DE3784390T2 - Zusammensetzung und analytisches Element mit stabilisiertem Peroxydase. - Google Patents

Zusammensetzung und analytisches Element mit stabilisiertem Peroxydase.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die klinische Chemie. Ganz speziell betrifft die Erfindung Bindemittelzusammen- Setzungen, analytische Elemente, die stabilisierte, mit Peroxidase markierte Ligandenanaloge enthalten und ihre Verwendung in analytischen Verfahren zur Untersuchung von Flüssigkeiten, z .B. biologischen Flüssigkeiten.
  • Es ist allgemein bekannt, quantitative oder qualitative Analysen einer wäßrigen Flüssigkeit durch Kontaktieren der Flüssigkeit mit einem analytischen Element durchzuführen, das eine Kombination von Reagenzien enthält, die dazu befähigt sind, ein bestimmbares Produkt zu erzeugen, im Verhältnis zur Konzentration des vorbestimmten Analyten in der Flüssigkeit. Im folgenden wird diese Kombination von Reagenzien als reaktive Zusammensetzung bezeichnet, die chemisch reaktiv, katalytisch aktiv oder in irgendeiner anderen Form zu einer chemischen oder physikalischen Reaktion befähigt ist, die schließlich zur Erzeugung einer Veränderung im Element führt, die mit geeigneten Verfahren und einer geeigneten Vorrichtung bestimmbar ist.
  • Ein Typ eines besonders geeigneten analytischen Elementes benutzt enzymatische Reaktionen, bei denen der Analyt bei Kontakt mit Reagenzien im Element mit Sauerstoffin Gegenwart eines geeigneten Enzymes unter Erzeugung von Peroxidase im Verhältnis zur Konzentration des Analyten reagiert. Ein bestimmbares Produkt wird dann durch Umsetzung des Peroxides im Verhältnis zur Konzentration des Analyten in der getesteten Flüssigkeit erzeugt. Derart geeignete Elemente sind bekannt.
  • Unglücklicherweise, aufgrund der bestimmten Reagenzien innewohnenden Instabilität und der Notwendigkeit, diese in Kontakt mit anderen Materialien trocknen zu müssen, können die in den Elementen enthaltenden Reagenzien während der Aufbewahrung abgebaut werden, wodurch die Genauigkeit und Zuverlässigkeit des Bestimmungsverfahrens nachteilig beeinflußt wird. Beispielsweise kann eine Exponierung mit Luft und Feuchtigkeit Peroxidase nachteilig beeinflussen, die oftmals in einem Element vorhanden ist, um die Oxidation von reaktiven Zusammensetzungen durch ein Peroxid zu katalysieren.
  • Peroxidasen werden für verschiedene Zwecke eingesetzt, einschließlich für diagnostische Bestimmungen von Analyten wie z. B. Glucose, Harnsäure, Cholesterin usw. Bei derartigen Bestimmungen kann überschüssige Peroxidase einem Element zugesetzt werden, um den Effekt eines Enzymabbaues während der Aufbewahrung zu überwinden. Jedoch sind Enzym-Immunoassays unter Verwendung von mit einer Peroxidase markierten Ligandenanalogen bedeutsam für die Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden, z. B. eines Arzneimittels, eines Antigens oder einer anderen immunologisch reaktiven Verbindung geworden. Bei derartigen Bestimmungsverfahren läßt sich überschüssige Peroxidase nicht zusetzen und der nachteilige Effekt ihrer Instabilität wird bedeutsamer, aufgrund der vergleichsweise geringen Konzentration an dem zu bestimmenden Liganden.
  • Die US-PS 4 283 491 beschreibt die Stabilisierung von Peroxidase in Elementen mit einem Vinylcopolymeren, hergestellt aus speziellen ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren. Diese Elemente enthalten weiterhin Reagenzien, die für die Bestimmung von speziellen Analyten erforderlich sind, z. B. von Glucose und Harnsäure. Immunoassays werden jedoch nicht beschrieben. Das beschriebene Copolymer ist in den Trägermaterialien des Elementes in einer Menge von 20 bis 50 Gew.-% enthalten. Der Rest der Trägermateralien kann aus einem oder mehreren einer Vielzahl von Bindemittelmaterialien bestehen, z. B. Gelatine, hydrophilen Cellulosen, Poly(vinylalkohol), Polysacchariden und anderen.
