DE3510992C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein mehrschichtiges Analysen­ element mit einer eine Oxidase enthaltenden Reagenzschicht und einer Trägerschicht für die Reagenzschicht.

Eine Analyse mittels Enzymreaktion ist zum Analysieren von flüssigen Proben geeignet, da diese Reaktion zu einem spezifischen Nachweis unter milden Bedingungen führt; insbesondere die Oxidasereaktion findet weitverbreitet Anwendung. Bei dieser Methode wird ein Probenmaterial oder sein Reaktionsprodukt durch eine Oxidase oxidiert, das dabei erzeugte Wasserstoffperoxid wird mit einer Peroxidase unter Bildung eines farbigen Materials umgesetzt und das farbige Material wird mittels Kolorimetrie bestimmt. Andere Nachweismethoden, wie Fluorometrie, Emissionsspektroskopie und verschiedene Elektroden stehen ebenfalls zur Verfügung.

Die bekannten Methoden zur kolorimetrischen Analyse von Wasserstoffperoxid schließen die Methode, bei der das "Trinder-Reagenz" (Ann, Clin, Biochem., Vol. 6, S. 24, 1969) verwendet wird, und die Methoden, bei denen ein oxidierbares Chromogen, wie o-Anisidin, Benzidin, o-Tolidin und Tetramethylbenzidin verwendet wird, ein. Bei diesen Methoden wird das durch die Wirkung einer Oxidase erzeugte Wasserstoffperoxid mit einer Peroxidase umgesetzt, das Produkt mit Aminoantipyrin und einem Phenol durch Oxidation gekuppelt, und das erzeugte Farbmaterial wird bestimmt oder das oxidierbare Chromogen wird direkt unter Bildung von Farbmaterial oxidiert. Dieses System hat den Vorteil, daß das gleiche Nachweismittel für zwei verschiedene Oxidasetypen verwendet werden kann. Daher ist seine Anwendung auf verschiedene Analysengegenstände weitgehend erforscht. Oxidase hauptsächlich für klinische Untersuchungen schließt ein: Glucose-Oxidase, Urecase, Cholesterin-Oxidase, Glyco-3-phosphorsäure-Oxidase, Cholin-Oxidase, Acyl-CoA-Oxidase, Sarcosin-Oxidase, verschiedene Aminosäureoxidasen, Bilirubin-Oxidase, Lactose-Oxidase, Brenztraubensäure-Oxidase, Galactose- Oxidase und Glycerin-Oxidase.

Bisher ist eine eine solche Oxidase, Peroxidase und Chromogen enthaltende Lösung für die Analyse von Kör­ perflüssigkeiten bei der klinischen Untersuchung verwendet worden.

Andererseits sind Reagenzien der vorstehenden Zusammen­ setzung, vollständig gemischt und getrocknet (nachstehend mit "festes Reagenz" bezeichnet), weitverbreitet verwendet worden, um den fundamentalen Anforderungen nach einer schnellen und einfachen Analyse gerecht zu werden.

So ist z. B. in der US-PS 36 30 957 ein Testfilm offen­ bart, der von einem Kunststoffilm, auf den ein Nachweissystem aus einer Dispersion dieser Oxidase und Peroxidase in einem Polymer aufgebracht ist, gebildet wird. In der US-PS 39 92 158 ist ein mehrschichtiger Testfilm beschrieben, bestehend aus einem flüssigkeitsundurchlässigen und lichtdurchlässigen Substrat, auf dem eine Reagenzschicht und eine Entwicklerschicht aufgebracht ist. Als modifizierte Mehrschicht-Testfilme sind offenbart: in der US-PS 40 66 403 ein Testfilm, dem eine Barrierenschicht zugefügt ist, in der US-PS 41 44 306 ein Testfilm mit einer Eintragungsschicht und einer Strahlenblockierschicht und in der US-PS 41 66 093 ein Testfilm mit einer Wanderungsblockierschicht. Die meisten dieser Ausführungsformen mit festem Reagenz enthalten Oxidase.

Bei diesen Methoden, bei denen Oxidase verwendet wird, kann mangelnde Sauerstoffzuführung Meßfehler durch Verminderung der Färbung verursachen.

