Seiten 857-858) beschrieben.

Bestimmungen von Bilirubin in Blutserum nach einer Modifikation des Malloy-Evelyn-Verfahrens [Malloy and Evelyn, "J. Biol. Chem.^w, 119t 481 (1937)] können gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Einbringen einer abgemessenen Probe des Blutserums, das Bilirubin enthält, in eine erste Kammer, welche eine abgemessene Menge einer Methanol-Wasser-Salzsäure-Lösung enthält, Anfügen eines Verbindungsgliedes mit einem Filtermittel, Verbinden dieser Anordnung mit einem zweiten Behälter, der ein Diazoniumsalz enthält, welches mit Bilirubin unter Bildung des gefärbten Azobilirubins reagiert, Zentrifugieren, um den Inhalt des ersten Behälters in den zweiten Behälter zu filtrieren und eine gefärbte Azobilirubinlösung zu bilden, und Inbeziehungsetzen der optischen Dichte der gefärbten Azobilirubinlösung mit der Konzentration des Bilirubins in der Blutserumprobe mittels bekannter Maßnahmen, wie sie oben beschrieben worden sind, durchgeführt werden.

In ähnlicher Weise kann die Konzentration an Harnsäure in Blutserum gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden, indem man eine Probe des Blutserums in ein Gemisch von Wolframsäure und Phosphorwolframsäure in die erste Kammer hineingibt, diese Kammer mit Hilfe des Filtermittels mit einer zweiten Kammer mit wässrigem Natriumcarbonat verbindet, die Anordnung zentrifugiert, um den Inhalt des ersten Behälters in den zwei-

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ten Behälter zu filtrieren, durch Bewegung eine gefärbte Flüssigkeit bildet und die optische Dichte der gefärbten Flüssigkeit mißt, wobei die optische Dichte dann mit der Konzentration an Harnsäure in Beziehung gebracht werden kann.

Um das Eingießen der gefärbten Lösung in eine geeignete Küvette zur Messung der optischen Dichte zu vermeiden, wird es bevorzugt, daß der Behälter, in dem die gefärbte Lösung gebildet wird,durchsichtig und zur Verwendung in den üblichen Spektrophotometern geeignet ist.

Das Filtermittel gemäß der Erfindung kann aus jedem Material bestehen, das gegenüber den bei der gewünschten Bestimmung verwendeten Reagentien beständig ist; das Filtermaterial darf z.B. keinem wesentlichen chemischen Abbau unterliegen und auch keine wesentlichen Mengen der chemischen Stoffe adsorbieren, die beim Zentrifugieren durch das Material hindurchfließen. Venn das Filtermittel mit dem einen Behälter verbunden ist, muß es ausreichend kompakt sein, um den Durchfluß von Reagentien unter normalen Schwerkraftbedingungen zu verhindern (z.B.,wenn die Vorrichtung zusammengesetzt wird), es muß jedoch ausreichend porös sein, um das Hindurchfließen von solchen Reagentien unter Einwirkung einer Kraft, die wesentlich größer als die normale Schwerkraft ist (z.B. beim Zentrifugieren) zu gestatten. Es wird angenommen,daß,wenn das Filtermittel mit dem einen der Behälter verbunden ist und die Anordnung umgedreht wird, um den flüssigen Inhalt des Behälters in Berührung mit dem Filter zu bringen,ein partielles Vakuum in dem Behälter erzeugt wird,indem eine kleine Menge der darin enthaltenen Flüssigkeit in das Filter eindringt. Der Druck über dem Filter wird dadurch ausgeglichen,wodurch die Übertragung von Flüssigkeit durch das Filter hindurch verhindert wird. Während des Zentrifugieren entwickelt sich ein großer Druckunterschied über dem Filtermittel, der die praktisch vollständige Übertragung der Flüssigkeit durch das Filter hindurch in denjenigen Behälter, der von der Drehachse der Zentrifuge am weitesten entfernt ist, verursacht.