  • Es wurde jedoch gefunden, daß Peroxidase durch die in der US-PS 4 283 491 beschriebenen Materialien nicht ausreichend stabilisiert wird, wenn sie als eine Markierung in einem Ligandenanalog verwendet wird. Überdies ist das Problem der Peroxidasen-Instabilität akuter bei der Bestimmung einer niedrigen Ligandenkonzentration in einem Immunoassay, als im Falle einer Bestimmung von Analyten, wie beispielsweise Glucose oder Harnsäure, die im allgemeinen in Testflüssigkeiten in höheren Konzentrationen vorliegen. Infolgedessen besteht ein Bedürfnis nach einem Mittel zur Stabilisierung von Peroxidase-markierten Liganden-Analogen in trockenen Immunoassays.
  • Die oben beschriebenen Probleme werden nur nun überwunden mit einer wasserlöslichen Zusammensetzung mit einem Peroxidase-markierten Liganden-Analog, wobei die Zusammensetzung gekennzeichnet ist, dadurch, daß sie eine wasserlösliche Bindemittelzusammensetzung enthält, die als alleinigen Stabilisator für den Liganden-Analog mindestens 50 Gew.-% Poly(vinylalkohol) enthält.
  • Durch diese Erfindung wird ferner ein analytisches Element für die Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden bereitgestellt, das ein absorbierendes Trägermaterial aufweist, wobei das Element gekennzeichnet ist, dadurch, daß es die oben beschriebene wasserlösliche Zusammensetzung enthält'.
  • Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden, das die folgenden Stufen umfaßt:
  • A. Kontaktieren einer Probe einer Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält, in Gegenwart eines Rezeptors für den Liganden mit dem oben beschriebenen Element, wobei das Kontaktieren in einer solchen Weise ausgeführt wird, daß ein Komplex von Rezeptor und Liganden- Analog erzeugt wird, und
  • B. Bestimmen der Menge des Liganden als Ergebnis des Vorhandenseins von komplexem oder unkomplexem Liganden-Analog.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel für die Stabilisierung von mit Peroxidase markierten Liganden-Analogen in analytischen Elementen bereit. Die Peroxidase wird ausreichend stabilisiert, so daß sie in den Elementen in niedrigen Konzentrationen vorliegen kann. Infolgedessen können Analyten, z. B. immunologisch reaktive Liganden, die in einer Testflüssigkeit in niedrigen Konzentrationen vorliegen, rasch und genau bestimmt werden. Diese Vorteile werden dadurch erreicht, daß das Liganden-Analog in eine wasserlösliche Bindemittelzusammensetzung eingebracht wird, die mindestens 50 Gew.-% Poly(vinylalkohol) enthält. Diese Zusammensetzung ist der alleinige Stabilisator, der im Falle dieser Erfindung verwendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung (qualitative oder quantitative Messungen) eines immunologisch reaktiven Liganden in wäßrigen Flüssigkeiten. Ganz speziell läßt sich die Erfindung verwenden zur Untersuchung biologischer Flüssigkeiten von Tieren oder Menschen. Zu derartigen Flüssigkeiten gehören beispielsweise, wobei die folgende Aufzählung nicht in begrenzendem Sinne zu verstehen ist, ganzes Blut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Urin, spinale Flüssigkeit, Sputum, Schweiß und dgl., wie auch Stuhlabscheidungen. Es ist ferner möglich, flüssige Präparate von menschlichem oder tierischem Gewebe zu untersuchen, beispielsweise Gewebe von Skelettmuskeln, dem Herzen, Nieren, Lungen, dem Gehirn, Knochenmark oder der Haut.
  • Bei der erfindungsgemäßen Bestimmung stehen der zu bestimmende Ligand und das entsprechende markierte Liganden-Analog im Wettbewerb um eine fixierte Menge eines gemeinsamen Reaktanten. Dieser Reaktant, der speziell den Liganden und das Liganden-Analog erkennt und unter Bildung von Komplexen mit diesen reagiert, wird hier als Rezeptor bezeichnet.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit einem trockenen analytischen Element durchgeführt. Im einfachsten Falle kann das Element bestehen aus einem absorbierenden Trägermaterial, z. B. einem dünnen Blatt eines selbsttragenden absorbierenden oder saugfähigen Materials, z. B. Filterpapier oder Filterstreifen, die die Bindemittelzusammensetzung wie im folgenden beschrieben enthalten und irgendwelche anderen erwünschten Reagenzien. Alternativ können die Reagenzien, die für eine Bestimmung benötigt werden, dem Element zum Zeitpunkt der Bestimmung zugegeben werden. Das Element kann in zwei oder mehrere diskrete Zonen aufgeteilt werden, wobei verschiedene Reagenzien in individuelle Zonen des Trägermaterials einverleibt werden können. Derartige Elemente sind als Teststreifen, diagnostische Elemente, Tauchstreifen oder diagnostische Materialien bekannt.