Der für die Oxidation erforderliche Sauerstoff in einem festen Reagenz wird durch gelösten Sauerstoff in dem Reagenz und gelösten Sauerstoff im Reaktionssystem aus der Atmosphäre geliefert.

Wie jedoch aus der nachstehend wiedergegebenen theoretischen Überlegung hervorgeht, kann nur von dem in der Probe gelösten Sauerstoff keine ausreichende Reaktion erwartet werden.

Die Löslichkeit von Luft in reinem Wasser ist 0,0167 ml/ml bei 25°C und 1 atm, wovon 0,0057 ml/ml Sauerstoff sind (Chemical Handbook compiled by Chemical Society of Japan, Basic Chapter II, S. 621, 1965, Maruzen). 0,0057 ml/ml- gelöster Sauerstoff entspricht 25 μmol/dl; da aber auch andere Substanzen in der Probe gelöst sind, beträgt die tatsächliche Sauerstoffmenge weniger als 25 μmol/dl.

Bestandteile von normalem Blutserum sind z. B. 360-580 μmol/dl Glucose, 360-670 μmol/dl Cholesterin, 34-152 μmol/dl Triglycerid und 12-42 μmol/dl Harnsäure. In abnormen Fällen liegen diese Werte höher. Da das vorstehend beschriebene feste Reagenz der Probe im allgemeinen unverdünnt oder höchstens mehrere Male verdünnt zugegeben wird, ist es einleuchtend, daß allein der in der Probe gelöste Sauerstoff das Substrat nicht vollständig oxidieren kann.

Würde daher nur der gelöste Sauerstoff verwendet werden, so wäre eine ausreichende Oxidation unmöglich, wenn die Konzentration über dem normalen Bereich liegt, sogar bei einer Substanz, die in sehr niedriger Konzentration im Serum vorliegt, wie z. B. Harnsäure, oder sogar bei an­ deren Substanzen, wenn ihre Konzentration in dem normalen Bereich liegt.

Bei dem vorstehend erwähnten mehrschichtigen Testfilm befindet sich die Oxidase in der Reagenzschicht zwischen der Probenentwicklungsschicht und der Trägerschicht, und der Sauerstoffmangel ist beachtlich.

Die Zeit, die erforderlich ist, um die Menge Sauerstoff, welche durch Verbrauch gesunken ist, wieder auf den speziellen Wert zurückzubringen, ist erheblich länger als die Reaktionszeit, da der aus der Atmosphäre stammende Sauerstoff nur nach Lösung in der flüssigen Probe dem festen Reagenz zugeführt wird. Dies ist für die Vereinfachung und Beschleunigung des Verfahrens äußerst ungünstig.

Auch der in der US-PS 36 03 957 beschriebene Testfilm, der nur aus einer Reagenzschicht auf einer Trägerschicht besteht, hat einen Nachteil; die einzige Reagenzschicht kann die Wirkung eines direkten Kontaktes ihrer Oberfläche mit Luft nicht zeigen, da die auf die Reagenzschicht getropfte Probe eine flüssige Schicht zwischen der Reagenzschicht und der Luft bildet. Es werden nur der in dem Reaktionssystem gelöste, vor der Reaktion anwesende Sauerstoff und eine kleine Menge Sauerstoff, die von dem Teil, der nicht von der Probe bedeckt wird, absorbiert wird, für die Oxidationsreaktion verwendet. Selbst bei einer einzigen Reagenzschicht wird der von der Oxidase benötigte Sauerstoff daher nicht vollständig geliefert, was zu ungenauen Analysen führt.