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Filter, die aus chemisch beständigen Polymerisaten (z.B. Polyolefinen, Fluorkohlenstoff polymerisaten und dgl.) hergestellt sind, sind für das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung geeignet. Filter aus Polyolefinfasern, insbesondere aus Polypropylenfasern, werden bevorzugt. Es ist erwünscht, daß derartige Fasern hohe Verhältnisse von Oberfläche zu Volumen aufweisen. Filter, die gemäß dem im "U.S. Naval Research Laboratory Report" No. 111 437 vom 15 April 1954 unter dem Titel "Manufacture of Superfine Organic Fibers" beschriebenen Verfahren hergestellt sind, haben sich als besonders brauchbar erwiesen und werden für die erfindungsgemäßen Filter bevorzugt. Die Fasern,die gemäß diesem Verfahren hergestellt sind, werden nachfolgend als "superfeine" Fasern bezeichnet.

Die erfindungsgemäßen Filter sind vorzugsweise imstande, das ausgefällte Eiweiß aus den Flüssigkeiten, die während des Zentrifugierens durch sie hindurchlaufen, zu entfernen. Das Eiweiß wird z.B. aus Blutserum ,ausgefällt, wenn das Blutserum mit dem Eisen-III-chlorid-Essigsäure-Reagenz bei der Bestimmung des "Gesamf'-Cholesterins vermischt wird. Die Trübung, die durch ausgefälltes Eiweiß in den gefärbten Flüssigkeiten verursacht wird, welche bei den oben erläuterten "Gesamt^w-Cholesterinbestimmungen erhalten werden, kann die Genauigkeit merkbar, jedoch nicht schwerwiegend stören. Es können jedoch solche Polypropylenfaserfilter verwendet werden, die das ausgefällte Eiweiß abfiltrieren, wobei man die Filter mit "Leitungs"-Wasser behandelt, das eine Analyse aufweist, wie sie in dem untenstehenden Beispiel 1 angegeben 1st. Durch die Verwendung von in dieser Weise behandelten Filtern für das "Gesamt"-Cholesterinverfahren gemäß der Erfindung können ausgezeichnete Genauigkeit und Präzision erzielt werden.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in den Fig. 1-3 gezeigt, und zwar so, wie sie unmittelbar vor dem Zentrifugieren angeordnet ist.

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In Pig. 1 wird ein Paar von Glasfläschchen 10 bzw. 12 gezeigt, die eine zuvor abgemessene Lösung 14, welche eine chemische Blutsubstanz aus einem Blutderivat unter Bildung einer Komponente, die mit einem Testmaterial unter Bildung einer gefärbten Flüssigkeit reagiert, zu extrahieren vermag, bzw. ein zuvor abgemessenes Testmaterial 16, das mit der Komponente eine gefärbte Flüssigkeit mit einer optischen Dichte, die von der Konzentration der chemischen Blutsubstanz in dem Blutderivat abhängig ist, zu bilden vermag, enthalten. Die offenen Enden 18 bzw. 20 der Flaschen 10 bzw. 12 sind mit äusseren Gewinden 22 bzw. 24 versehen. Vor der Verwendung sind die Glasflaschen 10 bzw. 12, die die lösung 14 bzw. das Testmaterial 16 enthalten, mit Schraubverschlüssen (nicht gezeigt) für die lagerung versehen. Vor dem Zentrifugieren sind die Flaschen 10 und 12, wie es in Fig. 1 gezeigt ist, durch ein Verbindungsglied 26 verbunden, wobei die mit Gewindeenden 22 bzw. 24 der Flaschen 10 bzw. 12 in die Innengewinde 28 bzw. 30 der offenen Enden 32 bzw. 34 des Verbindungsgliedes 26 eingeschraubt sind, um flüssigkeitsdichte Verschlüsse zu erreichen. Das Verbindungsglied 26 ist mit einer inneren Oberfläche 35 versehen,die an einem Punkt 36 entlang ihrer länge ein Stützmittel 38» z.B. ein perforiertes, quer angeordnetes Diaphragma, aufweist, wobei gegen dieses Stützmittel ein Filter 40, das gegenüber der Lösung 14 und dem Testmaterial 16 chemisch beständig ist, dicht angeordnet ist. Beim Zentrifugieren wird das Filter 40 an der Weiterbewegung durch das Verbindungsglied 26 in der durch den Pfeil 42 angezeigten Richtung durch das perforierte,quer angeordnete Diaphragma 38 gehindert, welches jedoch das Hindurchfließen von Flüssigkeit leicht gestattet. Das Filter 40 ist luftdurchlässig und vermag,wenn es" mit einer oder beiden Flaschen 10 und 12 verbunden ist, das Hindurchlaufen jeder der Komponenten, die in der Flasche 10 oder dem Testmaterial 16 gebildet werden, bei normaler Schwerkraft zu verhindern, wobei es weiterhin das Hindurchfließen der Komponente oder des Materials 16 unter Einwirkung einer Kraft, die wesentlich größer als die normale Schwerkraft ist, gestattet.