  • Geeignete absorbierende Trägermaterialien sind in Wasser unlöslich und behalten ihre strukturelle Integrität bei, wenn sie der Einwirkung von Wasser oder biologischen Flüssigkeiten, wie ganzem Blut oder Serum ausgesetzt werden. Geeignete Elemente lassen sich herstellen aus Papier, porösen teilchenförmigen Strukturen, porösen polymeren Folien, Cellulose, Glasfasern oder gewebten oder nichtgewebten textilen Gebilden (synthetischer und nichtsynthetischer Art). Geeignete Materialien und Verfahren zur Herstellung derartiger Elemente sind bekannt und werden beispielsweise beschrieben in den US-PS 3 092 465, 3 802 842, 3 915 647, 3 917 453, 3 936 357, 4 248 829, 4 255 384, 4 270 920 und 4 312 834.
  • Vorzugsweise liegt das absorbierende Trägermaterial des trockenen analytischen Elementes dieser Erfindung in Form einer porösen Ausbreitzone vor. Diese Zone kann selbsttragend sein (d. h. aus einem Material aufgebaut sein, das stark genug ist, um die Integrität der Zone aufrechtzuerhalten), befindet sich jedoch vorzugsweise auf einem separaten Träger. Ein solcher Träger kann aus irgendeinem dimensionsstabilen und vorzugsweise nicht porösen und transparenten Material bestehen, das für elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchlässig ist. Ein Träger der Wahl für ein spezielles Element sollte dem beabsichtigten Bestimmungsverfahren angepaßt sein (Fluoreszenz-, Transmissions- oder Reflexions-Spektroskopie). Geeignete Träger können hergestellt werden aus Papier, Metallfolien, Folien von Polystyrol, Polyestern, Polycarbonaten oder Celluloseestern.
  • Die poröse Ausbreitzone des Elementes kann hergestellt werden aus irgendeinem geeigneten fasrigen oder nichtfasrigen Material oder Mischungen von einem oder beiden, wie es beispielsweise beschrieben wird in den US-PS 4 292 272, 3 992 158, 4 258 001 und 4 430 436 sowie der Japanischen Patentpublikation 57(1982)-101760. Wünschenswert ist, daß die Ausbreitzone isotrop porös ist, was bedeutet, daß die Porosität in jeder Richtung in der Zone gleich ist, was bewirkt wird durch miteinander verbundene Hohlräume oder Poren zwischen Teilchen, Fasern oder polymeren Strängen.
  • Die Elemente können zwei oder mehrere diskrete Zonen aufweisen, entweder in der gleichen Schicht oder übereinanderliegend. Mindestens eine hiervon ist vorzugsweise eine poröse Ausbreitzone. Die anderen Zonen können Reagenszonen sein, Registrierzonen, zusätzliche Ausbreitzonen, die Strahlung blockierende Zonen oder Filterzonen, die Haftung verbessernde Zonen, Trennzonen und dgl., wie sie bekannt sind. Diese Zonen befinden sich im allgemeinen in Strömungskontakt miteinander, was bedeutet, daß Flüssigkeiten, Reagenzien und Reaktionsprodukte (beispielsweise Farbstoffe) zwischen Regionen benachbarter Zonen transportiert werden können oder diese passieren können. Mit anderen Worten, wird das Element mit Flüssigkeit in Kontakt gebracht, so werden Reagenzien miteinander vermischt und' vermögen sich leicht innerhalb des Elementes zu bewegen. Vorzugsweise ist eine jede Zone eine getrennt aufgetragene Schicht, obgleich zwei oder mehrere Zonen separate Bereiche in einer einzelnen Schicht des Elementes sein können.
  • Das mit Peroxidase markierte Liganden-Analog kann in irgendeiner Zone oder Schicht vorliegen, solange es gleichförmig in dem wasserlöslichen Bindemittel, wie im folgenden beschrieben, verteilt vorliegt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bildet die wasserlösliche Bindemittelzusammensetzung eine ausgeprägte Zone oder Schicht im Element. In ganz besonders vorteilhafter Weise befindet sich diese Zone oder Schicht benachbart zur porösen Ausbreitschicht, obgleich die zwei Schichten durch eine haftverbessernde Schicht oder Zwischenschicht voneinander getrennt sein können, sofern dies erwünscht ist.
  • Die Praxis dieser Erfindung ermöglicht die Bestimmung der Menge eines unbekannten Liganden in einer Flüssigkeitsprobe. Der Ligand kann aus einer beliebigen immunologisch reaktiven Verbindung bestehen, einschließlich von z. B. Antigenen, Haptenen, Antikörpern, Toxinen, Hormonen, therapeutischen Arzneimitteln, natürlichen oder synthetischen Steroiden, Proteinen und anderen Spezies, die zu einer Komplexbildung, speziell mit einem entsprechenden Rezeptor befähigt sind.
