CN110684665A - 一种海洋发光细菌冻干保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋发光细菌冻干保护剂及其制备方法和应用，属于微生物冻干保护剂范畴。该保护剂由以下配比的原料组成：8wt%~20wt%脱脂乳，4%~8%蔗糖，0.05%~1.5%壳聚糖，0.1%~2%谷氨酸钠，0.01%~1.0%四氢嘧啶，余量为蒸馏水。该保护剂经配液、灭菌和混合制备而成。使用该保护剂制得的海洋发光细菌冻干粉中，于2~8℃下保存18个月后，菌种恢复发光率及菌种发光性能均维持稳定，能极大提高海洋发光细菌菌种的保存效果和质量。
Description
技术领域
本发明设计一种专门针对海洋发光细菌长期保存的冻干保护剂配方及其制备方法和应用，属于微生物冻干保护剂范畴。
背景技术
随着我国工农业的高速发展，各种生态环境污染问题严峻，对生态环境和人体健康带来很大威胁。目前，生物毒性检测实验主要有鱼类急、慢性、蚤类毒性、藻类毒性及微生物毒性实验（如发光细菌对污染物毒性的发光抑制）等。而基于发光细菌为指示物的生物毒性检测法已广泛应用于农药残留、重金属毒性与生物毒素等方面的检测。发光细菌在外界毒物干扰下发光生理过程会受到干扰，从而引起发光强度的变化，且发光值降低程度与外界毒性物质的在一定程度里面呈比例关系，从而通过发光亮度变化反应环境毒性强弱。发光细菌法因其检测速度快、简便、灵敏程可靠、成本低等特点而备受关注。
发光细菌用于环境毒性检测过程中，菌种是重要的影响因素。目前，市场上常用的发光细菌菌种包括两类海水细菌（明亮发光杆菌和费氏弧菌）和一类淡水细菌（青海弧菌）。其中以明亮发光杆菌在《水质急性毒性的测定发光细菌法》（GB/T15441-1995）中所使用；费氏弧菌在欧盟的标准中所使用。
目前，用于毒性检测的发光细菌较多为鲜活细菌，无法长期保存，而菌种制成冻干制品后可以长期保存，从而简化使用发光细菌法的前期工作。冻干制品直接由冰晶升华而制成，具有多孔结构，既能使细菌保持原有活性，又不会破环细胞的形态以及特性。冷冻干燥是将细菌悬浮液冷冻到冰点以下，从而转变为固体结晶态，然后在低温低压(真空)下使固体升华而脱水的干燥方法。干燥处理过程会破坏微生物的细胞膜，引起细胞的大量死亡，通过添加低温保护剂，能够使细菌悬浮，减少活菌在冻干过程中的死亡。因此，在冻干前加入的保护剂配方就成为了至关重要的决定性因素，它既会影响到储存期细胞的活性以及稳定性，也会影响到复水时细胞存活率。
因此，为提高冷冻干燥后菌种的存活率、恢复发光率以及长时间保存的稳定性，研制一种配方简单、安全性好、效果好的发光细菌冻干保护剂有积极的实用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是一种海洋发光细菌冻干保护剂配方。同时，本发明还提供一种海洋发光细菌冻干保护剂的制备方法及应用。本发明令人惊奇地发现，使用本发明的冻干保护剂与菌种制成冻干制品后，显著提高冷冻干燥后菌种的存活率、恢复发光率以及长时间保存的稳定性。本发明基于上述发现而得以完成。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案是：
本发明的一种冻干保护剂是由以下配比的原料组成：脱脂乳的含量为8wt%~20wt%，蔗糖的含量为4wt%~8wt%，壳聚糖的含量为0.05 wt%~1.5wt%，谷氨酸钠的含量为0.1wt%~2wt%，四氢嘧啶的含量为0.01wt%~1.0wt%，余量为蒸馏水。
