DD237327B3 - Stabilisierung von peroxidasen und so stabilisiertes medium - Google Patents

Description

von Polyalkoholen in das Medium erreicht werden. Bei diesen Untersuchungen zeigten sich zwei überraschende Effekte. In Gegenwart von Serum entfärbte sich die grüne 2,2'-Azino-dH3-ethyl-benzthiazolinsulfonsäure-(6)) sehrschnell, und es entstand eine praktisch farblose Lösung, die anzeigte, daß die eingesetzte Substanz chemisch umgesetzt war, d. h., das Peroxidasesubstrat 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolinsulfonsäure-(6)) war nicht mehr vorhanden. Die erhaltene bessere Stabilität der Peroxidase wurde also in diesen Fällen nicht durch das zugegebene Peroxidasesubstrat erreicht, sondern von dem oder den Umsetzungsprodukten. In welcher Weise das oder die Umsetzungsprdukte auf die Peroxidase einwirkten, konnte nicht geklärt werden. Der andere Effekt war die Tatsache, daß das Enzym nicht nur für den Reaktionsmechanismus der peroxidatischen Umsetzung von 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolinsulfonsäure-(6)), sondern auch für den der Umsetzung von o-Phenylendiamin und ähnlichen Substanzen stabilisiert wurde, was hiervon besonderem Interesse war. Während die 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolinsulfonsäure-(6)) nach einem Radikalmechanismus umgesetzt wird, bei dem zunächst ein stabiles Radikalion entsteht, ist dies beim o-Phenylendiamin nicht der Fall, es wird vielmehr ein anderer Mechanismus wirksam. Diese gleichzeitige Stabilisierung zweier Mechanismen ist keineswegs von vornherein zu erwarten, da in anderen Fällen nur der Radikalmechanismus in brauchbarer Weise erhalten wird, nicht dagegen der für die o-Phenylendiamin-Oxidation verantwortliche, z. B. bei der Stabilisierung mit verschiedenen Metallionen.

Die Verbesserung der Stabilität ist bei Zusatz von 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazoiinsulfonsäure-(6)) im Verein mit Polyalkoholen, z. B. zu Serum und anschließende Lyophilisation, sehr groß; die Wirkung ist aber auch in flüssigem Zustand vorhanden.

Für die Grundstabilisierung kommen Proteine tierischen, pflanzlichen odermikrobiellen Ursprungs sowie deren Derivate in Frage. Von den löslichen Proteinen eignen sich vor allem Serum und Serumeiweiße vom Mensch und Tier. Das Serum kann nativ oder in bearbeitetem Zustand zugegeben werden. Die teilweise oder vollständige Entfernung der Lipide in an sich bekannter Weise ist eine häufig günstige Vorbehandlung. Zur Zurückdrängung von eventuell möglichen ungünstigen Einflüssen der Serumenzyme, der Transportproteine oder anderer Substanzen erweist es sich als vorteilhaft, diese Aktivitäten durch Erhitzen teilweise oder vollständig zu zerstören. Ein gewisses Problem könnte beim Einsatz im Enzymimmunoassay die Anwesenheit peroxidatisch wirkender Enzyme im Zusatzserum sein. Dieser Einfluß auf die spätere Bestimmung ist aber im allgemeinen sehr gering, da diese Enzyme nicht an der Immunreaktion teilnehmen und bei der Trennung von freiem und gebundenem Tracer fast vollständig entfernt werden. Ein geringer Rest stört nicht, weil er in allen Bestimmungsansätzen in gleicher Menge vorhanden ist und über die sog. unspezifische Bindung, von der er wieder nur einen Bruchteil ausmacht, kontrolliert werden kann. Verwendbar sind Zusätze von Serum oder Serumfraktionen in flüssiger oder fester Form, die einen Eiweißgehalt des Mediums von mehr als 0,01 % ergeben. Sehr gute Effekte werden häufig mit mehr als 2 % erreicht.