  • Diese Erfindung ist besonders geeignet für die Bestimmung von therapeutischen Arzneimitteln, z. B. Digoxin.
  • Das Liganden-Analog, das für diese Erfindung geeignet ist, wird erzeugt unter Anwendung irgendeiner geeigneten, dem Fachmann bekannten Technik. Im allgemeinen werden die Liganden-Analogen hergestellt durch covalente Bindung der Peroxidase-Markierung an das Ligandenmolekül, das in irgendeiner geeigneten Weise modifiziert sein kann, um die Bindung zu erreichen.
  • Das mit Peroxidase markierte Liganden-Analog ist in einer wasserlöslichen Bindemittelzusammensetzung gleichförmig verteilt, die Poly(vinylalkohol) in einer Menge von mindestens 50 Gew.-% und bis zu 100 Gew.-% der Bindemittelzusammensetzung enthält (d. h. des gesamten Bindemittelgewichtes). Vorzugsweise bestehen mindestens 80 Gew.-% der Zusammensetzung aus Poly(vinylalkohol). Der Rest der Bindemittelzusammensetzung kann aus einem oder mehreren synthetischen oder natürlichen Bindemittelmaterialien bestehen, die in solchen Mengen vorliegen, daß sie die Wasserlöslichkeit der Zusammensetzung nicht nachteilig beeinflussen. Beispiele für geeignete Bindemittelmaterialien, die in Kombination mit Poly(vinylalkohol) verwendet werden können, bestehen beispielsweise aus Gelatine, Polyacrylsäure, Poly(acrylamid-co- N-vinyl-2-pyrrolidon) Gew.-Verhältnis 50:50 und ähnlichen Copolymeren, Poly(N-vinyl-2-pyrrolidon), Polyacrylamid, aus wasserabsorbierenden stärkeenthaltenden Polymeren, wie sie beispielsweise beschrieben werden in der US-PS 3 935 099 und ähnlichen Materialien.
  • Die Beschichtungsstärke der wasserlöslichen Bindemittelzusammensetzungen im Element liegt bei mindestens 0,1 und vorzugsweise bei 0,5 bis 5 g/m².
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird in Gegenwart eines Rezeptors für-den zu bestimmenden Liganden durchgeführt. Ist der Ligand beispielsweise ein Antigen, so ist der Rezeptor der entsprechende Antikörper. Die Rezeptoren sind im allgemeinen im Handel erhältlich oder sie können leicht unter Anwendung bekannter Techniken und Ausgangsmaterialien hergestellt-werden. Im allgemeinen werden die entsprechenden Rezeptoren, z. B. polyclonale Antikörper hergestellt durch Inokulierung eines geeigneten Tieres mit dem Liganden, unter Erzeugung von Antikörpern nach einem geeigneten Protokoll und Entfernung der erzeugten Antikörper aus dem Tier. Monoclonaie Antikörper lassen sich erhalten unter Verwendung einer Standard-Hybridoma-Technologie. Der Rezeptor kann dem Element vor oder praktisch gleichzeitig mit der Testprobe zugegeben werden.
  • Alternativ und vorzugsweise wird der Rezeptor innerhalb des Elementes vor der Bestimmung immobilisiert, z. B. während der Herstellung. Beispielsweise kann er innerhalb des absorbierenden Trägermaterials immobilisiert werden. Insbesondere kann er innerhalb der porösen Ausbreitzone-auf einem Trägermaterial immobisisiert werden, z. B. Glas oder Polymerkügelchen oder anderen Partikeln, Harzen oder Fasern. Ein geeignetes Trägermaterial ist ein Mikroorganismus, z. B. Staphylococcus aureus. Alternativ können die Komponenten der porösen Ausbreitzone, z. B. Kügelchen, als Trägermaterial für den Rezeptor dienen.
