CN105483008A - 植物乳杆菌固定化制剂制备方法 - Google Patents

植物乳杆菌固定化制剂制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌固定化制剂制备方法，植物乳杆菌液体培养到对数期中后期时停止发酵离心收集菌体备用；冷冻干燥保护剂以10％脱脂乳为悬浮基质，添加2-5％小分子聚谷氨酸(20万Da)、1-2％大分子普鲁兰多糖、5-12％麦精，混合冷冻干燥保护剂溶液稀释菌体，将悬浮液中菌体浓度调节为1010cfu/mL左右。悬浮液1mL置于-20℃冰箱预冻4小时后，置于真空度为1.0pa的冷冻干燥器冻干24小时制得菌粉。

Description

植物乳杆菌固定化制剂制备方法
技术领域：
本发明属于微生物菌剂领域。
背景技术：
乳酸菌是对一类能利用可发酵糖类产生大量乳酸的细菌的通称。在分类学上属于非正式、非规范的惯用名称，但因为它很容易被人们所理解和接受而广泛引用。乳酸菌是正常人体肠道中极为重要的生理菌群之一，它具有维持人体微生态平衡、促进消化、防癌抗癌、增强免疫力、抗衰老等作用，与机体健康息息相关。近年来,乳酸菌作为一种有益菌得到了广泛的研究和开发，目前已广泛应用于保健食品、医药和食品等行业中[1]。但是乳酸菌较难长期保存，因此，乳酸菌的保藏成了热门的研究课题。利用真空冷冻干燥技术生产活菌制剂是多种保藏方法中较为理想的一种[2]。而制作菌粉的关键是保护剂种类及配比的选择。因此，选择一种使用便捷的保藏形式，以及研究使菌种存活率高的保护剂配方有着积极意义。
乳酸菌容易退化、失活，如何解决乳酸菌的保藏是生产中面临的首要问题。目前，日本把培养的乳酸菌制成悬浮液密封在包装材料里(包装材料可用合成树脂薄膜制或用铝箔制)，其装量可根据具体情况而定。封好的乳酸菌悬液，一定要保存在30℃以下，最好在0-10℃保存。
乳酸菌的长期保藏方法，多采用冷冻干燥法或喷雾干燥法，将乳酸菌制成粉剂，用以延长保存时间。冷冻干燥是将欲保藏的微生物细胞悬浮液冻结后，在真空条件下使冰升华，最后达到干燥的目的。此方法主要是根据微生物生理、生化特点，干燥后使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制，达到休眠状态，以保持菌株原有特性。而且用这种方法生产的发酵剂与喷雾干燥法等其他方法生产的发酵剂相比具有更高的稳定性、活性。
但真空冷冻干燥过程是使发酵液中的游离水在冻结状态下失去的一个过程，冷冻和干燥两个过程会造成部分微生物细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化[8]，如果冻干工艺中保护剂选择不当，就会使乳酸菌的存活率下降。发酵液干燥前后乳酸菌的存活率大小可直接体现不同保护剂对乳酸菌活力的影响。因此，冻干保护剂是制作干燥发酵剂最为关键的因素之一，它不仅影响发酵剂在冻干过程中的细胞存活率，也影响保藏期间的细胞稳定性。
如今对于微生物菌粉保护剂的研究日益深入，骆承庠、刘振民等[9]研究发现乳酸菌经过冻融处理后，致死率增加。引起致死损伤的主要因素是机械效应、溶质效应和干燥效应。在冷冻保存菌种时加入保护剂或采取适宜的冻藏、冻干条件，可以减轻菌体的生理性或致死性损伤。保护剂明显提高菌体存活率的原因是由于:
①保护剂存在的氢键和/或离子基团具有与细胞蛋白质结合的能力，这种结合起到稳定细胞蛋白结构的作用，从而保护菌体，避免损伤。不同保护剂结合能力不同，所形成的网络结构紧密程度就不一样。
②保护剂的持水性和形成的网络，使得干燥过程中细胞的水分不至于急剧下降，而使细胞蛋白质结构遭到破坏，菌体受损。网络结构越紧密，干剂残存水分含量越高。
③网络结构还使较多的菌体被包裹其中，从而减少菌体与氧气接触的机会，得到较好的保护。而纤维结构表面积大，包裹的菌相对较少，大量的菌体暴露于表面，受损严重。
保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，进而减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。保护剂按作用方式可分为能透入细胞的保护剂和不能透入细胞的保护剂2种，按分子大小分为低分子化合物(如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类)[10]和高分子化合物(如蛋白质、多肽和多糖类)[11]。曹永梅[12]等对大分子保护剂对乳酸菌的保护作用进行了研究，他们认为以脱脂奶粉与蔗糖、甘油复配后的保护效果最佳。这是因为三者具有互补作用，脱脂奶粉主要在细胞表面起保护层作用，甘油能渗透到细胞内部。吕为群等[13]提出作为低分子保护剂应具有较强亲水性，结构上应具备3个以上氢键，对糖、醇而言应有5个以上羟基，可与菌体细胞膜的磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键[14]，从而保持菌体结构与功能的完整。而大分子保护剂主要是通过包裹菌体而起到保护作用，且能对低分子保护剂有促进作用[11,14]，可两者协同使用效果更佳。
