JPH08509374A - 生存可能な細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 微生物細胞が、崩壊したマトリックス中に懸濁された静止状態で乾燥組成物の形態で貯蔵のために安定化される。該組成物は、微生物細胞、例えばシュードモナス・フルオレッセンスのようなグラム陰性細菌細胞を、それからマトリックスが誘導されるポリヒドロキシ化合物、好ましくは糖を含む水性組成物と混合し、ポリヒドロキシ化合物の粘性流動が起こりマトリックスが破壊するが、細胞を過度に損傷しない条件下で混合物を乾燥させることにより製造される。マトリックスのガラス転移温度は組成物が貯蔵される温度よりも高いことが理想的である。

Description

【発明の詳細な説明】 生存可能な細菌 本発明は、静止状態（stasis state）にある乾燥微生物細胞を含む組成物の製 造方法、そのような組成物、及びそれから製造された生存培養物に関する。 生存可能な培養物の貯蔵は当分野で問題とされている。例えば、米国特許第3, 897,307号は、（i）アスコルビン酸塩化合物及びグルタミン酸塩またはアスパラ ギン酸塩の組み合わせの、乳酸生産細菌細胞の安定剤としての使用、及び（ii） ある種の糖類、特に25mg/mlの試料溶液の濃度におけるイノシトールの、そのよ うな細菌細胞が凍結乾燥される場合の凍結保護剤（cryoprotectant）としての使 用を開示している。 Mugnier et al.，App1ied and Environmental Microbiology，1985，pp 108-1 14は、ある種の栄養物、例えばC_1-3及びC_6-12化合物と組み合わせた多糖ゲルの 、凍結乾燥した細菌細胞のマトリックスとしての使用を開示している。ゲル形成 多糖類は凍結乾燥に際して崩壊しないことを我々は見出した。 Redway et al，Cryobiology，1974，Vol 11，73-79は、ある種の単糖類（150m g/2ml試料までの濃度）及び関連化合物を、凍結乾燥細菌の長期間生存用の媒体 として研究した。 我々は今回、微生物細胞を本明細書中以下に定義するある種のマトリックス中 に懸濁し、ある種の条件下で乾燥する場合、その短期間の生存可能性（viabilit y）が改善されること、およびそのような乾燥系が以下に定義するような一定の 条件下で貯蔵され、再水和（rehydrate）される場合、微生物細胞の長期間の生 存可能性が改善されることを見出した。 我々はさらに、驚くべきことに、微生物細胞が懸濁されたマトリックスの崩壊 は不十分な短期間の生存可能性を招かないことを見出した。 本発明の第１の形態によれば、崩壊したマトリックス中に懸濁された静止状態 の微生物細胞を含む安定化された乾燥組成物が提供される。 「安定化された（stabilised）」とは、微生物細胞の分解が少なくされている こ とを意味する（そのような分解は復元可能な生存可能細胞の損失につながる）。 「静止状態」とは、細胞が代謝を行っておらず、分裂あるいは増殖していない ことを意味する（しかし、適当な処理にかけると復元可能である）。 「復元可能（recoverable）」とは、適当な条件（即ち再水和と栄養源）に露 出したときに増殖及び分裂が可能である細胞を意味する。 「生存可能な細胞」とは、適当な条件（即ち再水和と栄養源）に露出したとき に増殖及び分裂が可能である細胞を意味する。 「崩壊した（collapsed）」とは、 i）マトリックスが収縮して多孔質の程度が低くなり、低分子量の拡散種がマト リックスに殆ど侵入しなくなり、例えば湿潤空気に曝したときに殆ど水蒸気を吸 収しなくなり、及び／または ii） マトリックスがそのガラス転移温度（Tg）より高い温度にさらされたこと があり、その粘性流動が起こり表面積/容量比が有意に減少し、低多孔性保護コ ーティング中に細胞を封入してしまうことを意味する。 本発明の第２の形態によれば、マトリックス中に懸濁された静止状態の微生物 細胞を含む、安定化された乾燥組成物の製造方法が提供され、該方法は、 A: 微生物細胞を、マトリックスがそれから誘導される物質を含む水性組成物と 混合し、 B: 前記物質の粘性流動が起こり、マトリックスが崩壊するが、細胞を過度に損 傷しないような条件下で混合物を乾燥する、 という段階を含む。 