In der JA-OS 57-2 08 997 ist ein Mehrschicht-Testfilm offenbart, der zur Beseitigung des Nachteils des Sauerstoffdefizits die Oxidase in der äußersten porösen Entwicklungsschicht enthält. Wegen der porösen Natur der Oxidase enthaltenden Schicht, die eine größere Kontaktfläche für den atmosphärischen Sauerstoff bietet, ist diese Testfilmart im Vergleich zu dem Analysenelement mit nur einer Reagenzschicht auf einem Träger von größerer Wirksamkeit. Aber selbst bei diesem Testfilm ist die Menge Sauerstoff ungenügend, und es wurde ermittelt, daß das Problem besonders groß bei einer Probe ist, die eine hohe Konzentration der zu analysierenden Substanz enthält.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Analysenelement der eingangs angegebenen Art zur Verfügung zu stellen, das eine besonders hohe Meßgenauigkeit innerhalb von kürzester Zeit ermöglicht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zwischen der Reagenzschicht und der Trägerschicht eine hydrophobe, poröse und sauerstoffdurchlässige Schicht zur Zuführung von Sauerstoff zur Reagenzschicht vorgesehen ist.

Durch die erfindungsgemäß vorgesehene Schicht wird "von unten her" der Reagenzschicht zusätzlich Sauerstoff zugeführt, so daß die entsprechende Analysenreaktion schnell und eindeutig ablaufen kann. Hierbei reicht es jedoch nicht, daß diese Schicht allein sauerstoffdurchlässig ist. Vielmehr muß sie auch eine gewisse Porosität aufweisen, um in diesen Poren Sauerstoff einzulagern, so daß dieser Sauerstoff sofort verfügbar ist. Die hydrophobe Ausgestaltung dieser Schicht verhindert, daß bei der Herstellung des Analysenelementes die flüssig aufgetragene Reagenzschicht und bei der Durchführung der Analyse die zu untersuchende Probe in die Sauerstoffzuführungsschicht eindringt und so die Einlagerung von Sauerstoff in den Poren verhindert sowie die Sauerstoffzirkulation unterbindet. Das erfindungsgemäß ausgebildete Analysenelement läßt bei der Analyse von Proben mit besonders hoher Konzentration eine ausreichende Oxidation zu.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit der Zeichnung im einzelnen erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine schematische Seitenansicht eines beispielhaften Analysenelementes nach dem Stand der Technik;

Fig. 2 eine schematische Seitenansicht einer Aus­ führungsform eines Analysenelementes nach der Erfindung;

Fig. 3 eine schematische Seitenansicht eines anderen Beispiels für ein Analysenelement nach dem Stand der Technik;

Fig. 4 eine schematische Seitenansicht einer zweiten Ausführungsform des Analysenelementes nach der Erfindung;

Fig. 6, 7 und 8 Diagramme, die den zeitlichen Ablauf der Reaktion bei Verwendung von Ausführungsbeispielen des Analysenelementes nach der Erfindung zeigen.

Fig. 1 zeigt eine Analysenelement, wobei 1 die Reagenzschicht und 2 die Trägerschicht ist. Es wird einfach hergestellt, indem auf einen Träger ein Gemisch von einem Reagenz und einem filmbildenden Polymer als Binder aufgebracht und das Ganze danach getrocknet wird. Fig. 2 zeigt eine Ausführungsform des Analysenelementes nach der Erfindung. Es wird hergestellt aus einer in Fig. 1 gezeigten Trägerschicht, an die ein poröses hydrophobes Material (Sauerstoffzuführschicht 3) geklebt wird und auf das eine Reagenz aufgebracht wird, wonach das Ganze getrocknet wird. Die Reagenzschichten in den Fig. 1 und 2 enthalten Oxidase, ein Wasserstoffperoxid- Nachweisreagenz usw.

Wenn die Probe auf diese Analysenelemente aufgetropft wird, bildet sie auf jedem Gerät einen Tropfen. Bei dem in Fig. 1 gezeigten gebräuchlichen Analysenelement beginnt nach ein oder zwei Minuten sich Farbe rund um den Tropfen zu entwickeln und die Färbung geht langsam zur Mitte des Tropfenbereiches weiter. Aber am Schluß ist die Mitte des Tropfenbereiches nicht in der erwarteten Intensität gefärbt. Bei dem in Fig. 2 gezeigten Analysenelement dagegen beginnt eine gleichmäßige Farbentwicklung im ganzen Tropfenbereich, und schließlich wird die Färbung in der erwarteten Intensität beendet. Dieser Mangel bei Fig. 1 ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Menge Sauerstoff, die in der Probe gelöst ist, für die Oxidation nicht ausreicht und der Tropfen die Lösung von Sauerstoff in dem Reaktionssystem stört. Das heißt, in dem Bereich des Tropfenumfangs in Fig. 1, wo das Reaktionssystem in direktem Kontakt mit Luft ist, läuft die Reaktion vollständig ab, während im Mittelbereich die Reaktion unvollständig bleibt. Bei dem in Fig. 2 gezeigten Analysenelement läuft die Reaktion infolge der sauerstoffzuführenden Schicht gleichmäßig ab.