Eine weitere Quelle für lösliches Eiweiß ist z. B. tierische Milch, die man zweckmäßigerweise vorher entrahmt. Für den Einsatz von Milcheiweißen gilt im Prinzip das bei Serum gesagte. Unter Proteinderivaten werden hier solche Verbindungen verstanden, die durch Abbau der Proteine über Bruchstücke bis hin zu den Aminosäuren reichen, sowie Aggregate, die aus Proteinen oder ihren Abbauprodukten entstehen.

Der Proteinabbau kann in verschiedenen Arten erfolgen, z. B. schon rein thermisch, wobei teilweise Oxidationsmittel (Wasserstoffperoxid) zugesetzt werden, vor allem aber durch Hydrolyse mit Säuren, Basen oder Enzymen. Solche Abbauprodukte sind in an sich bekannter Weise von allen Eiweißen herzustellen. Für den technischen Gebrauch bieten sich vor allem solche Produkte an, die billig im Handel erhältlich sind, z. B. Gelatine, hydrolysierte Gelatine und Peptone. Gelatine wird aus Gerüsteiweißen von Tieren durch saure Hydrolyse gewonnen, die Peptone durch enzymatischen Abbau, z. B. von Casein, Fleisch, Gluthen oder Sojabohneneiweiß. Die Molmassen solcher Eiweißabbauprodukte sind sehr unterschiedlich, je nach Herstellungsart, und sie sind im allgemeinen auch sehr inhomogen. Die Zahl der Peptidbindungen pro Molekül kann von einigen 1000 bis Null reichen. Bei den Handelsprodukten sind die Molekülgrößen manchmal etwas definierter. Während bei Gelatine die Zahl der Peptidbindungen in der Größenordnung von Tausend liegt, treten bei der sog. hydrolysierten (= partiell hydrolysieren) Gelatine, die für Infusionszwecke verwendet wird, Molmassen von etwa 20000 bis 40000 auf, die kleineren Moleküle werden vorher durch Dialyse entfernt. Bei den verschiedenen handelsüblichen Peptonen treten meist Molmassen von weniger als 5000, z.T. auch weniger als 2000, auf, und es liegen neben Oligopeptiden stets auch freie Aminosäuren vor. Wenn solche Abbauprodukte im allgemeinen auch relativ inhomogen sind, so haben sie doch gegenüber Serum den Vorteil, daß sie nicht die Eigenschaften von Antikörpern, spezifischen Transportproteinen, Hormonen oder Enzymen besitzen und häufig auch keine Lipide enthalten, was für manche Anwendungszwecke von Bedeutung sein kann.

Aggregate von Eiweißen entstehen allmählich bei der Lagerung von Eiweißlösungen, besonders schnell aber beim Erhitzen. Solche Aggregate können aus zwei bis zwanzig oder mehr Molekülen bestehen. Ihre Bindungsform ist nicht genau bekannt, aber relativ fest, so daß man sie teilweise säulenchromatographisch trennen kann.

Die Eigenschaften der Aggregate können sich deutlich von denen der Einzelmoleküle unterscheiden. Proteinaggregate entstehen unter anderem zwangsläufig dann, wenn zur Stabilisierung Serum eingesetzt und ein großer Teil der potentiellen Störsubstanzen durch sog. Inaktivieren (Erhitzen z. B. auf 50 bis 60"C über 60 Minuten) unwirksam gemacht werden soll. Als Endprodukte der Proteinhydrolyse treten Aminosäuren auf, z. B. Glycin, Alanin, Phenylalanin, Tyrosin, Serin, Cystein, Glutaminsäure, Lysin und andere. Neben den natürlich vorkommenden Aminosäuren kann man auch synthetische, nicht in der Natur vorkommende verwenden, und zwar neben α-Aminosäuren auch solche, in denen z. B. die Carboxyl- und die Aminogruppe durch einen Zwischenraum getrennt sind,z.B. ε-Aminocapronsäure, oder in denen zwei Aminogruppen nebeneinander stehen, z. B. Diaminobernsteinsäure. Als Hauptderivate der Aminosäuren kommen hier die Peptide in Frage, die neben dem Abbau der Proteine auch durch Synthese gewonnen werden sowie N-Acylaminosäuren.

