DE69008891T2 - Lagerung von Materialien. - Google Patents

Lagerung von Materialien.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Stabilisierung und Lagerung von Materialien. Das beabsichtigte Hauptanwandungsgebiet stellen die auf dem Gebiet der Biochemie verwendeten Materialien und einige Pharmazeutika dar.
  • Einige wenige biologisch aktive Materialien (z.B. einige Proteine) sind ausreichend stabil, daß sie isoliert, gereinigt und dann in Lösung bei Raumtemperatur gelagert werden können. Bei den meisten Materialien jedoch ist dies nicht moglich, weshalb eine kompliziertere Art von Stabilisierungs/Lagerungsverfahren angewendet werden muß.
  • Es ist ein "Repertoire" an Verfahren bekannt. Nicht alle von ihnen eignen sich für alle Materialien, bei denen sich Lagerprobleme ergeben. Bekannte Lagerungs-/Stabilisierungsverfahren, die für Materialien nach der Isolierung in einer wässerigen Suspension oder Lösung angewendet werden, sind:
  • (i) Hinzufügen einer hohen Konzentration eines chemischen "Stabilisators" zur wässerigen Lösung oder Suspension. Typischerweise wird 3M Ammoniumsulfat verwendet. Solche Zusatzstoffe können jedoch die gemessene Aktivität von Enzymen verändern und zweideutige oder irreführende Ergebnisse liefern, wenn das Enzym in einem Prüfverfahren verwendet wird. R.H.M.Hatley und F.Franks, Variation in apparent enzyme activity in two-enzyme assay systems: Phosphoenolpyruvat carboxylase and malate dehydrogenase, Biotechnol. Appl. Biochem. 11 367-370 (1989)). Bei der Herstellung diagnostischer Sätze auf der Grundlage von Multienzym-Assays müssen solche Zusatzstoffe oft vor der endgültigen Formulierung entfernt werden. Eine solche durch Dialyse durchgeführte Entfernung verringert oft die Aktivität eines Enzyms.
  • (ii) Gefrier/Auftauverfahren, bei denen das Präparat, das üblicherweise mit einem Zusatzstoff vermischt ist (als Kryoprotektant bezeichnet), üblicherweise unter -50ºC, manchmal in flüssigem Stickstoff, gefroren und gelagert wird. Nicht alle Proteine überstehen einen Gefrier/Auftauzyklus.
  • (iii) Kaltlagern mit einem Kryoprotektant-Zusatzstoff, der in einer ausreichenden Konzentration vorhanden ist (z.B. Glyzerin), um den Gefrierpunkt unter die Lagertemperatur abzusenken und um dadurch das Gefrieren zu vermndern. Im Falle von Restriktionsendonukleasen beispielsweise müssen die Enzyme durch Hinzufügen hoher Konzentrationen von Glyzerin vor dem Gefrieren geschützt und bei -20ºC gehalten werden. Die Verwendung eines Zusatzstoffes in hoher Konzentration kann auch die Spezifität von Restriktionsenzymen verringern und die sogenannte "star-activity" bewirken (B.Polisky et al. PNAS USA, 72, 3310 (1975)).
  • (iv) Das gängigste Verfahren für die Stabilisierung von isolierten Proteinpräparaten ist das Gefriertrocknen, doch dieses Verfahren kann nur bei gefrierstabilen Produkten angewendet werden. Das wässerige Isolat des aktiven Materials in einem Puffer mit geeignetem pH und in Gegenwart eines Kryoprotektanten wird zunächst, typischerweise bei -40ºC bis -50ºC, gefroren; danach wird das Eis durch Sublimieren unter Vakuum und bei niedrigen Temperaturen unter 0ºC entfernt, und anschließend wird die Restfeuchtigkeit, die bis zu 50% des "getrockneten" Präparats ausmachen kann, durch Desorption entfernt, wahrend derer die Temperatur allmählich steigt. Der vollständige Gefrier-Trocknungszyklus kann mehrere Tage dauern und ist kosten- und energieaufwendig. Das Gefriertrocknen weist auch technische Nachteile auf, da es nicht wiederholbar ist. Lieferfirmen von gefriergetrockneten Proteinprodukten geben die Lagertemperatur in allgemeinen mit -20ºC und nicht mit der Umgebungstemperatur an. Denn diese Produkte tagebis wochenlang Umgebungstemperaturen ausgesetzt sind, können sich deutliche Aktivitätsverluste ergeben.
  • (v) Das Unterkühlen, das in der europäischen Patentanmeldung 0 136 030 und durch Hatley et al. (Process Biochem. 22 169 (1987)) beschrieben ist, ermöglicht die Langzeit-Stabilisierung (d.h. über Jahre) von Proteinen ohne das Erfordernis der Zusatzstoffe. Dieses Verfahren erweiterte zwar das frühere Repertoire an Möglichkeiten, die unterkühlten Präparate müssen jedoch bei Temperaturen von nicht mehr als +5ºC transportiert und vorzugsweise bei -20ºC gelagert werden. Sie müssen auch vor ihrer Endverwendung aus einer Wasser-in-Öl-Dispersion rückgewonnen werden.
  • Es ist somit offenkundig, daß ein Stabilisierungs-/Lagerungsverfahren, das das Lagern bei Umgebungstemperatur ermöglicht, sehr wünschenswert wäre, da das Erfordernis der Lagerung bei niedrigen Temperaturen, das bei den bestehenden Verfahren erforderlich ist, vermieden werden würde. Bis letzt war das Lagern für viele Materialien bei Umgebungstemperatur unmöglich.
  • Ein weiterer Vorteil bestünde darin, daß das bestehende "Repertoire" an Stabilisierungs- und Lagerungsverfahren bareichert wird, da einige der Lestehenden Verfahren in ihren Anwendungsmöglichkeiten beschränkt sind oder das Akzeptieren von Nachteilen nach sich ziehen, wie z.B. das erforderliche Vermischen mit einem Stabilisator, der nachher schwierig zu entfernen ist.
  • Weiters ist es vorteilhaft, ein kostengünstigeres Verfahren als das derzeitige Gefriertrocknungsverfahren bereitzustellen.
  • EP-A-444 111 (entspricht WO 90/05182, einer Vorveröffentlichung nur aufgrund des Artikels 54(3) EPÜ) offenbart getrocknete Mischungen aus Protein, kationischem Polyelektrolyt und Polyol. In einem Beispiel wurde die getrocknete Mischung als ein glasartige(r) Film bzw. Folie beschrieben, der bzw. die zu einem Pulver vermahlen werden kann.
  • In diesem Beispiel war das Polyol Lactitol und der Polyelektrolyt DEAE-Dextran. Im Einleitungsteil dieser Anmeldung ist angeführt, daß Lactitol, Lactose, Maltose und Saccharose in Verbindung mit DEAE-Dextran besonders vorzuziehen sind. Es wird erwähnt. daß die Polyol-Menge in einem bevorzugten Bereich von 1 bis 20% liegen kann, während die Polyelektrolyt-Menge in einem bevorzugten Bereich von 0,1 bis 10% liegen kann. Diese Prozentbereiche bedeuten ein erhältnis von Polyol zu Polyelektrolyt, das in einem Bereich von 200:1 bis 1:10 liegt.
  • Die Autoren der vorliegenden Anmeldung haben überraschenderweise herausgefunden, daß Materialien, die nicht stabil sind, wenn sie bei Raumtemperatur isoliert und in Lösung gehalten werden, trotzdem erfolgreich in ein Glas, das aus einer wasserlöslichen oder in Wasser quellbaren Substanz besteht, eingearbeitet und später rückgewonnen werden können, während das Material im Glas immobilisiert und stabil ist.