Bei der praktischen Prüfung wird die Probe nach einer angemessenen Reaktionszeit (1-2 Stunden) entfernt und der Zustand der Farbentwicklung mit bloßem Auge oder einem optischen Gerät festgestellt. Das in Fig. 1 gezeigte Analysenelement gibt ungenaue Ergebnisse, beruhend auf ungleichmäßiger niedriger Reaktionsgeschwindigkeit, während das in Fig. 2 gezeigte Analysenelement zufriedenstellende Ergebnisse liefert.

Fig. 3 zeigt die Grundstruktur des vereinigten Mehrlagen- Analysenelementes, das in der JA-OS 58-1 22 690 offenbart ist. Es enthält zusammengefaßt einen lichtreflektierenden Träger; eine Reagenzschicht 7, die ein Reagenz enthält, welches eine optisch nachweisbare Änderung durch Reaktion mit der zu bestimmenden Komponente erzeugt und gelöst wird oder ein Sol mit dem Lösungsmittel des Probensystems bildet; sowie eine Nachweisschicht 6, die die empfangene flüssige Probe zur Reaktionsschicht transportiert und das in der Reaktionschicht erzeugte oder reduzierte optisch nachweisbare Material gleichmäßig verteilt.

Fig. 4 zeigt ein Analysenelement, das mit einer Sauerstoffzuführ­ schicht 8 zwischen der Reaktionsschicht 7 und dem Substrat 9 der Fig. 3 versehen ist. Das zu einer Einheit zusammengefügte Mehrschicht-Analysenelement kann zur Bestimmung von verschiedenen Körperflüssigkeitskomponenten benutzt werden. Hier wird die Wirkung der sauer­ stoffzuführenden Schicht bei Verwendung der Ausführungsformen, die eine Oxidase und Wasserstoffperoxid-Nachweisreagenz in der Reagenzschicht enthalten, gezeigt. Wenn die Probe jeweils auf die Mehrschicht-Analysenelemente, wie sie in den Fig. 3 und 4 gezeigt sind, getropft wird, erreicht sie die Reagenzschicht unter einer gewissen Ausbreitung in der Nachweisschicht, breitet sich seitlich in der Zwischenfläche zwischen der Nachweisschicht und der Reagenzschicht aus und löst die Reagenzschicht. Die Probe, die die Reagenzschicht gelöst hat, wandert in die Nachweisschicht, und die gemischte Reaktionslösung, die alle Verbindungen der Reaktionsschicht enthält, wird in die Nachweisschicht transportiert. In jedem Fall wurde gleichmäßige Farbentwicklung festgestellt, aber das Mehrschicht-Analysenelement der Fig. 4 zeigte eine schnellere Reaktion und intensivere Färbung als das Gerät der Fig. 3. Dieser Unterschied in der Farbentwicklungsrate ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß das Mehrschicht-Analysengerät der Fig. 3 nur auf einer Seite (gegenüber dem Substrat) des Reaktionssystems in Kontakt mit der Luft steht, während das in Fig. 4 gezeigte Gerät auf beiden Seiten des Reaktionssystems Kontakt mit der Luft hat, was eine sehr glatte Zuführung von Luft zu dem Reaktionssystem sichert.