Als Polyalkohole werden, hier vor allem einfache und zusammengesetzte Saccharide bis zu Polysacchariden verstanden, z. B. Arabinose, Glukose, Fruktose, Saccharose, Maltose und andere bis zum Dextran, daneben auch Glykoside, Zuckeralkohole, -amine und -säuren, z. B. Methylglukosid, Sorbit, Glukosamin und Glukonsäure sowie Kondensations- und Polymerisationsprodukte von Alkoholen, z. B. Polyethylenglykol und Polyvinylalkohol.

Sehr günstig ist z. B. Rohrzucker, da er billig und in großer Reinheit überall zur Verfügung steht. Eine Wirkung tritt bei einer Konzentration von mehr als 1 % auf, für die Stabilisierung und Lyophilisierung sind 5 bis 15% besonders günstig. Für die Einstellung und Beibehaltung des gewünschten pH-Wertes ist ein Zusatz von Puffer günstig. Die Art der Pufferionen sowie ihre Konzentration hängen z.T. von den anderen Bedingungen ab. Phosphatpuffer und die sog. Good-Puffer in Konzentrationen von 0,005 bis 0,25mol/l haben sich in verschiedenen Fällen als günstig erwiesen. Man kann aber auch Citrat,

Tartrat, Succinat und andere Anionen verwenden. Als Kationen kommen neben Natrium, Kalium und Ammonium auch Trispuffer und Amine in Frage. pH-Werte zwischen 4,0 und 9,0 sind im Prinzip verwendbar, für die meisten Fälle ist aber ein Wert von 6,0 bis 7,5 am günstigsten.

Die Lyophilisation der zu stabilisierenden Enzymlösungen erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man z. B. Portionen von 0,1 bis 1,0 ml in Flaschen abfüllt, diese auf eine Temperatur von unter -3O⁰C abkühlt und das Eis unter vermindertem Druck sublimiert Danach werden die Flaschen mit einem Schutzgas versehen oder im Vakuum luft· und feuchtigkeitsdicht verschlossen. Zur Lagerung in flüssigem Zustand wird die Lösung gegebenenfalls in an sich bekannter Weise mit einem Konservierungsmittel versehen, das z. B. aus der Gruppe der Phenole, der organischen Quecksilberverbindungen oder der p-Hydroxybenzoesäureester stammen kann. Dann wird die Lösung sterilfiltriert und in sterile, dicht verschließbare Gefäße abgefüllt.

Anwendungsbeispiel 1

A. Progesteron-Peroxidase-Konjugat (hergestellt nach der Methode der gemischten Anhydride) wurde in folgender Lösung lyophilisiert: 25% Humanserum (delipidiert, 1 Stunde auf 56⁰C erhitzt), 0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH 6,5. Der Peroxidasegehalt betrug etwa 40ng/ml.

B. Wie Ansatz A, aber mit einem Zusatz von 0,2% 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benrthiazolinsulfonsäure-(6)). Die Lösung entfärbte sich in weniger als 2 Minuten von einer grünen zu der schwach gelbbräunlichen, durch das Serum verursachten Färbung.

C. Wie Ansatz A, aber mit einem Zusatz von 10% Rohrzucker.

D. Wie Ansatz B, aber mit einem Zusatz von 10% Rohrzucker.

Nach 10 Tagen Lagerung bei 45⁰C wurden bei A14%, bei B 36%, bei C 81 % und bei D 91 % der nach der Lyophilisierung erhaltenen Aktivität wiedergefunden.