  • In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine lagerbare Zusammensetzung bereit, die zumindest ein zu lagerndes Material umfaßt, das vorzugsweise aus der aus Proteinen, Peptiden, Nukleosiden, Nukleotiden und Enzym-Cofaktoren bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und das in einer wasserlöslichen oder in nasser quellbaren Substanz aufgelöst ist, die in einem amorphen glasertigen Zustand vorliegt, wobei die Zusammensetzung eine Glasübergangstemperatur von zumindest 20º, vorzugsweise von zumindest 30º, aufweist.
  • Es kann wünschenswert sein, daß die Zusammensetzung einen Wassergehalt von nicht mehr als 4 Gew.-% aufweist.
  • Die Erfindung kann zum statilen Lagern eines einzelnen Materials oder einer Mischung von Materialien verwendet werden, die eine geringe oder keine Wirkung aufeinander ausüben.
  • In einer Entwicklung der Erfindung enthält jedoch eine einzelne Zusammensetzung eine Vielzahl an Materialien, die einen Teil oder die Gesamtheit eines Reaktionssystems bilden. Diese können recht einfache Chemikalien sein.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegence Erfindung ein Verfahren zum Lagerstabilmachen eines Materials bei 20ºC bereit, welches Material bei einer Raumtemperatur von 20ºC in wässeriger Lösung instabil ist, umfassend das Auflösen des Materials in einer wasserlöslichen oder in Wasser quellbaren Substanz oder Lösung davon und das Bilden der resultierenden Mischung zu einem glasartigen amorphen Zustand, wobei genannte Mischung dann bei 20ºC in genanntem glasartigen Zustand vorliegt.
  • Das vorliegende Verfahren kann ohne Verwendung irgendeines nichtwässerigen, organischen Lösungsmittels durchgeführt werden, was vorteilhaft ist, da sich herausstellen konnte, daß ein solches Lösungsmittel für viele Substanzen nachteilig bzw. schädlich ist. Überdies kann das Verarbeiten mit und/oder Entfernen von organischen Lösungsmitteln aus Umweltgründen unerwünscht sein.
  • Ein weiteres Merkmal besteht darin, daß das verfahren energieeffizient ist und viel weniger Energie erfordert als das Gefriertrocknen. Ein Großteil des rocknens kann bei weniger als 40ºC erfolgen.
    • Gelagertes Material
  • Das/Die zum lagern stabilisierte(n) Material(ien) kann/können möglicherweise jedes beliebige Material aus einer großen Vielfalt an Materialien sein, die üblicherweise dazu neigen, einer chemischen Reaktion unterzogen zu werden, die von der Diffusion der reagierenden Spezies abhängig ist.
  • Eine Kategorie von Materialien, auf die die Erfindung anwendbar ist, sind Proteine und Peptide, einschließlich deren Derivate, wie z.B. Glykoproteine. Solche Proteine und Peptida können beliebige der folgenden sein: Enzyme, Transportproteine, z.B. Hämoglobin, Immunoglobuline, Hormone, Blutgerinnungsfaktoren und pharmakologisch aktive Proteine oder Peptide.
  • Eine weitere Kategorie von Materialien, auf die die Erfindung anwendbar ist, umfaßt Nukleoside, Nukleotide, Dinukleotide, Oligonukleotide (enthalten z.B. bis zu vier Nukleotide) und auch Enzym-Cofaktoren, ob diese Nukleotide sind oder nicht. Enzymsubstrate sind im allgemeinen Materialien, auf die die Erfindung anwendbar ist.
  • Das Material für die Stabilisierung und Lagerung kann aus einer natürlichen Quelle, einem Tier, einer Pflanze, einem Pilz oder einem Bakterium isoliert werden oder kann durch Zellen hergestellt und aus ihnen isoliert werden, die durch Fermentation in einer künstlichen Kultur gezüchtet wurden. Solche Zellen können genetisch transformierte Zellen sein oder nicht.
  • Das Material muß in einer wässerigen Lösung zumindest soweit löslich sein, daß sich eine verdünnte Lösung bildet, die zur Einarbeitung in die glasbildende Substanz verwendet werden kann.
  • Wie bereits erwähnt besteht eine Entwicklung der Erfindung darin, mehr als eine Komponente eines Reaktionssytems in einem Glas zu lagern. Dies kann für Materialien nutzlich sein, die z.B. in einem Assay oder einem diagnostischen Satz gemeinsam verwendet werden müssen.
  • Das Lagern der Materialien in einem einzigen glasartigen Präparat stellt sie in einer für die Endverwendung zweckmäßigen Form bereit. Wenn ein Assay beispielsweise eine Kombination eines Substrats oder eines Cofaktors und eines Enzyms erfordert, könnten zwei oder alle drei im notwendigen Konzentrationsverhältnis in einem Glas gelagert werden und zur Verwendung im Assay bereit sein.
  • Werden mehrere Materialien gelagert, können sie in wässeriger Lösung miteinander vermischt und dann gemeinsam in ein Glas eingearbeitet werden. Alternativ dazu können sie einzeln in gesonderte Gläser eingearbeitet werden, die dann miteinander vermischt werden.
  • Wenn mehrere materialien als Einzelzusammensetzung gelagert werden (dies können zwei miteinander vermischte Gläser sein), können ein oder mehrere der Materialien ein Protein, Peptid, Nukleosid, Nukleotid oder Enzym-Cofaktor sein. Es ist auch möglich, daß die Materialien einfachere Spezien sind. Eine Standard-Assayverfahrensweise kann zum Beispiel erfordern, daß Pyruvat und NADH gemeinsam vorhanden sind. Beide können alleine mit annehmbarer Stabilität gelagert werden. Wenn sie jedoch in einer wässerigen Lösung zusammengebracht werden, beginnen sie miteinander zu reagieren. Wenn sie in erforderlichen Verhältnissen im glasartigen Zustand zusammengebracht werden, reagieren sie nicht, und das Glas kann gelagert werden.
    • Die Glasbildungssubstanz
  • Ein Glas ist als unterkühlte Flüssigkeit mit einer sehr hohen Viskosität, d.h. zumindest 10¹³ Pa.s., wahrscheinlich 10¹&sup4; Pa.s.oder mehr, definiert.
  • Normalerweise ist die äußere Erscheinung des Glases die eines homogenen, transparenten, spröden Festkörpers, der zu einem Pulver geschliffen oder gemahlen werden kann. Im Glas finden Diffusionsprozesse mit äußerst niedrigen Raten statt, wie z.B. Mikronen pro Jahr. Chemishe oder biochemische Veranderungen, die mehr als eine Reaktionsgruppe betreffen, sind praktisch unterbunden.
  • Oberhalb einer Temperatur, die als Glasübergangstemperatur Tg bekannt ist, fällt die Viskosität rasch ab, und das Glas wird zu einem Gummi, dann zu einem plastischen Stoff, der bei noch höheren Temperaturen zu einem Fluid wird.