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Unter Verwendung der obigen Vorrichtung kann das erfindungsgemäße Verfahren folgendermaßen ausgeführt werden, wobei die zu bestimmende chemische Blutsubstanz das "Gesamf-Cholesterin ist:

Der Schutzyerschluß der Flasche wird von der Flasche 10 entfernt, welche 3,0 ml einer 0,5#igen lösung von Eisen-III-chlorid in Eisessig enthält, und 0,020 ml Blutserum werden eingebracht. Das Ende 32 des Verbindungsgliedes 26, das ein Filter 40 enthält, wird auf das offene Ende der Flasche 10 dicht aufgeschraubt.

Die Anordnung wird umgedreht und auf das offene Ende einer Flasche 12 aufgeschraubt,die 2,0 ml konz. Schwefelsäure enthält. Die gesamte Anordnung wird dann in eine Zentrifuge gesetzt, wobei die Flasche 10 sich der Drehachse der Zentrifuge am nächsten befindet, und dann zentrifugiert, um das Hineinfiltrieren des Inhaltes der Flasche 10 in die Schwefelsäure zu bewirken. Die beiden Schichten, die in der Flasche 12 gebildet werden, werden durch vorsichtiges Bewegen unter Bildung einer gefärbten Flüssigkeit vermischt.Nachdem 10 Minuten lang stehen gelassen worden ist, wird die Flasche 12 (die noch immer durch das Verbindungsglied 26 mit der Flasche 10 verbunden ist),in ein Standard-Spektrophotometer gesetzt, und die optische Dichte (O.D.) wird gemessen und mit der Konzentration des Cholesterins durch Vergleich mit einer graphischen Darstellung der O.D. gegenüber der Cholesterinkonzentration in Beziehung gesetzt, wobei diese graphische Darstellung durch Durchführung des Verfahrens mit Standardlösungen, die bekannte Konzentrationen an Cholesterin enthielten,hergestellt worden war.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiterhin erläutern, den Erfindungsbereich jedoch nicht einschränken.

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Belspiel 1

Drei Essigsäure-Testlösungen, enthaltend 100, 200 und 300 mg Cholesterin pro 100 ml Lösung, wurden durch Auflösen bekannter Mengen an festem Cholesterin (Matheson, Coleman and Bell Co.) in Essigsäure hergestellt. Jede Lösung wurde in der erläuterten Vorrichtung wie folgt untersucht:

0,020 ml Testlösung wurden zu 3»0 ml Eisessig, der 0,05 % (G/V) FeCl-*6HpO enthielt, in einer ersten,mit Gewinde versehenen Glasflasche hinzugefügt. Ein Filtermittel, das dem in Fig. 1 erläuterten identisch war, wurde dicht auf die Glasflasche aufgeschraubt, wobei in dem Filtermittel ein Filter verwendet wurde, das folgendermaßen hergestellt worden war:

"Superfeine" Polypropylenfasern, von denen 95% einen größeren Durchmesser als 2,9 /u und 5 % einen größeren Durchmesser als 17t5 /u aufwiesen, wurden in die Form einer Matte gebracht, die anschließend mit Methyläthylketon und mit Leitungswasser von einem pH-Wert von 8,2 - 8,7 behandelt wurde. Filterkissen mit dem gewünschten Durchmesser wurden dann aus der behandelten Matte zurechtgeschnitten.