  • Das Verfahren dieser Erfindung wird in einer solchen Weise durchgeführt, daß entweder das komplexgebundene oder nicht komplexgebundene Liganden-Analog gemessen wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren derart ausgeführt, daß der Komplex bestimmt wird, der zwischen dem Rezeptor und dem markierten Liganden erzeugt wird. Dieser Komplex kann in irgendeiner einer Anzahl von Methoden ermittelt werden. Beispielsweise läßt sich der Komplex ermitteln durch ein konkurriendes radiometrisches Immunoassay-Bestimmungsverfahren. Alternativ und vorzugsweise wird der Komplex unter Verwendung einer reaktiven Zusammensetzung ermittelt, die ein spektrophotometrisches Signal in Gegenwart eines Substrates für Peroxidase liefert. Diese Zusammensetzung umfaßt ein oder mehrere Reagenzien, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid zu reagieren vermögen, das wiederum mit einem Farbstoffvorläufer in Gegenwart von Peroxidase unter Erzeugung eines bestimmbaren Farbstoffes reagiert. Die reaktive Zusammensetzung kann dem Element zu dem Zeitpunkt des Bestimmungsverfahrens zugegeben werden, mit oder separat von der Testprobe. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung bei der Herstellung des Elementes in dieses eingearbeitet. Erfolgt die Einarbeitung in dieser Weise, können sich die einzelnen Komponenten der Zusammensetzung in einer oder mehreren Zonen des Elementes befinden. Alternativ können einige der Reagenzien der reaktiven Zusammensetzung in das Element eingearbeitet werden, während andere zum Zeitpunkt des Bestimmungsverfahrens zugeführt werden. Während des Bestimmungsverfahrens werden sämtliche der Reagenzien miteinander vermischt und reagieren in der gewünschten Weise. Die Mengen an jeder Komponente der reaktiven Zusammensetzung, die zu dem Bestimmungsverfahren verwendet werden, lassen sich leicht vom Fachmann bestimmen.
  • Geeignete Farbstoffvorläufer, die in bestimmbare Farbstoffe in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase überführt werden können, bestehen beispielsweise aus den verschiedensten Leucofarbstoffen, z. B. Imidazolderivaten, wie sie beispielsweise beschrieben werden in der US-PS 4 089 747, der Europäischen Patentanmeldung 122 641 sowie den Japanischen Patentpublikationen 58(1983)-045 557, 58(1983)-068009 sowie 59(1984)-193353 und Triarylmethane, wie sie beispielsweise in der Europäischen Patentpublikation 162 685 beschrieben werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die reaktive Zusammensetzung α-Glycerinphosphatoxidase und einen Triarylimidazol-Leucofarbstoff. Diese Zusammensetzung eignet sich zur Bestimmung Digoxin.
  • Das Element kann eine Anzahl von anderen geeigneten, gegebenenfalls vorliegenden Komponenten in einer oder mehreren Zonen enthalten, wozu beispielsweise gehören oberflächenaktive Mittel, Puffersubstanzen, Härtungsmittel, Antioxidantien, Lösungsmittel sowie andere bekannte Stoffe. Die Menge dieser Stoffe liegt ebenfalls im Bereich des handwerklichen Könnens des Fachmannes.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Element ein Phenol- oder Anilin-Elektronenübertragungsmittel, das die Reaktionsgeschwindigkeit von Peroxidase erhöht. Ein geeignetes Phenol- und Anilin-Elektronenübertragungsmittel ist beispielsweise 4-Hydroxyacetanilid.
  • Die Mengen an mit Peroxidase markiertem Liganden-Analog sowie Rezeptor, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden, lassen sich vom Fachmann leicht bestimmen. Im allgemeinen liegt das Liganden-Analog im Element in einer Menge von mindestens 10&supmin;&sup6; und vorzugsweise von 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;² g/m² vor. Der Rezeptor (gleichgültig ob er in dem Element vorliegt oder während des Bestimmungsverfahrens zugesetzt wird) wird im allgemeinen in einer Menge verwendet, die bei mindestens 10&supmin;&sup7; und vorzugsweise 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;² g/m² liegt. Diese Mengen beziehen sich auf den Rezeptor allein und nicht auf den auf einem Träger immobilisierten Rezeptor. Der Rezeptor liegt im allgemeinen auf einem Träger immobilisiert vor, und zwar in einem Verhältnis von mindestens einem Gew.- Teil Rezeptor auf 106 Gew.-Teile Träger.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein mehrschichtiges analytisches Element einen nicht-porösen Träger, auf dem in der folgenden Reihenfolge aufgetragen sind
  • eine Registrierschicht,
  • eine wasserlösliche Schicht mit einem mit Peroxidase markierten Liganden-Analog für einen immunologisch reaktiven Liganden, der gleichförmig in der wasserlöslichen Bindemittelzusammensetzung, wie oben beschrieben, verteilt ist, und
  • eine poröse Ausbreitschicht,
  • wobei das Element weiterhin umfaßt eine reaktive Zusammensetzung, die dazu befähigt ist, mit dem Liganden-Analog zu reagieren, unter Erzeugung eines spektrophotometrischen Signals in Gegenwart eines Substrates für Peroxidase.
  • Eine Vielzahl von unterschiedlichen Elementen, je nach der Art der Bestimmungsmethode, läßt sich erfindungsgemäß herstellen. Die Elemente können eine Vielzahl verschiedener Formen aufweisen, einschließlich von länglichen Bändern von jeder gewünschten Breite, von Blättern, Slides oder Chips.