  • Die in der vorliegenden Erfindung eingesezte Glasbildungssubstanz muß hydrophil sein - entweder wasserlöslich oder in Wasser quellbar -, sodaß Wasser als Plastifiziermittel dient. Viele hydrophile Materialien, sowohl Materialien einer monomeren wie auch einer polymeren Beschaffenheit - liegen entweder in amorphen Zuständen vor oder können in amorphe Zustände umgewandelt werden, die die Glas/Gummiübergangseigenschaften von amorphen Makromolekülen aufweisen. Sie weisen gut definierte Glasübergangstemperaturen Tg auf, die vom Molekulargewicht und einer Molekularkomplexität der Glasbildungssubstanz abhängen. Tg wird durch das Hinzufügen von Verdünnungsmitteln gesenkt. Wasser ist für alle derartigen hydrophilen Materialien das Universal-Plastifiziermittel. Daher ist die Glas/Gummiübergangstemperatur durch das Hinzufügen von Wasser oder einer wässerigen Lösung einstellbar.
  • Für die vorliegende Erfindung ist im allgemeinen erforderlich, daß die Glasbildungssubstanz - wenn sie wasserfei oder fast wasserfrei ist - eine Glasübergangstemperatur Tg in einem Bereich von 20 bis 150ºC, vorzugsweise 25 bis 70ºC, aufweist. Wenn die Tg eher am oberen Ende des Bereichs liegt, kann eine niedrigere Tg durch Hinzufügen von Wasser erreicht werden, das nach dem Einbau des einzulagernden Materials in das Glas entfernt werden kann. Mischungen von Glasbildungssubstanzen können verwendet werden, wenn die Komponanten als feste Lösung vermischbar sind. Wenn dies der Fall ist, dient/dienen (ein) Material/Materialien mit niedrigerer Tg als Plastifiziermittel für (ein) Material/Materialien mit höherer Tg.
  • Wenn die Tg der Endzusammensetzung ausreichend hoch ist, kann das Lagern bei Raumtemnenatur erfolgen. Wenn Jedoch die Tg der Zusammensetzung annähernd Raumtemperatur ist oder unter diese liegt, kann es notwendig oder wünschenswert sein, die glasartige Zusammensetzung abzukühlen, wenn das Lagern über einen längeren Zeitraum erfolgt. Dies ist weniger praktisch, aber immer noch wirtschaftlicher als das Gefriertrocknen.
  • Wenn die Zusammensetzung während des Lagerns über ihre Tg erwärmt wird, wandelt sie sich in ihren gummiartigen Zustand um. Gelagerte Materialien sind sogar in diesem Zustand über einen beträchtlichen Zeitraum stabil. Folglich schadet es möglicherweise nicht, wenn man die Temperatur des gelagerten Materials über einen begrenzten Zeitraum, z.B. während des Transports, über die Tg steigen läßt.
  • Wenn eine Zusammensetzung oberhalb ihrer Tg (und somit in einem gummiartigen Zustand) gehalten wird, ist die Lagerbarkeit begrenzt, doch nach wie vor beträchtlich, und der erfindungsgemäße Vorteil wird nur in einem beschränkten Ausmaß erreicht.
  • Wenn hingegen die Tg der Zusammensetzung deutlich über der Raumtemperatur liegt, kann die Zusammensetzung der Lagerung bei einer erhöhten Temperatur, z.B. in einem heißen Klima, besser standhalten.
  • Wie bereits erwähnt liegt die Tg der formulierten Zusammensetzung typischerweise 5º unterhalb der wasserfreien Glasbildungssubstanz.
  • Die glasbildende Substanz sollte gegenüber dam darin einzuarbeitenden Material ausreichend chemisch inert sein. Ein absolutes Fehlen chemischer Reaktivität ist möglicherweise nicht entscheidend, solange es möglich ist, das Material einzuarbeiten, das Glas zu lagern und das Material ohne bedeutende Verschlechterung durch chemische Reaktion rückzugewinnen.
  • Viele organische Substanzen und Miscnungen voh Substanzen bilden beim Abkühlen von einer Schmelze einen glasartigen Zustand.
  • Konlehydrate sind eine bedeutende Gruppe von glasbildenden Substanzen: Kandis ist somit eine glasartige Form von Zucker (Glukose oder Saccharose). Die Tg für Glukose, Maltose und Maltotriose sind 31, 43 bzw. 76ºC. (L.Slade und H.Levine, Non-equilibrium behaviour of small carbohydrate-water systems, Pure Appl. Chem. 60 1841 (1988)). Wasser senkt die Tg, und für diese Kohlenydrate ist die Senkung der Tg durch kleine Feuchtigkeitsmengen etwa 6ºC für jedes Prozent hinzugefügter Feuchtigkeit. Der Tg-Wert für Saccharose werde von den Autoren der vorliegenden Anmeldung mit 55ºC ermittelt.
  • Zusätzlich zu einfachen Kohlehydraten können andere Polyhydroxy-Verbindungen verwendet werden, wie z.B. Kohlehydratderivate wie Sorbit und chemisch modifizierte Kohlehydrate.
  • Eine weitere wichtige Klasse von glasbildenden Substanzen sind wasserlösliche oder in Wasser quellbare synthetische Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid oder Polyäthylenimin. Hier ist die Tg eine Funktion des Molekulargewichts. Beide dieser Klassen von glasbildenden Substanzen eignen sich für die vorliegende Erfindung.
  • Eine Gruppe von besonders geeigneten glasbildenden Substanzen sind Zuckercopolymere, die in der US PS 3 300 474 beschrieben sind und durch Pharmacia unter der Handelsmarke "Ficoll" verkauft werden. Diese US PS führt an, daß diese Materialien ein Molekulargewicht von 5.000 bis 1.000.000 aufweisen und Saccharosereste enthalten, die über Ätherbrücken an bifunktionelle Gruppen gebunden sind. Solche Gruppen können Alkylen mit 2, 3 oder mehr C-Atomen, normalerweise aber nicht mehr als 10 C-Atomen sein. Die bifunktionellen Gruppen dienen dazu, die Zuckerreste miteinander zu verbinden. Diese Polymeren können z.B. durch Reaktion des Zuckers mit einem Halohydrin oder einer Bis-epoxy-Verbindung hergestellt werden.
  • Ein Verfahren zum Lagerstabilmachen eines Materials gemäß der vorliegenden Erfindung beginnt mit einer wässerigen Lösung des Materials (das als das aktive Material bezeichnet wird) und Zufuhr der Substanz, in die eingearbeitet werden soll, wobei sich diese Substanz bereits in einem glasartigen amorphen Zustand befindet.
  • Danach wird eine kontrollierte Menge einer wässerigen, das aktive Material enthaltenden Lösung in die glasartige Substanz eingearbeitet, wodurch sie zu Gummi wird: die Materialien werden vermischt, um die glasbildende Substanz mit dem aktiven Material zu homogenisieren. Die gummiartige Form hat die Konsistenz von Teig und kann zu einer dünnen Schicht ausgewalzt werden. Dieser Gummi wird dann verringertem Druck und möglicherweise begleitet von mäßiger Wärme unterworfen, um einen Großteil der hinzugefügten Feuchtigkeit zu entfernen. Das Endprodukt ist ein Glas, dessen Glastemperatur etwas (z.B. etwa 5ºC) unter jener der reinen glasbildenden Substanz liegt. Es kann in der Form eines durchsichtigen Films vorliegen, zu einem feinen Pulver vermahlen oder in Tablettenform gepreßt werden. Im glasartigen Zustand (unter der Tg) wird die durch welchen Mechanismus auch immer bewirkte Verschlechterung des aktiven Materials soweit verlangsamt, daß in praktischen Zeitmaßstäben selbst Substanzen, die in ihren freien Zuständen äußerst labil sind, eine lange Lagerbeständigkeit aufweisen.