Die aus der Glasflasche und dem Filtermittel bestehende Anordnung wurde dann umgedreht und auf eine zweite durchsichtige Glasflasche mit einem durchschnittlichen inneren Durchmesser von 13,25 mm aufgeschraubt, die 2,0 ml konz. Schwefelsäure enthielt. Die Vorrichtung wurde dann bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 2000 rpm 3 Minuten lang zentrifugiert . Während des Zentrifugieren nahm das Filterkissen eine Stellung in einem Abstand von 6,98 cm von der Drehachse der Zentrifuge ein. Die auf das Filterkissen einwirkende Kraft wurde berechnet und betrug das 170-fache der normalen Schwerkraft. Das Filtrat, das durch das Filter hindurchlief, war durchsichtig und bildete eine getrennte Schicht auf der Schwefelsäure.Die Schichten wurden durch vorsichtiges Bewegen

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der Vorrichtung vermischt, wobei die Temperatur der erhaltenen lösung während dieser Zeit au:
Farbe darin entwickelt wurde.

lösung während dieser Zeit auf etwa 6O⁰C anstieg und eine rote

0,	104
0,	212
0,	312

Nachdem etwa 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen worden war, wurde die zweite Glasflasche (die noch immer durch das Filtermittel mit der ersten Glasflasche verbunden war) in den Küvettenhalter eines Coleman Junior Colorimeters (Coleman Instruments Cb.) unter Verwendung eines einfachen Adapters gesetzt * und die optische Dichte der gefärbten lösung wurde bei 560 nyu wie folgt gemessen:

Konzentration Optische Dichte

mg Cholesterin pro 100 ml

100 200 300

Durch Auftragen der Konzentration gegenüber der optischen Dichte auf rechtwinkligem Koordinatenpapier wurde eine Standardkurve erhalten, die praktisch linear war.

Das obige Verfahren wurde unter Verwendung von Blutserumproben, die unbekannte Mengen an Cholesterin enthielten, wiederholt. Die optische Dichte jeder gefärbten Lösung wurde zu der Cholesterinkonzentration unter Anwendung der oben erhaltenen Eichkurve in Beziehung gesetzt. Gleichlaufend wurden mit diesen Blutserumproben Bestimmungen unter Anwendung des verbreitet verwendeten Verfahrens von Abell et al. durchgeführt, das von Henry, R, J. in "Clinical Chemistry: Principles and Techniques¹¹, Harper and Row, New York, 1965, Seiten 852-855, beschrieben wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

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Tabelle I

	m« Cholesterin/ 100 ml	Blutserum
Probe Nr.	erfindungsgemäßes Verfahren	Verfahren von Abell et al.
1	161	165
CVl	141	142
3	183	206
4	201	207
5	359	390
6	292	300
7	280	282
8	343	338
9	200	187 "
10	216	198
11	247	230
12	188	184
13	179	159
14	185	225
15	207	209
16	197	187
17	183	189
18	238	211
19	168	161
20	286	276
21	183	185

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DIe Werte nach Abell et al. wurden auf rechtwinkligem Koordinatenpapier gegenüber den entsprechenden Werten, die bei de» erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, aufgetragen. Eine Linie wurde durch diese Wertepunkte nach der Methode der kleinsten Quadrate gezogen und ergab eine Neigung von 1,023. Ein "Korrelationskoeffizient" (Dixon, W.J. and Massey, F.J., Introduction to Statistical Analysis» 2nd Edition, McGraw-Hill, New York, 1957, Kap. 11)von 0,286 mg/ 100 ml wurde aus den obigen Werten erreohnet, was eine ausgezeichnete Übereinstimmung zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem Verfahren nach Abell et al. anzeigt.

Beispiele 2 bis 5

Unter Anwendung des allgemeinen Verfahrens von Beispiel 1 können quantitative Bestimmungen von Harnsäure, Eiweiß, Harnstoff und Glucose erhalten werden* Testparameter für diese Bestimmungen sind in Tabelle II angegeben.

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Tabelle II

Beispiel

chemiecht Blutsubstanz

1»Flasche

Umsetzungsteilnehmer

2»flasche Optische Sichte» gemessen bei

Schrifttumsstelle

Harnsäure (0,1 ml Blut, serum)

(D .

Wolframsäure/ Pho spho rw olfram säure (3,05 ml)

g wässriges

NO

₂₃ (0,75 ml) 660 m /U

(nach 15 min Stehen)

Henry,R.J. et al·, Am.J.CllPuPathol. 28| 152/645

OO
-Jb

Protein (0*070 ml) (Blutserum)

wässrige NaOH-Lösung (3,5 ml)

"Bioret"-Re-. agenz (0,7 ml) (vgl. Schrifttumsstelle) 545 m ,u

(nach 15 min Stehen)

Henry,R.J. et al.\ Anal. Chem. 29t 1491 (1957;

Harnstoff (0,5ml Blutserum)

10?£ige wässrige Trichloressigsäure (3,0 ml)

(2)

modifiziertes Ehrlich-Reagenz (1,0 ml) 425 m/U

(nach 4 min Stehen) ·

Levine,J.M. et al. Clin. Chem. 7:

Glucose (0,05 ml Blutserum)

3#ige wässrige Trichloressigsäure (1,0 ml)

6% o-Toluidin in Bisessig (3,0 ml) 625 m/U (nach

10 min langem Sieden in der 2.Flasche und Abkühlen)

Hultman, E.