好ましくは、段階Ｂで製造される組成物はマトリックスのTgより低い温度で貯 蔵され、即ち組成物は予測されるその貯蔵温度より高いTgを有する。 従って、段階Ｂにおいて製造される組成物は好ましくはさらに乾燥され（いわ ゆる「二次乾燥」）、マトリックスのTgを上昇させ、組成物をより広い貯蔵条件 範囲に対して安定化させ、即ちより高い温度で貯蔵できるようにする。 本発明による安定化された乾燥組成物が含む微生物細胞は、好ましくは細菌細 胞である。しかし、それ以外の微生物細胞、例えば真菌類、酵母等を使用する可 能性を排除するものではない。微生物細胞が細菌細胞である場合、それらは好ま しくはグラム陰性細菌細胞であるが、それらがグラム陽性細菌の細胞である可能 性を排除するものではない。そのようなグラム陰性細胞の例としては、なかでも 、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、大腸菌（E scherichia coli）及び根域（rhizosphere）関連細菌が挙げられる。 本発明による方法の段階Ａにおいて製造される混合物中の微生物細胞の濃度は 10⁴/ml及び10¹³/mlの間、好ましくは10¹⁰/ml及び10¹¹/mlの間である。 本発明による方法の段階Ａにおいて微生物細胞と混合される物質は、ポリヒド ロキシ化合物、例えばマンニトール、イノシトール、ソルビトール、ガラクチト ールのようなポリオール、あるいは好ましくは炭水化物、より好ましくは糖であ る。 物質が糖である場合、それは二糖、三糖あるいはオリゴ糖であってよく、好ま しくは単糖である。単糖の例としては、なかでも、ヘキソース類、例えばラムノ ース、キシロース、フルクトース、グルコース、マンノース、及びガラクトース が挙げられる。二糖の例としては、なかでも、マルトース、ラクトース、トレハ ロース、及びスクロースが挙げられる。三糖の例としてはラフィノースが挙げら れる。オリゴ糖の例としてはマルトデキストリンが挙げられる。 本発明による方法の段階Ａにおける混合物中に使用されるポリヒドロキシ化合 物の濃度は、10mg/10¹⁰及び1000mg/10¹⁰細胞の間であり、好ましくは200mg/l0¹⁰ 細胞及び400mg/10¹⁰細胞の間である。技術者であれば簡単な実験により、特定の ポリヒドロキシ化合物について、崩壊したマトリックスを製造できる濃度を見出 すことができるであろう。例えば、我々はイノシトールは約45mg/mlにおいて最 適濃度を有することを見出したものであり、イノシトールは60mg/mlを越えると 大幅な細胞損傷を起こし、約25mg/mlより低いと崩壊しない。 ある種のポリヒドロキシ化合物は広い範囲の濃度にわたって保護的特性を示す が、別のある種のものは、ポリヒドロキシ化合物の水性媒体中における溶解度に 関連すると思われる臨界的な濃度より上では有害な効果を示す。 例示の意味のみにおいて本発明による組成物を記載する添付の図面を参照して 本発明をさらに説明する。 図面においては、図１は、水または0.04 M MgSO₄から凍結乾燥したときの、イ ノシトール（添加）濃度によるシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomona s fluorescens）の生存可能性の変化をグラフの形態で示すものである。縦軸は 生存可能性を10億分部で示し（即ち、1E+09=10⁹ ppb、1E+08=10⁸ ppb等）、横軸 は試料当たりのミリグラムでの添加物の濃度を示す。グラフの黒四角（■）は硫 酸マグネシウム中のイノシトールをプロットするものであり、丸（○）は水中の イノシトールをプロットするものである。 図２〜７は、一定の範囲の単糖類について、単糖濃度による凍結乾燥シュード モナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）の生存可能性の変化を グラフの形態で示すものである。縦軸は生存可能性を10億単位で10億分部で示し （即ち、1E+0=10億、5E-1=5億、2E-1=2億等）、横軸は試料当たりのミリグラム での糖濃度を示す。示した単糖は以下の通りである。 図２ ガラクトース 図５ キシロース 図３ フルクトース 図６ ラムノース 図４ グルコース 図７ マンノース 図８は、細胞死亡率（k₁）のマトリックスのTgによる変化、及びTgの相対湿度 による変化をグラフの形態で表したものである。