Anwendungsbeispiel 2

A. Das Peroxidasekonjugat von humanem Plazentalaktogen (hergestellt nach der Perjodatmethode) wurde in folgender Lösung lyophilisiert: 0,5% Rinderserumalbumin, 0,05mol/l Phosphatpuffer, pH 6,5.

B. Wie Ansatz A, aber mit Zusatz von 0,2% 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure-(6)).

C. Wie Ansatz A, aber mit Zusatz von 10% Rohrzucker.

D. Wie Ansatz B, aber mit einem Zusatz von 10% Rohrzucker.

Nach 6 Tagen Lagerung bei 37⁰C wurden bei A 24%, bei B 45%, bei C 50% und bei D 64% der eingesetzten Aktivität wiedergefunden.

Anwendungsbeispiel 3

A. Testosteron-Peroxidase-Konjugat wurde in folgender Lösung flüssig aufbewahrt: 0,1 % Humanserumalbumin, 0,05mol/l Phosphatpuffer, pH 6,2,0,1 % 8-Hydroxychinolin.

B. Wie Ansatt A, aber mit einem Zusatz von 0,4% 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolinsulfonsäure-(6)).

C. Wie Ansatz B, aber mit einem Zusatz von 10% Rohrzucker.

Nach 14 Tagen Lagerung bei 37°C wurden bei A 20%, bei B 69% und bei C 77% der Ausgangsaktivität wiedergefunden.

Claims (2)

1. Verfahren zur Stabilisierung von Peroxidasen in einem Proteine und/oder Aminosäuren oder Derivate dieser Stoffe und Polyalkohole enthaltendem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Medium 2,2'-Azino-di-(3-ethyUbenzthiazoiinsulfonsäure-(6)) zusetzt.

2. Stabilisierte Peroxidase in einem Pfoteine und/oder Aminosäuren oder Derivate dieser Stoffe und Polyalkohole enthaltendem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolinsulfonsäure-(6)) oder Umsetzungsprodukte davon mit Proteinen enthält.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung von Peroxidasen in einem Proteine und/oder Aminosäuren oder Derivate dieser Stoffe und Polyalkohole enthaltendem Medium.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, Peroxidasen zu stabilisieren. Die Notwendigkeit dazu ergibt sich aus der Tatsache, daß Peroxidasen, speziell einige ihrer Isoenzyme aus Meerrettich, als Indikatoren verwendet werden, um verschiedene Reaktionen, z. B. durch die Bildung gefärbter oder fluoreszierender Verbindungen, leicht meßbar zu machen. Besonders für Enzymimmunoassays werden Peroxidasen zu diesem Zweck häufig verwendet und zwar über die Markierung von Antigenen oder Antikörpern. Kommerzielle Testpackungen für diese Methodik enthalten daher solche Peroxidasekonjugate als essentielle Bestandteile. Bekanntlich sind aber Peroxidasen in sehr verdünntem Zustand recht unbeständig, so daß die peroxidasehaltigen Reagenzien häufig die Verwendbarkeitsdauer des gesamten Testsatze« begrenzen. Es werden deshalb Stabilisatoren eingesetzt, die die Lagerfähigkeit der Peroxidase erhöhen. Als Stabilisatoren für Enzyme allgemein sind unterschiedliche chemische und/oder biochemische Spezies allein oder im Gemisch bekannt, so z. B. Zucker, enzymeigene Substrate (Handbuch der Biotechnologie, Hrsg. P. Praeve, Akad. Verlagsges. Wiesbaden, 1982, S.393; GB-PS 2090599; US-PS 4699882, US-PS 4464469; US-PS 4451569), Polyalkohole (Schmid, R. D., Stabilized soluble enzymes, In: Adv. in Biochemical Engineering, Vol. 12, S. 59ff., Springer Verlag, Berlin/ Heidelberg/New York, 1979), Polyethlyenglycol und Sucrose (Wiseman, Α., Stabilisation of enzymes, In: Topics in Enzyme und Fermentation Biotechnology, Vol.2, S.290, Ellis Horwood Ltd.,Chicester, 1978), Rohrzucker, Serumafbumin (DE-OS 3040005), Polyole mit 2 bis 4 Hydroxygruppen und 2 bis 10 C-Atomen (DE-OS 2740957) enthaltend. Diese Stabilisierungsmittel wirken in verschiedenen Medien und auf unterschiedliche Enzyme ganz differenziert ein, so daß von der Wirksamkeit bei einem Enzym nicht auf eine solche bei einem anderen Enzym geschlossen werden kann. Für Peroxidase sind diese Stabilisierungsmittel bisher nicht eingesetzt worden, obwohl ein erhebliches technisches Interesse an einer Langzeitlagerfähigkeit peroxidasehaltiger Enzymzubereitungen besteht.