  • Das Verfahren dieser Erfindung kann auf manuelle Weise durchgeführt oder automatisiert werden. Im allgemeinen erfolgt eine Ligandenbestimmung dadurch, daß das Element einer Vorratsrolle entnommen wird, einem Chip-Paket oder einem anderen Spender; worauf es in physikalischen Kontakt mit einem Probe der zu testenden Flüssigkeit gebracht wird (z. B. 1 bis 200 ul) so daß das Proben-Liganden-Analog, der Rezeptor und die Reagenzien innerhalb des Elementes miteinander reagieren können. Ein solcher Kontakt kann erreicht werden in irgendeiner beliebigen Weise, z. B. durch Eintauchen des Elementes in die Probe oder vorzugsweise durch Auftröpfeln auf das Element per Hand oder maschinell mittels einer geeigneten Verteilervorrichtung.
  • Nach Aufbringung der Probe wird das Element einer Konditionierung unterworfen, z. B. Inkubierung, einem Erhitzen o. dgl., was wünschenswert sein kann, um die Gewinnung des Testergebnisses zu beschleunigen oder in anderer Weise zu erleichtern. Nachdem-der Rezeptor eine Komplexbindung mit Liganden oder Liganden-Analog eingegangen ist, kann irgendeine geeignete Trenntechnik angewandt werden, um vertikal oder horizontal gebundenen (oder komplexgebundenen) Liganden-Analog von nichtgebundenem (oder nicht komplexgebundenem) Liganden-Analog zu trennen.
  • Gemäß einer Ausführungsform kann ein Kontakt der Probe in der Weise durchgeführt werden, daß eine Komplexbildung des Rezeptors und Liganden sowie praktisch horizontale Trennung von nicht komplexgebundenem und komplexgebundenem Liganden während der Probeneinführung erfolgt. Dieser Kontakt kann per Hand erfolgen oder mittels einer Vorrichtung unter Verwendung einer Pipette oder unter Verwendung von anderen geeigneten Spendervorrichtungen oder Spendermitteln zur Verteilung der Testprobe. Die Flüssigkeitsprobe kann auf das Element in einer Anzahl von Wegen aufgebracht werden, um eine horizontale Trennung zu bewirken. Beispielsweise kann eine vergleichsweise große Flüssigkeitsprobe (z. B. bis zu 100 ul) langsam aufgebracht werden (z. B. innerhalb eines Zeitraumes von mindestens 5 sec) in kontinuierlicher Weise unter Verwendung geeigneter Spendermittel. Alternativ kann die Probe in kleinen Anteilen zugeführt werden, beispielsweise in Form von einer Reihe von zwei oder mehreren Tröpfchen (z. B. 0,1 bis 1 ul) über einen Zeitraum (von z. B. mindestens 5 sec).
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine horizontale oder vertikale Trennung durchgeführt durch langsames Zugeben einer Waschflüssigkeit, nachdem die Flüssigkeitsprobe auf das Element aufgebracht worden ist. Diese Waschflüssigkeit bewirkt, daß nicht komplexgebundene Materialien von den komplexgebundenen Materialien fortbewegt werden.
  • Die Menge an Liganden in der Testprobe wird dann bestimmt, indem das Element durch eine geeignete Vorrichtung geführt wird für die direkte Bestimmung des Rezeptor-Liganden- Analog-Komplexes oder zur Bestimmung einer bestimmbaren Spezies, die gebildet wurde als Ergebnis der Reaktion von Peroxidase und Substrat (beispielsweise Bestimmung der Reflexionsveränderung oder der Veränderung der Transmissionsdichte oder der Fluoreszenz. Alternativ kann das nicht komplexgebundene Liganden-Analog in einer geeigneten Weise bestimmt werden.
  • Im Falle der oben aufgeführten Ausführungsformen, bei denen eine horizontale Trennung erfolgt, wird das komplexgebundene Liganden-Analog in einem begrenzten Bereich im Zentrum der Kontaktfläche gemessen. Die Menge an Liganden in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge-an Liganden- Analog, das in der begrenzten Fläche gemessen wird. Im allgemeinen erfolgt die Messung des Liganden-Analog innerhalb von 5 bis 500 sec, nachdem die Testprobe auf das Element aufgebracht worden ist.
  • Die im folgenden gebrauchte Abkürzung I.E. steht für die Internationale Einheit der Enzymaktivität, wobei eine I.E. definiert ist als die Menge an Enzymaktivität, die erforderlich' ist, um die Umwandlung von einem Micromol Substrat pro Minute unter Standard-pH- und -Temperaturbedingungen für dieses Enzym zu katalysieren.
    • Beispiel 1-3: Vergleichsbeispiel
  • Diese Beispiele veranschaulichen die verbesserte Stabilität von Peroxidase, die beobachtet wird im Falle der Elemente der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit einem Element außerhalb des erfindungsbereiches.