Die sauerstoffzuführende Schicht hat eine poröse hydrophobe Struktur und ist aus einem Material hergestellt, das einer hydrophobierenden Behandlung unterworfen worden ist, z. B. aus Faservlies, Gewebe, Papier, Metallmaschennetz, Nylonnetz und poröse Keramik. Wenn das Substrat ebenfalls als Sauerstoffzuführer dient, ist es aus einem Harz, wie Polyester, Acrylharz, Polyamid, Polystyrol, Polyurethan, Methacrylharz, Phenolharz, in poröser Struktur oder aus porösem hydrophoben Material, wie Zement, Keramik, Glasfilter, geformt. Die sauerstoffzuführende Schicht kann auch aus einem hydrophoben Polymeren hergestellt sein, das bei Raumtemperatur fest ist. Die Herstellung erfolgt in folgender Weise: Das Polymer wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst und darin wird ein anderes Lösungsmittel dispergiert, welches in dem organischen Lösungsmittel unlöslich ist und einen höheren Siedepunkt als dieses hat, um eine Emulsion zu bilden. Diese Emulsion wird auf den Träger aufgebracht, und beide Lösungsmittel werden getrocknet. Beispielhaft für solche hydrophoben Polymeren sind Celluloseacetat, Ethylcellulose, Poly­ vinylbutyral, Polystyrol, Polyurethan, Polyester, Acrylharze, Polyamid, Phenolharze, Methacrylharze, Polyvinylacetat, Nitrocellulose und niedere Polymere von Polyaminosäuren.

Zur weiteren Veranschaulichung der sauerstoffzuführenden Schicht dienen die folgenden Beispiele:

Beispiel 1

Zwei Filmtypen wurden hergestellt, ein einfacher weißer Polyesterfilm einer Dicke von 0,125 mm und der gleiche weiße Polyesterfilm, beschichtet mit einem porösen hydrophoben Film als sauerstoffzuführende Schicht (unter dem WZ "Cellopore" in den Handel gebracht, hergestellt aus Polyethylen einer Dicke von 150 μm) unter Verwendung eines beidseitig beschichteten Bandes. Darauf wurde eine Überzugslösung der weiter unten ange­ gebenen Zusammensetzung in einer Dicke von 0,2 mm aufgetragen und getrocknet, um eine Reagenzschicht zu bilden, die Farbe entsprechend der Menge Glucose entwickelt. Diese Filme wurden in 10 mm×10 mm große Stücke geschnitten, und 50 μl der Probe von 90 mg/dl (500 μmol/dl) wäßriger Glucoselösung wurde in die Mitte jedes Stückes getropft. Die aufgetropfte Probe sickerte z. T. in die Reagenzschicht ein, aber der größere Teil bildete einen Tropfen auf der Oberfläche der Reagenzschicht. Bei dem Stück mit der Reagenzschicht direkt auf dem Polyesterfilm (nachstehend mit Type A bezeichnet) begann die Farbentwicklung langsam vom Rande des Tropfenbereiches aus. Am Schluß der Reaktion war die Mitte auch gefärbt, aber der Rand war deutlich dunkler als die Mitte. Bei dem Stück mit der Reagenzschicht auf dem porösen Film (nachstehend mit Type B bezeichnet) begann die Farbentwicklung im ganzen Tropfenbereich, und dieser war am Ende der Reaktion durchgehend gleichmäßig gefärbt. Die Reaktionsgeschwindigkeit war bei Typ B auch größer.

Zusammensetzung der Überzugslösung für die Reagenzschichtbildung für Type A und Type B
Celluloseacetat|8,0 g
1,2-Dichlorethan	70 ml
Glucose-Oxidase	200 mg
Peroxidase	200 mg
Polyvinyl-pyrrolidon (K-90)	150 mg
4-Aminoantipyrin	12 mg
1,7-Dihyroxinaphthalin	70 mg
Ethanol	8,0 ml
0,1M Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 7,5)	16 ml

Beispiel 2

Anstelle der porösen hydrophoben sauerstoffzuführenden Filmschicht der Type B des Beispiels 1 wurde eine Überzugslösung der weiter unten angegebenen Zusammensetzung auf den weißen Polyesterfilm in einer Dicke von 0,2 mm aufgebracht und zur Bildung einer porösen hydrophoben Struktur getrocknet. Mit diesem Analysenelement (Type C) wurde der gleiche Versuch, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Type C gab nahezu die gleiche Einheitlichkeit der Farbentwicklung wie Type B, jedoch war die Ent­ wicklungsgeschwindigkeit etwas kleiner als die der Type B. Im Fall der Type C wurde festgestellt, daß die gebildete sauer­ stoffzuführende Schicht die Eigenschaft einer sauerstoff­ zuführenden Schicht hatte, weil sie das vollständige Durchdringen der Überzugslösung zur Bildung der Reagenzschicht nicht zuließ.