优选的，本发明的一种冻干保护剂是由以下配比的原料组成：脱脂乳的含量为10wt%~18wt%，蔗糖的含量为5wt%~7wt%，壳聚糖的含量为0.15 wt%~1.25wt%，谷氨酸钠的含量为0.12wt%~1.8wt%，四氢嘧啶的含量为0.02wt%~0.8wt%，余量为蒸馏水。
所述的脱脂乳的脂肪含量≤ 2.0%，且蛋白质含量≥30%。
所述的壳聚糖分子量为100KDa，脱乙酰度为80%。
所述的一种海洋发光细菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）配液：以蒸馏水分别溶解脱脂乳、蔗糖、壳聚糖、谷氨酸钠和四氢嘧啶，配制成各原料的母液，且母液浓度配制成5倍于配方量的浓度；
（2）灭菌：脱脂乳母液、蔗糖母液在115℃下高温高压灭菌15min，快速冷却后，4℃冷藏待用；壳聚糖母液、四氢嘧啶母液以0.22μm无菌微孔过滤器进行除菌；谷氨酸钠母液于121℃下高温高压灭菌21min，快速冷却后，4℃冷藏待用；（3）混合：各母液经灭菌后，按1：1：1：1：1混合均匀即得保护剂。
本发明提供一种海洋发光细菌冻干保护剂的应用，尤其用于与发光细菌和发光菌菌泥混合后冻干制备冻干菌粉的应用。
本发明提供一种海洋发光细菌冻干保护剂的应用，所述的发光细菌包括明亮发光杆菌、费氏弧菌中的一种或多种。
本发明提供一种海洋发光细菌冻干保护剂的应用，所述发光菌菌泥与保护剂按照菌泥离心前体积与保护剂体积1：1进行混合。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点和有益效果：
在常规脱脂奶粉和蔗糖保护剂基础上，添加壳聚糖、谷氨酸钠和四氢嘧啶。其中四氢嘧啶来源于高嗜盐菌，可有效保护海洋细菌在极端条件下受到损伤。壳聚糖在高寒、干燥失水等恶劣的条件下，壳聚糖能够在细胞表面形成特殊的保护膜，充分有效地保护生物分子结构免受破坏，从而维持菌种的生物特征，能够有效提高菌种在冷冻干燥过程中的抗冷冻抗干燥能力。谷氨酸钠能够升高冻干制品的塌陷温度，阻止因塌陷引起蛋白质结构的破坏。
本发明中一种海洋发光细菌冻干保护剂制备工艺简单、操作简便，适于规模化工业生产及应用。与发光细菌混合后冻干，不仅提升细菌的存活率，且于2~8℃下保存18个月后，菌种恢复发光率及菌种发光性能均维持稳定，能极大提高海洋发光细菌菌种的保存效果和质量。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制发明的范围。
实施例1
一种海洋发光细菌冻干保护剂，由以下组分组成：脱脂乳10wt%，蔗糖6wt%，谷氨酸钠wt1%，壳聚糖0.5wt%（分子量为100KDa，脱乙酰度为80%），四氢嘧啶0.1%，余量为蒸馏水。
上述冻干保护剂的制备步骤为：（1）配液：以蒸馏水分别溶解脱脂乳、蔗糖、壳聚糖、谷氨酸钠和四氢嘧啶，配制成各原料的母液，且母液浓度配制成5倍于配方量的浓度；
（2）灭菌：脱脂乳母液、蔗糖母液在115℃下高温高压灭菌15min，快速冷却后，4℃冷藏待用；壳聚糖母液、四氢嘧啶母液以0.22μm无菌微孔过滤器进行除菌；谷氨酸钠母液于121℃下高温高压灭菌21min，快速冷却后，4℃冷藏待用；（3）混合：各母液经灭菌后，按1：1：1：1：1混合均匀即得保护剂。