Die US-PS 4228240 beschreibt die Möglichkeit, peroxidasehaltige Medien durch Zusatz von AI₂(SO₄)* MgSO₄, ZnCI₂, FeSO₄ o. dgl. zu stabilisieren, wobei FeSO₄ die am besten geeignete Verbindung ist, da sie nach Lagerung der enzymhaltigen Präparation über 20 Wochen bei Temperaturen zwischen 4⁰C und 374: noch das Wiederauffinden von 80% der ursprünglichen Peroxidaseaktivität erlaubt. - Diese Stabilisierungsmethode hat den Nachteil, daß der Fe(ll)-Gehalt der Enzympräparation ihre Verwendung in all den Fällen ausschließt, in denen analytische Bestimmungen der eingangs geschilderten Art o-Phenyiendiamin als Chromogen einsetzen. Die Ursache liegt darin begründet, daß Fe⁺⁺ mit o-Phenylendiamin eine eigene Farbreaktion gibt, die die gewünschte, analytisch auszuwertende Reaktion überdeckt und das Analysenergebnis unkompensierbar verfälscht.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Stabilisierung peroxidasehaltiger Enzympräparationen anzugeben und eine solche Präparation zur Verfugung zu stellen, die in Testkits eingesetzt werden kann, die zum Zwecke der Bestimmung von Antikörpern, Antigenen, Haptenen, Eiweißen o. dgl. in biologischen Flüssigkeiten mit dem Chromogen o-Phenylendiamin arbeiten. Dabei soll die Enzympräparation kostengünstig in der Zusammenstellung und insgesamt anwenderfreundlich ausgestaltet sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einer peroxidasehaltigen Enzympräparation solche Stoffe hinzuzufügen, die eine Lyophilisierung der Präparation ermöglichen und Lagerfähigkeit über einen angemessenen Zeitraum gestatten unter Gewährleistung üblicher Bedingungen. Dabei sollen verwendete Zusätze die analytische Bestimmung der eingangs genannten Zielverbindungen mit o-Phenylendiamin nicht beeinträchtigen, d. h. insbesondere schwermetallfrei sein. Überraschenderweise wurde gefunden, daß der Zusatz von 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolinsulfonsäure-(6)) zu Medien, die Peroxidasen neben Proteinen und/oder Aminosäuren bzw. Derivaten dieser Stoffe enthalten, dann eine wesentliche stabilisierende Wirkung entfaltet, sofern das Medium Polyalkohole enthält.

Bei den Vorarbeiten zur Lösung der gestellten Aufgabe wurde zunächst versucht, Enzymsubstrate zu verwenden, indem z. B. o-Phenylendiamin, Benzidin und andere Substanzen getestet wurden, aber die Ergebnisse waren unbefriedigend. Völlig anders war es dagegen, wenn zu Proteine und/oder Aminosäuren oder Derivate dieser Substanzen enthaltenden Lösungen 2,2'-Azinodi-(3-ethyl-benzthiazolinsulfonsäure-(6)) zugegeben wurde. Eine weitere Verbesserung konnte durch das zusätzliche Einbringen