  • Es wird die volle biochemische Aktivität aufrechterhalten, sie ist jedoch über den gesamten Zeitraum bei Temperaturen unterhalb der Tg eingeschlossen und kann durch neuerliche Solubilisierung des Glases in einem wässerigen Medium rasch freigesetzt werden.
  • Die glasbildende Substanz und die ihr hinzugefügte Menge an Lösung sind so ausgewählt, daß das durch das Hinzufügen erhaltene gummiartige Material bei einer Temperatur oberhalb seiner Tg vorliegt (oder anders ausgedrückt seine Tg unterhalb der Umgebungstemperatur liegt), daß aber beim Entfernen der Feuchtigkeit der Wert von Tg auf einen Wert oberhalb der Umgebungstemperatur ansteigt.
  • Vorzugsweise hat die Ausgangssubstanz ebenfalls eine Tg oberhalb der Umgebungstemperatur, sodaß eine Abnahme der Tg beim Hinzufügen einer wässerigen Lösung diesen Wert von obernalb auf unterhalb der Umgetungstemperatur senkt.Es ist jedoch vorstellbar, mit einer feuchtigkeitshältigen Substanz zu beginnen, deren Tg bereits unterhalb der Umgebungstemperatur liegt, diese durch Hinzufügen einer wässerigen Lösung des einzuarbeitenden Materials weiter zu senken und die Tg schließlich durch Trocknen auf einen Wert oberhalb der Umgebungstemperatur zu erhöhen.
  • Die Menge an wässeriger Lösung, die zur Bildung eines gummiartigen Teigs hinzugefügt werden kann und soil, kann durchaus durch empirisch-praktische Methode ermittelt werden. Wahrscheinlich beträgt sie nicht mehr als 5 Gew.-% bezogen auf die glasbildende Substanz. Die Schritte des Hinzufügens der Lösung zur Bildung eines gummiartigen Teigs und seines Trocknens zurück zu einein glasartigen Zustand können wiederholt werden, um die Konzentration des aktiven Materials im Glas zu steigern.
  • Falls erwünscht kann der Tg-Wert einer Probe einer glasbildenden Substanz ermittelt werden und nach dem Mischen in variierenden Wassermengen neuerlich ermittelt werden, um einen Tg-Graphen in Abhängigkeit vom Feuchtigkeitsgehalt aufzeichnen zu können.
  • Tg-Werte können mit einem Differentialscanning-kalorimeter ermittelt und als ein Duhkt nachgewiesen werden, bei dem eine Kurve der Wärmezufuhr in Abhängigkeit der Temperatur durch einen Wendepunkt führt - wodurch sich ein Höchstwert der ersten Temperaturableitung ergibt.
  • Vakuum, das die Entfernung von Wasser aus der gummiartigen Zusammensetzung unterstützt, muß nicht besonders stark sein. Geeigneterweise beträgt es weniger als 90% des normalen atmosphärischen Drucks. Ein Druck, der 80% des normalen atmosphärischen Drucks beträgt, stellte sich als angemessen heraus. Ein stärkeres Vakuum kann jedoch verwendet werden, falls sich dies als zweckmäßig erweist.
  • Das Erwärmen der teigförmigen Mischung zur Entfernung der Feuchtigkeit kann bei einer Temperatur von nicht mehr als 80ºC erfolgen und liegt für ein Protein vorzugsweise bei nicht mehr als 60ºC. Möglicherweise ist das Erwärmen gar nicht erforderlich: das Verdampfen der Feuchtigkeit unter verringertem Druck kann selbst bei eine Raumtemperatur von etwa 20ºC zu einem ausreichend niedrigen Feuchtickeitsgehalt führen, aber selbstverständlich beschleunigt Wärme die Verdampfung.
  • Ein weiteres Verfahren zum Lagerstabilmachen des Materials gemäß der vorliegenden Erfindung kann bewirken, daß das Material in einer größeren Konzentration des aktiven Materials in bezug auf die Trägersubstanz gelagert und ruckgewonnen werden Kahn. Bei diesem Verfahren wird eine Menge der Trägersubstanz oder eine Lösung davon zu einer Lösung des aktiven Materias hinzugefügt. Nach vollständiger Auflösung der hinzugefügten Trägersubstanz kann die Lösung in geeignete Teilmengen, z.B. 0,1 bis 1 ml, aufgeteilt werden. Die Lösungsproben werden verringertem Druck ausgesetzt, sodaß Wasser aus ihnen verdampft, bis sich die Trägersubstanz in einem glasartigen Zustand befindet. Typische Bedingungen sehen einen Beginn der Verdampfung bei einer Temperatur von nicht mehr als 40ºC, vorzugsweise im Bereich von 20 bis 30ºC, und ein Fortsetzen des Verdampfens für einige Stunden, z.B. 24 bis 36 Stunden, vor. Mit Fortgang der Verdampfung steigt die Glastemperatur des Restmaterials. Die Verdampfung über den angegebenen Zeitraum kann ausreichen, um eine Glasübergangstemperatur von mehr als 30ºC zu erreichen. Sobald man eine solche ausreichend hohe Glasübergangstemperatur erreicht hat, kann die Temperatur bei anhaltender Verdampfuhg erhöht werden. Sobald z.B. die Glasübergangstemperatur einen Wert von 30ºC erreicht hat, kann die Temperatur im Bereich von 40 bis 70ºC, z.B. 60ºC, über einen kürzeren Zeitraum, wie beispielsweise zwei Stunden, erhöht werden. Auch für diese Verfahrensweise muß das Vakuum zum Bewirken der Wasserverdampfung nicht besonders stark sein, obwohl der verringerte Druck z.B. möglicherweise nicht mehr als 90% des atmosphärischen, beispielsweise etwa 80%, beträgt. Es kann sich auch herausstellen, daß das Erwärmen nicht erforderlicn ist: Verdampfung ohne Erwärmung über einen längeren Zeitraum kann einen ausreichend niedrigen Feuchtigkeitsgehalt bewirken.
  • Beim obigen Verfahren kann die Trägersubstanz in einem trockenen Zustand, z.B. als Pulver, oder als Lösung hinzugefügt werden.
  • Die Rückgewinnung (d.h. Reaktivierung) des gelagerten Materials kann einfach durch Hinzufügen von Wasser oder einer wässerigen Lösung zu einer Glasmenge mit dem darin befindlichen aktiven Material erfolgen.
  • Wenn die Trägersubstanz wasserlöslich ist, ist das Ergebnis eine Lösung des Materials und der Trägersubstanz.
  • Eine Trennung durch Chromatographie zur Isolierung des gelagerten aktiven Materials von der glasbildenden Substanz ist möglich. Im allgemeinen jedoch ist oies weder wu nscrenswert noch notwendig. Stattdessen ist die glasbildende Substanz so ausgewählt, daß sie die Verwendung (z.B. den Assay) nes gelagerten aktiven Materials nicht beeinträchtigt.
  • Im Falle einer in Wasser quellbaren glasbildenden Substanz geht sie nicht in Lösung, sondern verbleibt möglicherweise als ein Gel, und die Lösung des Materials kann - falls dies erforderlich ist - durch Zentrifugieren abgetrennt werden.
  • Die Eignung einer beabsichtigten glasbildenden Substanz und Bedingungen zur Einarbeitung des Materials darin können beide durch Herstellen eines Glases mit dem eingearbeiteten Material und durch anschließendes Rückgewinnen des Materials ohne jegliche längere Lagerperiode kontrolliert werden.