上述冻干保护剂的应用，冻干制剂的制备：无菌条件下，将明亮发光杆菌新鲜菌泥与保护剂混合均匀后，定量分装于10mL无菌西林瓶中；1h内迅速降温至-70℃，预冻48h。将预冻后的西林瓶置于真空度0~1.0Pa，温度-40℃条件下，持续冻干60h；冷冻干燥完毕，压塞加盖，标记后保存于4℃冰箱备用。
实施例2
一种海洋发光细菌冻干保护剂，由以下组分组成：脱脂乳10wt%，蔗糖8wt%，谷氨酸钠2wt%，壳聚糖1wt%（分子量为100KDa，脱乙酰度为80%），四氢嘧啶0.1%。
上述冻干保护剂的制备及应用同实施例1。
实施例3
一种海洋发光细菌冻干保护剂，由以下组分组成：脱脂乳15wt%，蔗糖4wt%，谷氨酸钠1wt%，壳聚糖1wt%（分子量为100KDa，脱乙酰度为80%），四氢嘧啶0.5%。
上述冻干保护剂的制备及应用同实施例1。
实施例4
一种海洋发光细菌冻干保护剂，由以下组分组成：脱脂乳8wt%，蔗糖4wt%，谷氨酸钠2wt%，壳聚糖0.5wt%（分子量为100KDa，脱乙酰度为80%），四氢嘧啶0.5%。
上述冻干保护剂的制备及应用同实施例1。
实施例5
一种海洋发光细菌冻干保护剂的组成及制备同实施例1。
上述冻干保护剂的应用，具体为：无菌条件下，用明亮发光杆菌冷藏3天后的菌液制备菌泥，菌泥与保护剂混合均匀后，定量分装于10mL无菌西林瓶中；1h内迅速降温至-70℃，预冻48h。将预冻后的西林瓶置于真空度0~1.0Pa，温度-40℃条件下，持续冻干60h；冷冻干燥完毕，压塞加盖，标记后保存于4℃冰箱备用。
实施例6
一种海洋发光细菌冻干保护剂的组成及制备同实施例1。
上述冻干保护剂的应用，具体为：无菌条件下，将费氏弧菌新鲜菌泥与保护剂混合均匀后，定量分装于10mL无菌西林瓶中；1h内迅速降温至-70℃，预冻48h。将预冻后的西林瓶置于真空度0~1.0Pa，温度-40℃条件下，持续冻干60h；冷冻干燥完毕，压塞加盖，标记后保存于4℃冰箱备用。
对比例1
一种海洋发光细菌冻干保护剂，由以下组分组成：脱脂乳10wt%，蔗糖6wt%。
上述冻干保护剂的制备及应用同实施例1。
对比例2
一种海洋发光细菌冻干保护剂，由以下组分组成：脱脂乳10wt%，蔗糖6wt%，谷氨酸钠wt1%。
上述冻干保护剂的制备及应用同实施例1。
对比例3
一种海洋发光细菌冻干保护剂，由以下组分组成：脱脂乳10wt%，蔗糖6wt%，谷氨酸钠wt1%，壳聚糖0.5wt%（分子量为100KDa，脱乙酰度为80%）。
上述冻干保护剂的制备及应用同实施例1。
试验例1
将实施例1~6及对比例1~3中的冻干粉测定塌陷温度（测定方法参考冷冻干燥参数对塌陷温度的影响分析，农业机械学报，2011，42（2））、外观和复溶性（复溶性以等量蒸馏水溶解冻干粉至完全溶解的时间计），结果见表1。
表1 冻干粉外观、复溶性和塌陷温度测定结果
由表1可知，实施例1~6中冻干制品的外观和复溶性均能维持较好水平；与对比例1中冻干粉相比，实施例中冻干粉的塌陷温度更高。
试验例2
分别将实施例1~6及对比例1~3中冻干粉置于高盐（以15%NaCl复溶）、高温（放置于37℃）、高紫外线辐射（用UVA（340）灯连续光照，辐射度为0.89W/m2））的极端条件下保存24h，并以MTT（0.5％四甲基偶氮唑盐）法测定细菌活性，结果见表2。
表2 高盐、高温、高紫外线辐射条件下细菌活性测定结果