左側の縦軸はk₁を示し、右側の 縦軸はTg（℃）を示し、横軸は相対湿度（%）を表す。グラフにおける実線でつ ながれた黒四角（■）は細胞死亡率定数（k₁）をプロットし、破線でつながれた 菱形はガラス転移温度（Tg）をプロットするものである。 図においては、生存可能性は当初懸濁物中の10⁹生存可能細菌あたりの生存可 能細菌の数で表されており、即ち、これは当初に生存可能であった10億の細菌の それぞれから生き残った細菌の数を示している。これは10億分部生存可能性（pp b）で表されており、即ち10⁹ ppbは100%生存に等しく、10⁸は10%生存に等しい等 となる。 図１から、低いイノシトール濃度においては、細胞の生存可能性は維持される が、より高い濃度、例えば100mg/試料（50mg/mlに等しい）より高い場合、細胞 生存可能性は急速に減少することが判る。 図２〜７から、ある種の単糖類が低濃度、例えば10mg/試料（5mg/mlに等しい ）未満において細胞を損傷から保護し、高濃度、例えば約400mg/試料（130mg/m lに等しい）において保護が実質的に維持されることが判る。 図８から、Tgが貯蔵温度（一番上の水平の線で表した、21〜22℃）未満に落ち ると、細胞死亡率（k₁）は有意に増加することが判り、貯蔵の間、ガラス状態を 維持することの重要性を示している。 物質が有効である濃度、即ちそれが細胞を過度に損傷することなく崩壊する濃 度は、種々の要因に依存し、そのような要因としては、なかでも、段階Ａにおけ る懸濁物中の細胞の容量部分、ポリヒドロキシ化合物の固有のガラス転移温度、 マトリックス中の水濃度の関数としてのマトリックスのガラス転移温度の変化、 及び凍結乾燥中及びその後にマトリックスが露出される温度が挙げられる。 ポリヒドロキシ化合物は、（i）低温において、特には凍結乾燥の間の氷粒子 による損傷に対する凍結保護剤、及び／または（ii）乾燥及び／または貯蔵の間 の水の損失による損傷に対して保護する分散保護剤（lyo-protectant）、及び／ または（iii）細胞の復元中における栄養源として、作用し得ることが理解され るであろう。 本発明の方法において使用するための微生物細胞は慣用の増殖培地、例えば栄 養液体培地あるいはトリプトン大豆液体培地等の中で増殖させることができる。 それらは、任意の好適な増殖期、好ましくは定常期の初期において回収すること ができる。 例えば、培養物を適当な培地中または培地上、例えば液体中または固体プレー ト上で増殖し、所望の細胞濃度を得る。細胞を、典型的には遠心分離により単離 する。細胞を、マトリックスを形成する物質と、場合によっては本明細書中以下 に挙げるその他のある種の添加物とを含む水性組成物に再懸濁する。 好ましくは、本発明の方法に使用する微生物細胞を、増殖培地から単離し、ポ リヒドロキシ化合物、適当な添加剤等を含む溶液中に再懸濁し、乾燥する。しか し、ポリヒドロキシ化合物及び適当な添加剤等を増殖培地中の細胞に添加し、得 られた混合物を乾燥する可能性を排除するものではない。 微生物細胞を再懸濁する場合は、それらを、ポリヒドロキシ化合物を含む適当 な水性媒体、例えばMgSO₄水溶液、あるいは好ましくは水に再懸濁する。 本発明による方法の段階Ｂにおける乾燥は、例えば、蒸発、真空乾燥、スプレ ー乾燥、空気乾燥、あるいは好ましくは凍結乾燥により行うことができる。 本明細書中以前に定義したように、少なくとも乾燥段階の段階Ｂ、あるいは任 意のその後の段階で粘性流動を達成することが必須である。 典型的には、段階Ｂにおいて製造した乾燥組成物の水含量は15%w/w未満である 。 段階Ｂの乾燥が凍結乾燥を含む場合は、組成物は典型的には１種以上の適当な 添加剤を含む。適当な添加剤の例としては、なかでも、凍結保護剤、例えば糖類 またはポリマー種、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、分散 保護剤、例えば糖類またはポリマー種、例えばポリビニルアルコール、ポリエチ レングリコール、あるいは好ましくは抗酸化剤あるいはいわゆる強化剤（potent iators）、例えばアスコルビン酸塩あるいはグルタミン酸塩が挙げられる。その 他の添加剤、例えば、いわゆる増量剤、例えば結晶化糖、例えばマンニトール、 及び浸透調整剤、例えば、ベタイン、尿素/トリメチルアミン-N-オキシド、プロ リン、サルコシン等が存在する可能性を排除するものではない。 