  • Die Lagerstabilität kann im Bedarfsfall durch das Lagern bei einer höheren Temperatur, wie z.B. 35ºC oder sogar 50ºC, geprüft werden, was zu einer beschleunigten Prüfung führt.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zum Bereitstellen einer Lösung des gelagerten Materials durch Hinzufügen von Wasser oder einer wässerigen Lösung zur Zusammensetzung. Die Anwendung der Lösung des rückgewonnenen Materials kann ein therapeutischer Verwendungszweck sein oder nicht.
    • BEISPIELE
  • In den folgenden Beispielen veranschaulichen Beispiele 1 bis 4 das erste oben angeführte Verfahren, bei dem aine das aktive Material enthaltende Lösung in die glasartige Trägersuostanz eingearbeitet wird, wodurch es vorübergehend in einen gummiartigen Zustand umgewandelt wird. Ab Beispiel 5 wird das zweite oben beschriebene Verfahren veranschaulicht, bei dem die Trägersubstanz zu einer Lösung des aktiven Materials hinzugefügt wird und die resultierende Lösung danach in einen glasartigen Zustand verdampft wird.
  • In einigen Beispielen wird Material bei einer Temperatur über der Umgebungstemperatur gelagert, um eine beschleunigte Prüfung der Lagerbeständigkeit zu ergeben.
  • Beispiele 1 und 2 beschreiben das Lagern von Lactatdehydrogenase (LDH), die unter Verwendung einer Kombination von NADH und Pyruvat geprüft wird. Beispiel 4 zeigt die Lagerung der instabilen Mischung von NADH mit Pyruvat. Dies würde ein geeignetes Material zur Verwendung beim Durchführen von DH-Assays ergeben, doch in Beispiel 4 wird dieses Prüfverfahren benutzt, um die Aktivität von NADH/Pyruvat nach dem Lagern zu bestätigen.
  • Beispiel 3 beschreibt die Lagerung eines Restriktionsenzyms, und die Aktivität des gelagerten Enzyms wird bestätigt, indem gezeigt wird, daß ihre/seine Wirkung auf die DNA unverändert bleibt.
    • Beispiel 1
  • Die verwendete glasbildende Substanz war Ficoll 400 DL (Pharmacia, eingetragene Handelsmarke), ein Copolymer von Saccharose und Epichlorhydrin. Es ist wasserlöslich und weist eine Tg von 97ºC auf. 4 Gramm Ficoll wurden in eine trockene Universalröhre gewogen (ws). Etwa 50% wurden in einen trockenen Mörser gegeben, und es wurden 0,2 ml einer 1000 Einheiten/ml Lactatdehydrogenase LDH (aus einem Kaninchenmuskel) enthaltenden Lösung in 0,01M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 hinzugefügt und mit dem Ficoll gut vermischt. Weitere 0,2 ml der LDH-Lösung wurden dann in die Mischung eingearbeitet. Es wurde eine kleine Ficoll-Menge hinzugefügt, bis ein Teig erhalten wurde, der am Pistill nicht klebte. Der Teig wurde auf einer Platte ausgewalzt, um eine Schicht von etwa 1 mm Dicke zu ergeben. Diese wurde mittels eines Messers von der Platte getrennt und vorsichtig wieder auf die Platte gelegt, die anschließend 30 Minuten lang bei 45-50ºC in einem Ofen erhitzt wurde. Die dünne Platte wurde als dem Ofen herausgenommen und zu einem feinen, freifließenden Pulver gemahlen, das in einer abgedichteten Pöhre/Reagenzröhrchen gelagert wurde. Das nicht verwendete Ficol wurde gewogen (we). Das LDH enthalterde Pulver wurde im Labor gelagert, wo Temperaturen zwiscnen 20 und 35ºC schwankten.
  • Die LDH-Aktivitat des Pulvers sollte unter Annahme keines Verlustes der LDH-Aktivität durch die Beziehung:
  • LDH-Aktivität (Einheiten/Gramm) etwa
  • ausgedrückt werden, worin I die anfängliche LDH-Konzentration in der Lösung in Einheiten/ml ist.
  • Es wurde die tatsächliche LDH-Aktivität des Pulvers geprüft. Unter der Annahme, daß das Pulver einen vernachlässigbaren Feuchtigkeitsgehalt aufwies, wurde das Pulver in einem Phosphatpuffer (0,01M, pH-Wert 7) aufgelöst, um eine Prüflösung zu ergeben, die als eine 1 bis 1000fache Verdünnung der ursprünglichen Lösung errechret wurde. Diese würde 1 Einheit LDH pro ml enthalten, wenn die Enzymaktivität vollständig bewahrt würde. Ihre tatsächliche Aktivität wurde durch das folgende Verfahren ermittelt (Hatley, Franks und Mathias, Process Biochemistry, Dezember 1987, S.170).
  • 2,7 ml 0,01M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0, 0,1 ml 2 mg ml&supmin;¹ NADH und 0,1 ml 10mM Pyruvat wurden in eine Küvette mit einer Weglänge von 10 mm gefüllt. Die Küvette wurde mit einer Kapsel verschlossen und geschüttelt. 0,1 ml der Prüflösung wurde hinzugefügt und die Küvette wieder mit einer Kapsel verschlossen und geschüttelt. Die dekad.Extinktion bei 340 nm wurde in 30-Sekundenintervallen über einen Gesamtzeitraum von drei Minuten aufgezeichnet. Die Temperatur der Lösung wurde auch festgehalten. Ein Zeitraum, während dessen die Änderung der dekad.Extinktion linear zur Zeit war, wurde ausgewählt und die Änderung der dekad. Extinktion pro Minute,ΔA, errechnet. Die Enzymaktivität wurde wie folgt errechnet:
  • LDH-Aktivität (Einheiten nro Milligramm)
  • worin:
  • Δ A = die Änderung der dekad.Extinktion pro Minute bei 340 nm
  • 6,25 = ein Korrekturfaktor für die molare dekad.Extinktion von NADH.
  • TCF = ein Temperaturkorrekturfaktor, der für Assays anzuwenden ist, die bei anderen Temperaturen als 25ºC erfolgen.
  • C = Konzentration des Proteins (mg ml&supmin;¹).
  • Nach dem Lagern über einen Zeitraum von 5 Monaten konnte man keinen Verlust an LDH-Aktivität feststellen.
  • Die Stabilität des Produkts wurde mit jener eines handelsüblichen LDH-Präparats in 2,1M Ammoniumsulfat verglichen (Typ II, 10.000 Einheiten/ml aus Sigma), das bei 25ºC gelagert wurde und mittels des obigen Verfahrens periodisch geprüft wurde. Die Aktivität dieses handelsüblichen Präparats nahm durchschnittlich um 1,2 % pro Tag während der ersten 45 Tage ab.