Nature 183: 108 IT959J

(1) Hergestellt durch Vereinigen von 0,75 ml eines aus gleichen Volumenteilen bestehenden Gemisches von 0,67 η H₂SO, und 10bigem wässrigem Natriumwolframat mit 2,3 al des Phosphorwolf ramsäure-Reagenz, ftas^bei Henry,R.J., "Clinical Chemistry» Principles and Techniques", Harper and Row, New York, 1965, S.279 beschrieben ist.

(2) Hergestellt durch Vereinigen von 5,0 g p-Dimethylaminobenzaldehyd, 20 ml konz. HCl und 80 ml dest. Wasser.

Claims

-16- * μ 2682

Patentansprüche ;

Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer chemischen Blutsubstanz, dadurch gekennzeichnet,daß man nacheinander: . (1) einen ersten Behälter mit einer Lösung vorsieht, die eine chemische Blutsubstanz aus einem Blutderivat unter Bildung einer Komponente zu extrahieren vermag, die imstande ist,mit einem Testmaterial unter Bildung einer gefärbten Flüssigkeit,die eine optische Dichte aufweist, welche von der Konzentration der chemischen Blutsubstanz in dem Blutderivat abhängig ist, zu reagieren;

(2) in den ersten Behälter eine Probe eines Blutderivates einbringt, die die chemische Blutsubstanz enthält, um die Komponente zu bilden;

(3) einen zweiten Behälter vorsieht, der das Testmaterial enthält;

(4) die Behälter durch ein luftdurchlässiges Filtermittel zusammenfügt, welches die Lösung in dem ersten Behälter und das Material in dem zweiten Behälter normalerweise voneinander trennt und gegenüber dem Material und der Lösung chemisch beständig ist, wobei das Filtermittel das Hindurchfliessen mindestens entweder der Komponente oder des Materials unter normalen Schwerkraftbedingungen zu verhindern vermag und weiterhin das Hindurchfliessen mindestens der Lösung oder des Materials unter Einwirkung einer Kraft, die wesentlich größer als die normale Schwerkraft ist, gestattet;

(5) die zusammengefügten Behälter zentrifugiert, um das Material und die Komponente zu vereinigen und durch Bewegen eine gefärbte Flüssigkeit in einem der Behälter zu bilden? und

(6) die optische Dichte der gefärbten Flüssigkeit misst.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

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einer der Behälter im wesentlichen für Licht durchlässig ist, und daß man die optische Dichte der gefärbten Flüssigkeit in einem der Behälter mißt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Blutsubstanz Cholesterin ist, daß die Lösung aus Essigsäure und Eisen-III-chlorid besteht, und daß das Testmaterial konzentrierte Schwefelsäure ist.
4. Verfahren zur Messung der Konzentration an Cholesterin in einem Blutderivat,dadurch gekennzeichnet, daß man nacheinander

(a) einen ersten Behälter mit einer zuvor abgemessenen Lösung von Eisen-III-chlorid und Essigsäure vorsieht;

(b) einen durchsichtigen zweiten Behälter mit einer abgemessenen Menge an konzentrierter Schwefelsäure vorsieht;

(c) in den ersten Behälter eine Probe eines Blutderivates, das Cholesterin enthält, unter Bildung einer Komponente einbringt, die mit konz. Schwefelsäure unter Bildung einer gefärbten Flüssigkeit zu reagieren vermag;

(d) die Behälter durch ein luftdurchlässiges Filtermittel zusammenfügt, das gegen die Lösung und gegen die Schwefelsäure chemisch beständig ist und diese normalerweise voneinander trennt, wobei das Filtermittel das Hindurchfliessen der Komponente unter normalen Schwerkraftbedingungen zu verhindern vermag und das Hindurchfliessen der Komponente unter Einwirkung einer Kraft, die wesentlich größer als die normale Schwerkraft ist, gestattet;