Zusammensetzung der Überzugslösung zur Bildung der sauerstoffzuführenden Schicht
Polyvinylbutyral-Harz (Polymerisationsgrad: 700)|5 g
Aceton	50 ml
Wasser, gereinigt	10 ml
Netzmittel (Tween 20)	500 mg

Beispiel 3

Anstelle des weißen Polyesterfilms für die Type A des Beispiels 1 wurde eine Keramikplatte, deren Oberfläche einer Hydrophobierbehandlung unterworfen worden war, verwendet. Es wurde eine Analysenelement (Typ D) mit einem Substrat, kombiniert mit einer sauerstoffzuführenden Schicht, erhalten. Der gleiche Versuch wie in Beispiel 1 unter Verwendung dieses Gerätes Type D ergab eine Gleich­ mäßigkeit, Intensität und Farbentwicklungsgeschwindigkeit ähnlich wie bei Verwendung der Type B.

Beispiel 4

Um die Wirksamkeit der sauerstoffzuführenden Schicht zu prüfen, wurde der Reaktionszeitverlauf bei den in Beispiel 1 hergestellten Analysenelementen Type A und Type B durch Messung des Reflexionsvermögens bei 500 nm unter Verwendung eines Reflektormeters (Integrationskugel 220 A Spektrophotometer für Reflexions­ vermögensmessung an farbentwickeltem Serum a und Serum b bekannter Glucosekonzentration bestimmt.

Das Meßverfahren lief folgendermaßen ab:

• 1) Tropfe sowohl Serum a (Glucosekonzentration 82 mg/dl; 456 μmol/dl) sowie Serum b (Glucosekonzentration 320 mg/dl, 1778 μmol/dl) auf die Analysenelemente Type A und Type B, um die Reaktion zu starten.
  Verwende Reaktionszeiten, während welcher sich die Probe auf dem Analysenelement befindet, von 0 bis 4 Min., in Stufen von 30 Sekunden.
• 2) Wenn die jeweilige Reaktionszeit erreicht ist, wische überschüssige Probe mit absorbierender Baumwolle ab (nach Entfernen überschüssiger Probe ist die Oxidation nahezu beendet) und messe nach 1 Minute das Reflexionsvermögen, um die Oxidation zu bestimmen.

Der K/S-Wert wird aus dem Reflexionsvermögen nach folgender Gleichung berechnet:

K/S = (1 - R)²/(2×R)

in der bedeuten: K eine Konstante, S der Verlustkoeffizient eines bestimmten Reflexionsmediums, und R das Reflexionsvermögen.

Die Änderung des K/S-Wertes mit der Zeit (Zeitverlauf der Oxidationsreaktion) an Serum a ist in Fig. 5 und an Serum b in Fig. 6 gezeigt.

Dieses Verhältnis ist eine vereinfachte Kubelka-Munk- Gleichung (siehe "Reflectance Spectroscopy" von Gustav Krotum, S. 106-111, Springer-Verlag, 1969); der K/S-Wert ist linear proportional der Molkonzentration.

Wie aus den Fig. 5 und 6 zu ersehen, verläuft die Reaktion in einem Analysenelement mit einer sauerstoffzuführenden Schicht schneller ab und erreicht ihren Endpunkt in 2 bis 3 Minuten, während in einem Analysenelement ohne sauerstoffzuführender Schicht die Reaktionsgeschwindigkeit kleiner und eine schnelle genaue Bestimmung unmöglich ist.