由表2可知，实施例1~6中冻干制品与对比例1~3中冻干粉相比，经冻干制备后，本发明冻干制品仍保持了较高水平的细菌活性，明显高于对比例1~3的细菌活性水平。本发明冻干制品在高盐、高温和高紫外线辐射的条件下均保持较高的细菌活性，明显高于对比例1~3的细菌活性水平。结果表明本发明的冻干保护剂可显著提升细菌的存活率，且可有效保护细菌在极端条件下受到损伤。
试验例3
分别将实施例1~6及对比例1~3中冻干粉置于4℃条件下保存，并于保存的第1、3、6、12、18个月，在冻干粉中加入2%NaCl恢复至原体积后，充分混匀后，对其发光值进行检测。恢复发光率=（复苏前发光值/复苏后发光值）×100%，结果见表3。
表3冻干粉在4℃下保存恢复发光率试验结果
由表3可知，实施例1~4中冻干保护剂组分用量不同，但冻干粉在4℃保存18个月后，其恢复发光率均维持较高水平。实施例5使用非新鲜菌液作为菌种，其冻干粉恢复发光率比新鲜菌种的恢复发光率小。实施例6与实施例1使用的冻干保护剂相同，但菌种为费氏弧菌，其恢复发光率也能维持较好水平。
与对比例1~3中冻干粉相比，实施例中冻干粉的恢复发光率更高，效果更好。
综上，本发明一种海洋发光细菌冻干保护剂所制备的海洋发光细菌冻干粉，外观优良，复溶性佳，制剂强度好，恢复发光率高，性能稳定，可长期储存。
Claims (8)
1.一种海洋发光细菌冻干保护剂，其特征在于脱脂乳的含量为8wt%~20wt%，蔗糖的含量为4wt%~8wt%，壳聚糖的含量为0.05 wt%~1.5wt%，谷氨酸钠的含量为0.1wt%~2wt%，四氢嘧啶的含量为0.01wt%~1.0wt%，余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，脱脂乳的含量为10wt%~18wt%，蔗糖的含量为5wt%~7wt%，壳聚糖的含量为0.15 wt%~1.25wt%，谷氨酸钠的含量为0.12wt%~1.8wt%，四氢嘧啶的含量为0.02wt%~0.8wt%，余量为蒸馏水。
3.根据权利要求1或2所述的冻干保护剂，其特征在于，所述的脱脂乳的脂肪含量≤2.0%，且蛋白质含量≥30%。
4.根据权利要求1或2所述的冻干保护剂，其特征在于，所述的壳聚糖分子量为100KDa，脱乙酰度为80%。
5.如权利1~4中任一项所述冻干保护剂的配制方法，其特征在于：包括以下步骤（1）配液：以蒸馏水分别溶解脱脂乳、蔗糖、壳聚糖、谷氨酸钠和四氢嘧啶，配制成各原料的母液，且母液浓度配制成5倍于配方量的浓度；（2）灭菌：脱脂乳母液、蔗糖母液在115℃下高温高压灭菌15min，快速冷却后，4℃冷藏待用；壳聚糖母液、四氢嘧啶母液以0.22μm无菌微孔过滤器进行除菌；谷氨酸钠母液于121℃下高温高压灭菌21min，快速冷却后，4℃冷藏待用；（3）混合：各母液经灭菌后，按1：1：1：1：1混合均匀即得保护剂。
6.如权利要求1~5中任一项所述冻干保护剂的应用，其特征在于：与发光细菌和发光菌菌泥混合后冻干制备冻干菌粉的应用。
7.如权利要求6所述冻干保护剂的应用，其特征在于：所述的发光细菌包括明亮发光杆菌、费氏弧菌中的一种或多种。
8.如权利要求6所述冻干保护剂的应用，其特征在于：所述发光菌菌泥与保护剂按照菌泥离心前体积与保护剂体积1：1进行混合。
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