  • Es wurden drei Elemente gemäß der Erfindung hergestellt mit einem Format, wie in Beispiel 4 unten dargestellt, mit der Ausnahme jedoch, daß die Antikörper auf S. aureus in den Beispielen 1 und 2 fortgelassen wurden und die wasserlösliche Schicht der Beispiele 2 und 3 eine Bindemittelzusammensetzung enthielt aus Poly(vinylalkohol) (0,55 g/m²) und Selatine (0,55 g/m²), wobei 50 Gew.-% der Bindemittelzusammensetzung aus Poly(vinylalkohol) bestanden.
  • Vergleichselemente wurden in entsprechender Weise hergestellt, mit der Ausnahme jedoch, daß die Bindemittelzusammensetzung der wasserlöslichen Schicht bestand allein aus ungehärteter Gelatine (Vergleich A) oder Poly(acrylamid-co- N-vinyl-2-pyrrolidon) (Gew.-Verhältnis 50:50) (Vergleich B).
  • Die Stabilität der Peroxidase in dem Liganden-Analog eines jeden Elementes wurde in folgender Weise ermittelt.
  • Eine 10 ul Probe der Flüssigkeit mit 100 mmol α-Glycerinphosphat wurde auf Elemente aufgebracht, die inkubiert worden waren, einige bei 0ºC in einem Gefrierfach und andere bei 22ºC/50%iger relativer Feuchtigkeit.
  • Die Elemente wurden dann 5 min bei 37ºC inkubiert, worauf die Geschwindigkeit der Farbstoffbildung in der am meisten linearen Region eines Diagrammes von Reflexionsdichte in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt wurde (gewöhnlich nach 1 bis 3 min Inkubationsdauer). Die prozentuelle Peroxidaseaktivität, die verblieben war, wurde errechnet durch Division der Farbstoffbildungsgeschwindigkeit, die im Falle des Elementes beobachtet wurde, das bei 22ºC/50% relativer Feuchtigkeit aufbewahrt wurde, durch die Geschwindigkeit, die im Falle des Elementes aus dem Gefrierfach beobachtet wurde.
  • Die Ergebnisse dieser Tests werden in der folgenden Tabelle I veranschaulicht. Aus den erhaltenen Testdaten ist offensichtlich, daß die Elemente der vorliegenden Erfindung eine beträchtlich verbesserte Peroxidasestabilität aufweisen (d. h. eine verbliebene Peroxidaseaktivität). Beispiel l zeigt die größte Verbesserung, da eine hohe Peroxidaseaktivität noch nach bis zu 3 Wochen vorhanden ist. Die Beispiele 2 und 3 zeigen jedoch eine verbesserte Aufbewahrung gegenüber den Vergleichselementen (mindestens 60% verbliebene Aktivität nach 1 Woche Aufbewahrung in einem offenen Behälter). Beide Vergleichselemente zeigten einen beträchtlichen Verlust an Peroxidaseaktivität, und zwar selbst nach 1 Woche Aufbewahrung. Tabelle I Verbliebe. peroxidas-Aktivität Element 1 Woche (offen)* (geschlossen)** Beispiel Vergleich A B
  • *Aufbewahrung bei 22ºC und 50%iger relativer Luftfeuchtigkeit ** Aufbewahrung bei 22ºC und 50%iger relativer Luftfeuchtigkeit in einem geschlossenen Raum.