Beispiel 5

Es wurden zwei Typen von Filmen präpariert, ein einfacher weißer Polyesterfilm einer Dicke von 0,125 mm und ein gleicher weißer Polyesterfilm, beschichtet mit einer sauerstoffzuführenden Membran­ filterschicht unter Verwendung von Doppelbeschichtungsstreifen. Darauf wurde eine Triglycerid- Überzugslösung der weiter unten angegebenen Zusammensetzung gleichmäßig in einer Dicke von 0,2 mm und einer Breite von 20 mm aufgebracht und bei 40°C 2 Stunden getrocknet, um eine Reagenzschicht zu erhalten. Danach wurde die Oberfläche der Reagenzschicht etwas angefeuchtet und ein 2 cm breites feines Baumwolltuch daran mittels Druck geklebt, um eine Nachweisschicht zu bilden. Diese Filme wurden in Beschichtungsrichtung der Reagenzschicht in zwei Hälften und dann in 5 mm Breite im rechten Winkel zur Beschichtungsrichtung geschnitten. So wurden zu einer Einheit zusammengefaßte mehrschichtige Analysenelemente für die Glycerinbestimmung mit 5 mm×10 mm Nachweisschicht und Reagenzschicht erhalten, sowie zu einer Einheit zusammengefaßte mehrschichtige Analysengeräte, die zusätzlich eine sauerstoffzuführende Schicht hatten.

Zusammensetzung der Überzugslösung für die Reagenzschichtbildung für Type E und Type F
Lipoprotein-Lipase|300 mg
Glycerin-Kinase	50 mg
Glycero-triphosphat-Oxidase	100 mg
Peroxidase	100 mg
Adenosintriphosphat	600 mg
4-Aminoantipyrin	350 mg
Natriumsalz des 3,5-Dimethoxy-N-ethyl-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-anilins	375 mg
Magnesiumchlorid	0,2 mg
Natriumalginat	1600 mg
0,2M Phosphorsäurepufferlösung (pH 8,0)	100 ml

Auf das Mehrschicht-Analysenelement, gebildet von einer Reagenzschicht, die direkt auf den weißen Polyesterfilm aufgebracht ist (hierin mit Type E bezeichnet), und auf das Mehrschicht-Analysenelement mit einer Reagenzschicht, die auf einem Membranfilter gebildet ist (hierin mit Type F bezeichnet), wurden 10 μl Serum C (Triglycerid- Konzentration 157 mg/dl, 1768 μmol/dl) getropft. Die dabei erhaltenen Reaktionskurven sind in Fig. 7 wiedergegeben.

Fig. 7 zeigt, daß die Type F eine größere Reaktionsgeschwindigkeit besitzt als Type E und beweist eine bemerkenswerte Wirkung der sauerstoffzuführenden Schicht, durch welche den beiden Seiten der Reagenzschicht Sauerstoff zur Verfügung gestellt wird.

Bevorzugte poröse hydrophobe Materialien, die als sauer­ stoffzuführende Schicht verwendbar sind, sind hydrophobe poröse Filme, hydrophobe Faservliese und Gewebe, hydrophobes Papier, Metallmaschendraht, Polyamidnetze, poröse Harze, Keramiken, die einer Oberflächen-Hydrophobierbehandlung unterworfen worden sind, poröses Glas und poröse Metallfolien. Es ist auch möglich, ein poröses hydrophobes Material, das an einer Seite hydrophob ist und auf dieser Seite mit der Reagenzschicht versehen ist, zu verwenden. Jedes poröse Material ist verwendbar, wenn es für die Beschichtungslösung zur Bildung der Reagenzschicht nicht völlig durchlässig ist.

Claims (3)

1. Mehrschichtiges Analysenelement mit eine Oxidase enthaltenden Reagenzschicht und einer Trägerschicht für die Reagenzschicht, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Reagenzschicht (1, 7) und der Trägerschicht (2) eine hydrophobe, poröse und sauerstoffdurchlässige Schicht (3, 8) zur Zuführung von Sauerstoff zur Reagenzschicht (1, 7) vorgesehen ist.

2. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die sauerstoffdurchlässige Schicht (3, 8) ein hydrophobiertes Faservlies, ein hydrophobiertes Gewebe oder ein hydrophobiertes Papier ist.

3. Analysenelement nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß oberhalb der Reagenzschicht (7) eine Nachweisschicht (6) vorgesehen ist.