以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。 実施例１〜６ これらの実施例は、マトリックスがラムノースを含む本発明による組成物を記 載するものである。 シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）を標準的な 培地（二倍強度栄養液体培地）中で培養し、遠心分離により定常期の初期に回収 した。細胞濃縮物を滅菌水に再懸濁し、十分な容量のオートクレーブにより殺菌 した濃縮ラムノース溶液を加え、5mlの容量の凍結乾燥バイアル中4mlの水の全容 量で、2×10¹⁰細胞に対し200mgの糖の最終濃度の約200のアリコートを得た。 バイアルを凍結乾燥装置の温度コントロールされた棚に置き、棚温度を-30℃ とし、バイアル中の内容物を凍結させ、２時間にわたってその温度を-28℃〜-30 ℃に低下させた。真空にして48時間にわたって一次乾燥を行った。棚温度を０℃ に上昇させ、24時間二次乾燥を行った。バイアルを室温にし、凍結乾燥器から 出す前に真空下に密閉した。 バイアルを真空下に４℃で（実施例１）、あるいは湿度コントロールされた空 気中21℃で（実施例２〜６）貯蔵した。 試料を滅菌水中で再水和し、水中に連続希釈し、KingのB増殖培地上にプレー ティングすることにより生存可能細菌細胞数を測定した。最も希釈されたプレー ト上のコロニー形成単位（cfu）数を使用して、凍結乾燥及び貯蔵条件を生き抜 いた細菌細胞の単位容量当たりの数を計算した。 凍結乾燥の直後、細胞の生存可能性は3ｘ10⁸ppbであった。 真空下４℃で貯蔵された細菌からの結果を表１に示す。 表１から、ラムノースマトリックスの存在が、細菌の生存可能性を実質的に改 善することが判る。 湿度コントロールチャンバー中21℃で貯蔵された細菌からの結果を表２に示す 。 表２から、CT2と比較した実施例２のように、低いRHにおいても糖の存在が生 存可能性を実質的に増加させることが判る。 実施例７〜10 これらの実施例は、マトリックスがラムノース及び硫酸マグネシウムを含む本 発明による組成物を記載するものである。 細胞濃縮物を殺菌水に代えて0.04M硫酸マグネシウム中に再懸濁し、その後ラ ムノース溶液を加えた以外、実施例１〜６の手順を繰り返した。 凍結乾燥の直後、細胞の生存可能性は5×10⁸であった。 凍結乾燥細胞を表３に示した温度および期間で貯蔵した。 表３から、一定範囲の温度にわたって配合物が実質的な保護を与えることが判 る。 実施例11〜15 これらの実施例は、マトリックスにアスコルビン酸ナトリウム及びグルタミン 酸ナトリウムが存在する本発明による組成物を記載するものである。 アスコルビン酸ナトリウム及びグルタミン酸ナトリウムの濃縮水溶液を水及び ラムノース中に再懸濁した細胞に加えた以外、実施例１〜６の手順を繰り返した 。 凍結乾燥の直後、細胞の生存可能性は2×10⁸ppbであった。 試料は21℃において湿潤空気中に貯蔵した。 表４の実施例11及び12から、乾燥細胞をマトリックスのTgより低い温度で貯蔵 することにより細胞が長期間にわたって安定化されることが判る。 結果は、ガラス状態にある崩壊したマトリックスと、抗酸化剤の存在との組み 合わせが、比較的厳しい環境下で生存可能細胞を長期間安定化させることができ るマトリックスを与えることを示している。 実施例16 培養培地から遠心分離により分離された5ｘ10¹²の生存可能細胞を含むシュー ドモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）細胞の4ｇのペレット を14ｇの市販グレードのマルトデキストリン（Glucidex IT19）及び1.6ｇのアス コルビン酸ナトリウムと混合し、最初は室温で、物質を減圧下で乾燥し、このと き蒸発した水は-50℃に維持したアイストラップ上に凝集させた。 約18時間後に乾燥を終了し、このとき真空は1mbarのオーダーであった。 純水中に再水和し、栄養寒天上にプレート化した試料は、典型的には生存可能 細胞の50〜90％の復元を示した。 この方法により製造した材料は20℃を越えるガラス転移を有する崩壊した非晶 質マトリックスであるようであった（試料を標準的な実験室相対湿度に置いたと き）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年５月２５日 【補正内容】 請求の範囲 １．