随着20世70年代兴起的固定化微生物细胞技术的发展，为细胞浓缩和发酵剂保藏开辟了新的途径。人们发现固定化的微生物细胞因受固定化材料的保护而提高了微生物对环境的适应性。把细胞固定在某种载体上，可提高细胞的稳定性、抗污染能力，并缩短细胞的延迟期。细胞的固定化材料很多，如蛋白质、多糖、聚乙烯醇等无毒性的聚合物，其能够形成凝胶状结构。
发明内容：
本发明提供一种植物乳杆菌固定化制剂及其制备方法。
技术方案如下：
植物乳杆菌固定化制剂由如下方法制得植物乳杆菌液体培养到对数期中后期时停止发酵离心收集菌体备用。
冷冻干燥保护剂以10％脱脂乳为悬浮基质，添加2-5％小分子聚谷氨酸(20万Da)、1-2％大分子普鲁兰多糖、5-12％麦精，混合冷冻干燥保护剂溶液稀释菌体，将悬浮液中菌体浓度调节为1010cfu/mL左右。悬浮液1mL置于-20℃冰箱预冻4小时后，置于真空度为1.0pa的冷冻干燥器冻干24小时制得菌粉。
植物乳杆菌为CGMCCNO.11763，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
植物乳杆菌益生特性如下：
本发明所提供的植物乳杆菌CGMCCNO.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件下存活，在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；植物乳杆菌CGMCCNO.11763降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；CGMCCNO.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76％。CGMCCNO.11763黏附能力测定的自凝集率为95.71％。
CGMCCNO.11763对胆固醇降解能力研究和测定：
取1mlCGMCCNO.11763母液接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基(胆固醇含量0.1mg/ml,pH6.2)中，37℃的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入1mL无菌水的MRS胆固醇培养基为对照，取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各1ml,9000r/min，4℃下离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为：取各上清液0.1ml于相应的试管中,加冰醋酸0.3ml,1mg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸1.0ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值)。每一处理3个重复，以同样方法制作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率,结果见表1。可知，CGMCCNO.11763对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76％。
表1对胆固醇的降解情况。
菌CGMCCNO.11763菌株的耐胆盐试验：
取CGMCCNO.11763菌液1mL接种菌种于含有不同胆盐(含量梯度为0.0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％)的10mLMRS液体培养基(PH＝6.4)，置于37℃下分别培养0、2、4h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1％处理4h后菌的生长量依然达到0.59±0.92×107(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。
表2耐胆盐能力检测[(±s)×107cfu/ml]
菌CGMCCNO.11763菌株的耐酸试验
取HLX37母液按1ml接种菌种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的10mLMRS液体培养基，置于37℃下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说明该菌具有很强的耐酸能力。
表3耐酸能力检测[(±s)×107cfu/ml]
菌CGMCCNO.11763的黏附能力测定