    • Beispiel 2
  • Eine Menge kristalliner Saccharose wurde auf einer Wärmeplatte unter einer trockenen, sauerstofffreien Atmosphäre schonend bis zum Schmelzen erhitzt. (Es wurde trockener Stickstoff verwendet). Man ließ die Saccharose abkühlen, um ein durchsichtigen Glas zu ergeben, und anschließend wurde sie bei anhaltend trockener Atmosphäre zu einem feinen Pulver gemahlen und in einem zugestöpselten Röhrchen gelagert. 0,4 ml einer 4000 Einheiten/ml enthaltenden LDH-Lösung in 0,01M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 wurden zu 4 g des Saccharoseglases hinzugefügt und unter Verwendung eines Pistills und Mörsers vermischt. Die resultierende Paste wurde auf einer Platte zu einer dünnen Schicht ausgewaizt, die dann von der Platte gelöst und vorsichtig wieder auf diese gelegt wurde. Danach wurde sie 30 Minuten lang bei 40-50ºC in einem Ofen erwärmt, bevor man sie abkühlen ließ. Anschließend wuroe sie zu einem feinen, freifließenden Pulver gemahlen, wobei alle Schritte unter dem Ausschluß vor Feuchtigkeit erfolgten. Das Dulver wurde in einem luftdichten, zugestöpselten Röhrchen bei 25ºC gelagert. Die LDH-Aktivität des Pulvers sollte unter Annahme keines Aktivitätsverlusts durch:
  • LDH-Aktivität (Einheiten/g festes Produkt) etwa 0,1 I
  • gegeben sein, worin I die anfängliche LDH-Aktivität (Einheiten/ml) in der zur Herstellung des Glases verwendeten Lösung ist.
  • Das Präparat wurde periodisch, wie in Beispiel 1 beschrieben, hinsichtlich seiner LDH-Aktlvität untersucht. Nach einer einmonatigen Lagerung bei 25ºC konnte man keinen Aktivitätsverlust feststellen.
  • Die durch Differentialscanning-kalorimetrie ermittelte Glastemperatur des Präparats betrug 32ºC.
    • Beispiel 3
  • Zu 1 g Ficoll wurden 100 ul einer Lösung von EcoR I Restriktionsendonuklease in 50% wässerigem Glyzerin hinzugefügt und ein Glas wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Das fertige Präparat wurde 10 Tage lang im Labor gelagert, wo die Temperaturen zwischen 20 und 30ºC schwankten.
  • Eine 2 Enzymeinheiten entsprechende Menge das Präparats wurde unter der Annahme, daß das Enzym nach wie vor voll aktiv ist, in folgendem Puffer aufgelöst: 100 mM Tris-HCl pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin. Es wurde ein Assay zur Ermittlung der Enzymaktivität mittels der nachstehend angeführten Verfahrensweise (stammt aus dem LKB Laboratory Manual; LKB 2013 Miniphor Submarine Electrophoresis mit 1985, Kapitel 6) durchgeführt. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 37ºC mit 1 ug Lamda-DNA inkubiert. Anschließend erfolgte eine Elektrophorese der Inkubationsmischung auf 0,5% Agarosegel in einem Tris/Boratpuffer in herkömmlicher Weise. Die auf dem Gel beobachteten DNA-Breakdown-Bänder stimmten genau mit jenen eines Kontrollversuchs mit einer frischen Enzynilösung überein.
    • Beispiel 4
  • Eine 100 mg/ml ADH und 33 mg/ml Pyruvat enthaltende Lösung wurde hergestellt. 0,4 ml dieser Lösung wurden in 4 g eines Saccharoseglases eingearbeitet uno die Mischung wie in Beispiel 2 beschrieben verarbeitet. Das gemischte Glas wurde in 20 mg-Mengen in Spektrophotometer-Küvetten gelagert, die mit einer Dichtungsfolie verschlossen und in einem Labor aufbewahrt wurden, wo die Temperatur zwischen 20 und 35ºC schwankte. Das Glas wurde 14 Tage lang gelagert.
  • Zum Zwecke des Assays wurde der Inhalt einer Küvette in 2,7 ml 0,01M Phosphatpuffer (ph-Wert 7,0) aufgelöst und 0,1 ml einer 1 Einheit/ml enthaltenden LDH-Lösung hinzugefügt. Die dekad.Extinktion bei 340 nm wurde in 30-Sekundenintervallen über einen Gesamtzeitraum von 3 Minuten aufgezeichnet und die Temperatur der Lösung gemessen. Die offensichtliche DH-Bhzymaktivität von einem Zeitraum ermittelt, während dessen die Änderung der dekad. Extinktion linear zur Zeit war. Die Aktivität wurde wie in Beispiel 1 errechnet. Es wurde ein Kontrollassay mit frischen Lösungen von NADH und Pyruvat durchgeführt. Die unter Verwendung des aufgelösten Glases erhaltene offensichtliche Aktivität wies eine starke Übereinstimmung mit dem Kontrollwert auf.
    • Beispie1 5
  • Das aktive Material war Glutamatdehydrogenase. 532 mg Ficoll 400 DL wie in Beispiel 1 verwendet wurde zu 20 ml einer Glutamatdehydrogenase-Lösung hinzugefügt, die 13,3 mg/ml Protein enthielt. Das Protein:Ficoll-Verhältnis betrug daher 1:2. Die Probe wurde dann in 80 0,25 ml-Teilmengen aufgeteilt und unter verringertem Druck (etwa 80% des atmosphärischen) 24 Stunden lang bei 37ºC getrocknet. Die Probe wurde anschließend in zwei Gruppen von jeweils 40 Fläschchen aufgeteilt. Eine Gruppe wurde unter verringertem Druck weitere zwei Stunden lang bei 60ºC erwärmt. Die Gruppen wurden weiter unterteilt und unter einer Reihe von Bedingungen (siehe unten) gelagert. Die Fläschchen wurden periodisch durch Hinzufügen von 2,23 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer oei einem pH-Wert von 7,5, der 0,3 mM EDTA enthielt, erneut hydratisiert, um eine Lösung zu ergeben, die unter der Annahme keines Aktivitätsverlusts 100 Enzymeinheiten pro ml enthalten hätte. Diese wurden im selben Puffer auf 1 Einheit/ml reihenverdünnt. Es wurde die tatsächliche Aktivität des gewonnenen Enzyms ermittelt. Das Prüfverfahren für das gewonnene Enzym verwendete die folgenden Lösungen:
    • Lösungen:
  • 1. 50 mM Tris/HCl pH-Wert 7,5 + 0,3 mM EDTA
  • 2 4,5 mg/ml NADH in Lösung 1
  • 3. 4,0125 g NH&sub4;Cl in 25 ml H&sub2;O
  • 4. 97 mg α:Ketoglutarat (Dinatriumsalz) in 50 ml Lösung 1.
  • Zur Durchführung des Assays wurden 2,6 ml von Lösung 4, 0,2 ml von Lösung 3 und 0,1 ml von Lösung 2 in einer 3 ml Küvette vermischt. 0,1 ml der gewonnenen Enzymlösung wurden hinzugefügt. Die dekad. Extinktion bei 340 nm wurde 5 Minuten lang beobachtet und die Enzymaktivität aus der Veränderung (ΔA) der dekad. Extinktion während des Zeitraums von 5 Minuten errechnet. Die Aktivität wurde unter Verwendung der folgenden Formel:
  • Aktivität (Einheiten/ml)
  • errechnet. Die erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle veranschaulicht, in der "Anfangsaktivität" (die Aktivität des Enzyms ist, das nach einer Mindest-Lagerungsdauer gewonnen wurde. Die Aktivitäten sind als Prozentsätze des theoretischen Werts der Aktivität unter der Annahme angeführt, daß diese vollständig erhalten blieb. Eine Menge von kommerziell gefriergetrockneter Glutamatdehydrogenase (deren Aktivität vor dem Gefriertrocknen von der Lieferfirma angegeben wird) wurde in mehrere Teilmengen aufgeteilt und über verschiedene Zeiträume bei 25ºC gelagert und auf die gleiche Art untersucht. Ihre Aktivität ist auch als Prozentsatz der theoretischen Aktivität angefürt. Die Ergebnisse für dieses Material sind in der Tabelle enthalten. Verarbeitungstemperatur Lagertemperatur Anfangsaktivität Lagerdauer (Wochen) Umgebungstemperatur Gefriertrocknet
  • Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, führen Versuchsfehler zu einigen Abweichungen der Zahlen, die nichtsdestotrotz eine sehr deutliche Aufrechterhaltung der Aktivität über verlängerte Lagerzeiträume und eine viel bessere Aufrecnterhaltung der Aktivität als mit gefriergetrocknetem Material aufzeigen.