崩壊したマトリックス中に懸濁された静止状態の微生物細胞を含む、安定化 された乾燥組成物であって、微生物細胞がグラム陰性細菌細胞である前記組成物 。 ２．グラム陰性細胞が、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluo rescens）、大腸菌（Escherichia coli）または根域関連細菌である請求の範囲 第１項に記載の組成物。 ３．グラム陰性細菌細胞である、マトリックス中に懸濁された静止状態の微生物 細胞を含む安定化された乾燥組成物の製造方法であって、 A: 微生物細胞を、マトリックスがそれから誘導される物質を含む水性組成物 と混合し、 B: 前記物質の粘性流動が起こり、マトリックスが崩壊するが、細胞を過度に 損傷しないような条件下で混合物を乾燥する、 という段階を含む前記方法。 ４．段階Ｂにおいて製造された組成物を乾燥させてマトリックスのガラス転移温 度をさらに高くし、組成物をより広い範囲の貯蔵条件に対して安定化させる請求 の範囲第３項に記載の方法。 ５．段階Ａにおいて製造される混合物中の微生物細胞の濃度が10⁴/ml及び10¹³/m lの間である請求の範囲第３項に記載の方法。 ６．細胞の濃度が10¹⁰/ml及び10¹¹/mlの間である請求の範囲第５項に記載の方法 。 ７．本方法の段階Ａにおいて微生物細胞と混合される物質がポリヒドロキシ化合 物である請求の範囲第３項に記載の方法。 ８．ポリヒドロキシ化合物が単糖である請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．段階Ａにおける混合物中に使用されるポリヒドロキシ化合物の濃度が10mg/1 0¹⁰細胞及び1000mg/10¹⁰細胞の間である請求の範囲第７項に記載の方法。 10．ポリヒドロキシ化合物の濃度が200mg/10¹⁰細胞及び400mg/10¹⁰細胞の間であ る請求の範囲第９項に記載の方法。 11．組成物に予想される貯蔵温度よりも高いガラス転移温度を有する請求の範囲 第３項に従って製造された組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．崩壊したマトリックス中に懸濁された静止状態の微生物細胞を含む、安定化 された乾燥組成物。 ２．微生物細胞が細菌細胞である請求の範囲第１項に記載の組成物。 ３．細菌細胞がグラム陰性細菌細胞である請求の範囲第２項に記載の組成物。 ４．グラム陰性細胞が、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluo rescens）、大腸菌（Escherichia coli）または根域関連細菌である請求の範囲 第３項に記載の組成物。 ５．マトリックス中に懸濁された静止状態の微生物細胞を含む、安定化された乾 燥組成物の製造方法であって、 A: 微生物細胞を、マトリックスがそれから誘導される物質を含む水性組成物 と混合し、 B: 前記物質の粘性流動が起こり、マトリックスが崩壊するが、細胞を過度に 損傷しないような条件下で混合物を乾燥する、 という段階を含む前記方法。 ６．段階Ｂにおいて製造された組成物を乾燥させてマトリックスのガラス転移温 度をさらに高くし、組成物をより広い範囲の貯蔵条件に対して安定化させる請求 の範囲第５項に記載の方法。 ７．段階Ａにおいて製造される混合物中の微生物細胞の濃度が10⁴/ml及び10¹³/m lの間である請求の範囲第５項に記載の方法。 ８．細胞の濃度が10¹⁰/ml及び10¹¹/mlの間である請求の範囲第７項に記載の方法 。 ９．本方法の段階Ａにおいて微生物細胞と混合される物質がポリヒドロキシ化合 物である請求の範囲第５項に記載の方法。 10．ポリヒドロキシ化合物が単糖である請求の範囲第９項に記載の方法。 11．段階Ａにおける混合物中に使用されるポリヒドロキシ化合物の濃度が10mg/1 0¹⁰細胞及び1000mg/10¹⁰細胞の間である請求の範囲第９項に記載の方法。 12．ポリヒドロキシ化合物の濃度が200mg/10¹⁰細胞及び400mg/10¹⁰細胞の間 である請求の範囲第１１項に記載の方法。 13．組成物に予想される貯蔵温度よりも高いガラス転移温度を有する請求の範囲 第５項に従って製造された組成物。