    • Beispiel 4: Bestimmung von Digoxin
  • Dies Beispiel veranschaulicht die Praxis dieser Erfindung im Falle der Bestimmung von Digoxin. Es wurde ein Element gemäß der Erfindung mit folgendem Aufbau und folgenden Bestandteilen hergestellt:
  • Poly(vinyltoluol-co-p-t- butylstyrol-co-methacrylsäure(kügelchen 131 g/m²
  • Poly(methylacrylat-co-2- acrylamido-2-methylpropansulfonsäure-co-2- acetoacetoxyethylmethacrylat)klebstoff 4 g/m²
  • Ausbreitschicht
  • 2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4,5-bis(4-dimethylaminophenyl)imidazol-Leuco-Farbstoff 0,16 g/m²
  • Staphylococcus aureus
  • beschichtet mit Digoxin-antikörpern 1,6 g/m²
  • oberflächenaktives Mittel SURFACTANT 10G 1,1 g/m²
  • Dimedon-Antioxidationsmittel 0,05 g/m²
  • Poly(vinylalkohol) 0,55 g/m²
  • oberflächenaktives Mittel
  • Wasserlösliche Schicht
  • ZONYL FSN 0,11 g/m²
  • Kaliumphosphatpuffer (pH 7) 0,11 g/m²
  • Digoxin-Peroxidase-Konjugat 3·10&supmin;&sup5; g/m²
  • Gelatine (gehärtet) 11 g/m²
  • oberflächenaktives Mittel
  • Reagenzschicht
  • SURFACTANT 10G 0,22 g/m²
  • Kaliumphosphatpuffer
  • (pH) 0,65 g/m²
  • α-Glycerinphosphatoxidase 2,180 I.E./m²
  • 4-Hydroxyacetanilid 0,16 g/m²
  • Poly(ethylenterephthalat)
  • Träger
  • Digoxin wurde unter Verwendung dieses Elementes in folgender Weise bestimmt. Eine Reihe von Testproben mit verschiedenen Mengen des Liganden, Digoxin, wurde in einer abgepufferten Lösung (pH 7) hergestellt. Von jeder Testprobe wurde eine Testmenge von 10 ul auf das Element aufgebracht, und zwar vor einer Inkubierungsdauer von etwa 5 min bei 37ºC. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine 10 ul-Probe einer Waschflüssigkeit mit 100 mmol α-Glycerinphosphat auf das Element auf den Bereich der Ausbreitschicht gebracht, die mit der Testprobe in Kontakt stand, um nicht komplexgebundenes Liganden-Analog horizontal von dem komplexgebundenen Liganden-Analog wegzuwaschen, und um die enzymatischen Reaktionen zur Erzeugung eines bestimmbaren Farbstoffes einzuleiten. Komplexgebundenes Liganden-Analog wurde dann bestimmt durch Überwachen der Reflexionsdichten bei 670 nm im Zentrum des aufgetröpfelten Bereiches unter Verwendung eines Standard-Reflektometers. Die Geschwindigkeit der Veränderung der Farbstoffdichte wurde errechnet aus Messungen zwischen 60 und 120 sec nach Aufbringung der zweiten Flüssigkeit. Die Clapper-Williams- Umformung (J. Optical Soc. Am., 43, 595, 1953) wurde dazu verwendet, um die Transmissionsdichtenwerte aus den Reflexions-Dichtenwerten zu ermitteln. Es wurde festgestellt, daß die Digoxin-Konzentration in der Testflüssigkeit in umgekehrter Beziehung zur Geschwindigkeit der Farbstoffbildung stand.

Claims (10)

1. Wasserlösliche Zusammensetzung mit einem Peroxidasemarkierten Liganden-Analog, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin eine wasserlösliche Bindemittelzusammen- Setzung enthält, die als alleinigen Stabilisator für den Liganden-Analog mindestens 50 Gew.-% Poly(vinylalkohol) enthält.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der der Poly(vinylalkohol) in der Bindemittelzusammensetzung in einer Menge von mindestens 80 Gew.-% vorliegt.
3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, in der die Bindemittelzusammensetzung mindestens ein zusätzliches Bindemittelmaterial umfaßt, das besteht aus Gelatine, Polyacrylsäure, einem Acrylamid-N-vinyl-2-pyrrolidon- Copolymeren, Polyacrylamid, Poly(N-vinyl-2-pyrrolidon) oder einem Wasser absorbierenden, Stärke enthaltenden Polymeren.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der der Liganden-Analog mit Peroxidase markiertes Digoxin ist.
5. Analytisches Element für die Bestimmung eines immunologisch aktiven Liganden mit einem absorbierenden Trägermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß es die wasserlösliche Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
6. Element nach Anspruch 5, weiter enthaltend eine reaktive Zusammensetzung, die mit dem Liganden-Analog zu reagieren vermag unter Erzeugung eines spektrophotometrischen Signals in Gegenwart eines Substrates für Peroxidase.
7. Element nach Anspruch 6, in der die reaktive Zusammensetzung α-Glycerinphosphatoxidase und einen Triarylimidazol-Leucofarbstoff umfaßt.
8. Element nach einem der Ansprüche 5 bis 7, weiter enthaltend einen immobilisierten Receptor für den immunologisch reaktiven Liganden.
9. Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden mit den Stufen:
A. Kontaktieren einer Probe einer Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält, mit dem analytischen Element nach einem der Ansprüche 5 bis 8 in Gegenwart eines Receptors für den Liganden, wobei das Kontaktieren in solcher Weise durchgeführt wird, daß ein Komplex des Receptors und des Liganden-Analogen erzeugt wird, und
B. Bestimmung der Menge des Liganden als Folge der Gegenwart des Liganden-Analogen, der in Form eines Komplexes vorliegt oder nicht komplex gebunden ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9 zur Bestimmung von Digoxin in einer biologischen Flüssigkeit, bei der das Liganden- Analog mit Peroxidase markiertes Digoxin ist.
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