    • Beispiel 6
  • 2,50 ml Ascorbatoxidase (21,25 mg Protein)-Lösung wurde hergestellt. Es wurden 2,50 ml Tris-Puffer (pH-Wert 7,6) hinzugefügt, der 21,25 mg Ficoll 400 enthielt, wodurch sich ein Protein-Ficoll-Gewichtsvernältnis von 1:1 ergab. Diese Lösung wurde anschließend in zehn 0,5 ml Teilmengen aufgeteilt und unter verringertem Druck von etwa 80% des atmosphärischen 24 Stunden lang bei 37ºC getrocknet. Als nächstes wurden die Proben bei anhaltend verringertem Druck weitere zwei Stunden lang bei 60ºC erwärmt. Das Lagern erfolgte auf einem Laborregal (Temperaturschwankungen zwischen 17 und 28ºC). Nach verschiedenen Lagerzeiträumen wurden die Proben durch das Hinzufügen von 2,5 ml 0,4 mM Na&sub2;HPO&sub4;, das 0,5 % Rinderserumalbumin enthielt, erneut hydratisiert. Das Enzym wurde danach in derselben Lösung reihenverdünnt, sodaß seine Aktivität 0,2 Einheiten/ml betragen würde, wenn die Aktivität vollständig aufrechterhalten worden wäre, und geprüft. Es wurde die Aktivität im Verhältnis zum Ausgangswert bestimmt.
  • Es wurde ein Assay unter Verwendung des durch Boehringer Mannheim veröffentlichten Standard-Prüfverfahrens durchgeführt. Der Assay überwacht die Abnahme der dekad. Extinktion bei 245 nm, während das Enzym die Oxidation einer bekannten Lösung von Ascorbinsäure katalysiert. Es stellte sich heraus, daß dar Enzym, das zwei Monate lang bei 35ºC gelagert worden war, innerhalb der Versuchsfehlergrenzen dieselbe Aktivität aufwies, wie ein Enzym, das nur über einen sehr kurzen Zeitraum gelagert wurde.
    • Beispiel 7
  • Lactatdehydrogenase wurde unter Verwendung der Verfahrensweise von Beispiel 5 in Ficoll 400 eingearbeitet. Dag Ficoll:Enzym-Verhältnis war 0,23:0,26. Proben wurden uber verschiedene Zeiträume gelagert und dann durch Hinzufügen von 0.01 M Phosphatpuffer in einer Menge gewonnen, die unter der Annahme vollstandiger Aufrechterhaltung der Aktivität eine theoretische Aktivität von 1 Einheit/ml ergeben würde. Die gewonnenen Lösungen wurden mittels des in Beispiel 1 dargelegten Verfahrens geprüft. Die gemessene Aktivität rückgewonnenen Materials betrug als Prozentsatz der theoretiscnen Aktivität: Lagerdauer (Tage) Vor Trocknen
    • Beispiel 8
  • Cytochrom C Reductase wurde in Ficoll 400 mittels der Verfahrensweise von Beispiel 5 eingearbeitet. Das Verhältnis von Enzym:Ficoll betrug 1:1. Proben wurden einer beschleunigten Prüfung unterzogen, d.h. 14 Tage lang bei 35ºC gelagert und dann durch Hinzufügen von 4 ml 0,2 M KHCO&sub3; gewonnen, um eine Lösung mit einer theoretischen Aktivität von 0,87 Einheiten/ml unter Annahme vollständiger Aufrechterhaltung der Aktivität zu ergeben. Das gewonnene Material wurde unter Verwendung des in "Methods in Enzymology" von Mahler, Band II 1955, S.688 erläuterten Verfahrens geprüft. Es stellte sich heraus, daß das gewonnene Material eine Aktivität von 88% des theoretischen Werts aufwies.
    • Beispiel 9
  • Glycerin-3-phosphatdehydrogenase wurde durch die Verfahrensweise der Beispiele in Ficoil 400 eingearbeitet. Das Enzym:Ficoll-Verhältnis betrug 1:2. Proben wurden durch Lagern bei 35ºC einer beschleunigten Lagerungsprüfung unterzogen. Nach siebentägiger Lagerung wurde das Material durch Hinzufügen von 0,05 M Tris/HCl-Puffer (ph-Wert 7,6) gewonnen, der auch 2 mg/ml Albumin und 0,74 mg/ml EDTA enthielt. Das gewonnene Material wurde unter Verwendung eines durch Biozyme Laboratories veroffentlichten Verfahrens geprüft, bei dem das Enzym die Reaktion:
  • Dihydroxyacetonphosphat + NADH T Glycerin-3-phosphat + NAD
  • katalysiert und die Oxidation von NADH spektrophotometrisch bei 340 nm verfolgt.
  • Es stellte sich heraus, daß nach einer siebertägigen Lagerung bei 35ºC die Aktivität 96% der Aktivität einer Kontrollprobe betrug, die unmittelbar nach ihrem Einbau in Ficoll erneut hydratisiert wurde.
    • Beispiel 10
  • Alpha-glucosidase wurde unter Verwendung der Verfahrensweise von Beispiel 5 in Ficoll 400 eingearbeitet. Das Ficoll:Enzym-Verhältnis betrug 1:1. Für eine beschleunigte Prüfung wurden die Proben über verschiedene Zeiträume bei 35ºC gelagert und anschließend durch Hinzufügen von 4 ml 0,067 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) gewonnen, um eine Lösung zu ergeben, deren theoretische Aktivität unter Annahme vollständiger Aufrechterhaltung der Aktivität 2 Einheiten/ml betrug. Die gewonnenen Lösungen wurden mittels eines durch H.Halvorson, Methods in Enzymology 8 559 (1966) beschriebenen Verfahrens geprüft. Die tatsächliche Aktivität des gewonnenen Materials im Verhältnis zum theoretischen Wert betrug: Lagerdauer (Tage bei 35ºC) Vor Trocknen
    • Beispiel 11
  • Pyruvat: 5 g Ficoll 400 wurde zu 20 ml einer 10 mM Natriumpyruvatlösung hinzugefügt. Die Lösung wurde dann in 40, jeweils 0,25 ml enthaltende Teilmengen aufgeteilt, und in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 beschrieben verarbeitet, um die Gläser zu ergeben.
  • NADH: 5g Ficoll 400 wurden zu 20 ml einer 2 mg/ml NADH-Lösung hinzugefügt. Diese wurde in 40, jeweils 0,25 ml enthaltende Teilmengen aufgeteilt und wie in Beispiel 5 verarbeitet, um die Gläser zu ergeben.
  • Nach dem Lagern wurde in Abständen eine Probe jedes Reagens erneut hydratisiert und die Lösungen vermischt. Sie wurden mittels des in Beispiel 4 beschriebenen Standardverfahrens geprüft. Nach einer dreimonatigen Lagerung bei Umgebungstemperatur betrug ihre Reaktionsfähigkeit im LDH-Assay 100% des am Anfang der Lagerung erhaltenen Kontrollwerts.