(e) die zusammengefügten Behälter in einer Zentrifuge zentrifugiert, wobei der erste Behälter der Drehachse der Zentrifuge näher ist als der zweite Behälter, um die Komponente durch das Filter hindurch unter Bildung getrennter Schichten in den zweiten Behälter zu filtrieren;

(f) die Schichten unter Bildung einer gefärbten Flüssigkeit vermischt; und

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(g) die optische Dichte'der gefärbten Lösung mißt, während sie sich in dem zweiten Behälter befindet.
5. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung einer chemischen Blutsubstanz in einem Blutderivat, dadurch gekennzeichnet, daß sie

(a) einen ersten Behälter mit einer lösung, die eine chemische Blutsubstanz aus einem Blutderivat unter Bildung einer Komponente zu extrahieren vermag, die imstande ist, mit einem Testmaterial unter Bildung einer gefärbten Flüssigkeit zu reagieren,wobei der Behälter geeignet ist, eine Probe des Blutderivates aufzunehmen;

(b) einen zweiten Behälter mit einem Testmaterial, das mit der Komponente eine gefärbte Flüssigkeit zu bilden vermag, die eine optische Dichte aufweist, welche von der Konzentration der chemischen Blutsubstanz in dem Blutderivat abhängig ist;

(c) ein Verbindungsglied, das die Behälter in Ende-zuEnde-Beziehung verbindet, wobei das Verbindungsglied ein Filtermittel aufweist, das gegenüber der Lösung in dem ersten Behälter und dem Testmaterial in dem zweiten Behälter chemisch beständig ist und diese normalerweise voneinander trennt, wobei das Filtermaterial das Hindurchfliessen mindestens der Komponente oder des Materials unter normalen Schwerkraftbedingungen zu verhindern vermag und weiterhin das Hindurchfließen aus einem der Behälter in den anderen Behälter mindestens entweder der Komponente oder des Materials unter Einwirkung einer Kraft, die wesentlich größer als die normale Schwerkraft ist,gestattet, um in dem anderen Behälter eine gefärbte Flüssigkeit zu bilden, als Kombination aufweist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der andere Behälter eine durchsichtige Glasflasche ist.
7. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung einer chemischen Blutsubstanz in einem Blutderivat, dadurch gekennzeichnet,

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daß sie in Kombination

(a) ein Paar von durchsichtigen Glasflaschen, die jeweils mit Gewinden versehene offene Enden aufweisen, von denen die eine Flasche eine Lösung enthält, die eine chemische Blutsubstanz aus einem Blutderivat unter Bildung einer Komponente BU extrahieren vermag,die imstande ist, mit einem Testmaterial eine gefärbte Flüssigkeit zu bilden, und die andere Flasche ein Testmaterial enthält, das mit der Komponente eine gefärbte Flüssigkeit zu bilden vermag,die eine optische Dichte besitzt, welche-von der Konzentration der chemischen Blutsubstanz in dem Blutderivat abhängig ist; und

(b) ein röhrenförmiges Verbindungsglied zum Zusammenfügen der Flaschen in Ende-zu-Ende-Beziehung unter Bildung eines dichten Verschlusses, wobei das röhrenförmige Verbindungsglied mit einer inneren Oberfläche versehen ist, die an einem Punkt entlang seiner Länge mit einem Stützmittel -versehen ist j und ein Filtermittel,das ein luftdurchlässiges Filter aufweist,welches gegenüber der Lösung und dem Testmaterial chemisch beständig ist und sich innerhalb des röhrenförmigen Verbindungsglieds befindet und von dem Stützmittel zurückgehalten und getragen wird, wobei das Filtermittel das Hindurchfliessen der Komponente unter normalen Schwerkraftbedingungenjsu verhindern vermag und weiterhin das Hindurchfliessen der Komponente unter Einwirkung einer Kraft, die wesentlich größer als die normale Schwerkraft ist, gestattet, um in dem zweiten Behälter eine gefärbte Flüssigkeit zu bilden, deren optische Dichte gemessen werden kann,während sie sich in dem zweiten Behälter befindet, aufweist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Blutsubstanz Cholesterin ist, die Lösung aus Essigsäure und Eisen-III-chlorid besteht und das Testmaterial konzentrierte Schwefelsäure ist.

M 2682 E/Wr

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