    • Beispiel 12
  • NADH und Pyruvat wurden die in Beispiel 11 verarbeitet. Teilmengen jedes resultierenden Glaspulvers wurden miteinander vermischt. Eine solche Mischung wurde sofort mittels der Verfahrensweise von Beispiel 4 erneut hydratisiert und geprüft. Die Reaktionsmischung bestand aus 2,8 ml 0,01 M Phosphatpuffer, 0,1 ml einer erneut hydratisierten NADH/Pyruvat-Mischung und 0,1 ml einer 1 Einheit/ml Enzymlösung. Die Änderung der dekad. Extinktion bei 340 nm in einem Zeitraum von drei Minuten wurde als 100% definiert.
  • Eine weitere Mischung wurde eine Woche lang gelagert und anschließend auf die gleiche Weise erneut hydratisiert und geprüft. Innerhalb der Versuchsfehlergrenzen war ihre Aktivität dieselbe. Somit hatte während des Lagerns keine Reaktion von NADH und Pyruvat stattgefunden.
    • Beispiel 13
  • Eine Reihe von Trägermaterialien wurden einem Standardverfahren verwendet, bei dem das gelagerte aktive Material Lactatdehydrogenase ist. In jedem Fall wurde eine Lösung hergestellt, die aus 0,05 g eines in 100 ml 0,01 M Phosphatpuffer aufgelösten Trägers bestand. 1 ml einer 10 mg/ml Lactatdehydrogenase-Lösung wurde dann zu 20 ml der hergestellten Lösung hinzugefügt. Die so geschaffene Lösung wurde in 0,5 ml Aliquote in Glasfläschchen aufgeteilt. Diese wurden 24 Stunden lang unter verringertem Druck von etwa 80% dem atmosphärischen in einem Vakuumofen bei 36ºC getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Fläschchen dicht verschlossen und bei Umgebungstemperatur gelagert. Das Produkt hatte ein Träger:Protein-Verhältnis von 1:0,22.
  • Einige Proben wurden sofort durch Hinzufügen von Phosphatpuffer erneut hydratisiert. Andere wurden über verschieden lange Zeiträume gelagert und danach erneut hydratisiert. Die Enzymaktivität wurde wie in Beispiel 1 ermittelt. Die Enzymaktivität wird in jedem Fall als Aktivität im Verhältnis zu jener eines in der ersten Woche nach dem Trocknen rehydratisierten Enzyms ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle veranschaulicht, in der "PVP" Polyvinylpyrrolidon" bedeutet, "GPS" 6-0-α-D-Glucopyranosyl-D-sorbit bedeutet, "Palatinit" ein Produkt der Südzucker Aktiengesellschaft, Mannheim-Ochsenfurt, Deutschland ist und aus einer äquimolaren Mischung von α-D-Glucopyranosyl-1,6-mannit und α-3-Glucopyranosyl-1,6-sorbit besteht. Träger Lagerdauer bei 25ºC (Wochen) Maltotriose Polydexrose Inulin Stachyose Dextran Sorbose Polyacrylamid PVP GPS Palatinit

Claims (13)

1. Zusammensetzung, die bei 20ºC lagerstabil ist, umfassend:
i) eine Trägersubstanz, die wasserlöslich oder in Wasser quellbar ist und sich in einem glasartigen amorphen Zustand befindet;
ii) zumindest ein zu lagerndes Material, des bei Raumtemperatur von 20ºC in wässerigen Lösung instabil ist und in der genannten amorphen Trägersubstanz gelöst ist, wobei die genannte Zusammensetzung eine Glasubergangstemperatur von zumindest 20ºC aufweist, sodaß sie bei 20ºC in einem glasartigen Zustand vorliegt, mit der Maßgabe, daß die Trägersubstanz keine Verbindung ausgewählt aus Lactitol, Lactose, Maltose und Saccharose ist, die mit Diäthyleminoäthyldextran in einem Gewichtsverhältnis von 200:1 zu 1:10 vermischt ist.
2. Zusammensetzung, die bei 20ºC lagerstabil ist, umfassend:
i) eine Trägersubstanz, die wasserlöslich oder in Wasser quellbar ist und sich in einem glasartigen amorphen Zustand befindet;
ii) zumindest ein zu lagerndes Material, des bei Raumtemperatur von 20ºC in wässeriger Lösung instabil ist und in der genannten amorphen Trägersubstanz gelöst ist, wobei die genannte Zusammensetzung eine Glasübergangstemperatur von zumindest 30ºC aufweist, sodaß sie bei 30ºC in einem glasartigen Zustand vorliegt.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das zu lagernde Material aus Proteinen, Peptiden, Nukleosiden, Nukleotiden, Dimeren oder Oligomeren von Nukleosiden oder Nukleotiden, Enzym-Cofaktoren und Derivaten jeder der obigen Substanzen mit einer oder mehreren zusätzlich daran gebundenen Gruppen ausgewählt ist.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das zu lagernde gelöste Material eine Vielzahl von Materialien darstellt, die einen Teil oder die Gesamtheit eines reagierenden Systems bilden.
5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einem Wassergehalt von nicht mehr als 4 Gew.-%.
6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Trägersubstanz aus Kohlehydraten und Derivaten davon ausgewählt ist, die Polyhydroxy-Verbindungen sind.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die Trägersubstanz ein Zuckerpolymer ist, das Zuckerreste enthält, die über Ätherbrücken an andere bifunktionale Gruppen als Kohlehydrate gebunden sind.
3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Trägersubstanz ein synthetisches Polymer ist.
9. Verfahren zum Lagerstabilmachen eines Materials bei 20ºC, welches Material bei einer Raumtemperatur von 20ºC in wässeriger Lösung instabil ist, umfassend das Auflösen des Materials in einer Trägersubstanz, die wasserlöslich oder in Wasser quellbar ist, oder in einer Lösung davon, sodaß das Material in genannter Trägersubstanz aufgelöst wird, und das Bilden der resultierenden Mischung in einem glasartigen amorphen Zustand, wobei die genannte Mischung eine Glasübergangstemperatur von zumindest 20ºC aufweist, sodaß sie sich bei 20ºC in einem glasartigen Zustand befindet, mit der Maßgabe, daß die Trägersubstanz keine Verbindung ausgewählt aus Lactitol, Lactose, Maltose und Saccharose ist, die in einem Gewichtsverhältnis von 200:1 bis 1:10 mit Diäthylaminoäthyldextran vermischt ist.
10. Verfahren zum Lagerstabilmachen eines Materials bei 20ºC, welches Material bei einer Raumtemperatur von 20ºC in wässeriger Lösung instabil ist, umfassend das Auflösen des Materials in einer Trägersubstanz, die wasserlöslich oder in Wasser quellbar ist, oder in einer Lösung davon sodaß das Material in der genannten Trägersubstanz aufgelöst wird, und das Bilden der resultierenden Mischung in einen glasartigen amorpnen Zustand, wonei die genannte Mischung eine Glasübergangstemperatur von zumindest 30ºC aufweist, sodaß sie bei 30ºC in einem glasartigen Zustand vorliegt.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin das Bilden der genannten Mischung in einen amorphen Zustand durch Verdampfen bei subatmosphärischem Druck erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Verdampfen bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC begonnen und anschließend bei einer Temperatur von 40 bis 70ºC fortgesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin der subatmosphärische Druck nicht mehr als 90% des atmosphärischen ist.
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