培养CGMCCNO.11763(MRS液体培养基)、大肠杆菌DH5α(LB液体培养基)24h得发酵液，分别置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌泥，分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌体)。自凝集率(％)：用无菌的PBS将菌泥CGMCCNO.11763制成在波长600nm处的吸光值为0.4±0.1(A0)的悬浮菌液及菌悬液,静置24h后测定吸光值A24，自凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。；他凝集率(％)：将CGMCCNO.11763和大肠杆菌DH5α的悬菌液调节成在波长600nm处的吸光值为0.6±0.1(A0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光值A24，他凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。测定结果见表5，可知CGMCCNO.11763的自凝集率为95.71％，有很强的黏附能力。
表4黏附能力表
菌株生理特性
所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNO.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+)。经过生理生化鉴定为为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH。
菌株能够在57℃下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。
本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆维吾尔族老乡家中酸奶中分离得到，采集时间2015年6月2日。
5L发酵罐试验
(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCCNO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。
(2)将对数期的菌种接入装有3LMRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌CGMCCNO.11763的乳酸产量达到110g/L。这样的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。
(4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCCNO.11763对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，XH对亚硝酸钠的降解速率可以达到653mg/h/L。
(5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，XH菌对亚硝酸钠的分解速率为10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于4.8mg/kg，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
活菌计数
取各保护剂冷冻干燥所得菌粉1份(冷冻干燥前为1mL，冷冻干燥后重量为0.15g)，分别加入10mL10％的脱脂乳溶液中，复水30min。取1mL复水后的乳酸菌液，用8g/L的生理盐水稀释10个梯度，取各梯度菌液0.1mL涂平板，每个梯度2个平行实验[17]，于37℃下培养48h，记录菌落数在30-300个之间的数据，并求平均值，计算菌粉中乳酸菌存活的总菌数记为V2。
公式：
总菌数/ml(g)＝(同一稀释梯度2个平皿上的菌落平均数×稀释倍数)÷取样体积
存活率的计算
存活率(％)＝V2/V1×100
V1——干燥前的活菌数(1mL液体样的活菌数，cfu/mL)
V2——干燥后的活菌数(1mL液体样的活菌数，cfu/mL)
根据各菌粉存活率的差异可以得到对乳酸菌制作菌粉保护效果最佳的保护剂。
制得的菌粉菌存活率达到95％。
实施例1
植物乳杆菌固定化制剂由如下方法制得植物乳杆菌液体培养到对数期中后期时停止发酵离心收集菌体备用。冷冻干燥保护剂以10％脱脂乳为悬浮基质，添加3％小分子聚谷氨酸(20万Da)、1％大分子普鲁兰多糖、8％麦精，混合冷冻干燥保护剂溶液稀释菌体，将悬浮液中菌体浓度调节为1010cfu/mL左右。悬浮液1mL置于-20℃冰箱预冻4小时后，置于真空度为1.0pa的冷冻干燥器冻干24小时制得菌粉。
实施例2
植物乳杆菌固定化制剂由如下方法制得植物乳杆菌液体培养到对数期中后期时停止发酵离心收集菌体备用。冷冻干燥保护剂以10％脱脂乳为悬浮基质，添加5％小分子聚谷氨酸(20万Da)、2％大分子普鲁兰多糖、12％麦精，混合冷冻干燥保护剂溶液稀释菌体，将悬浮液中菌体浓度调节为1010cfu/mL左右。悬浮液1mL置于-20℃冰箱预冻4小时后，置于真空度为1.0pa的冷冻干燥器冻干24小时制得菌粉。制得的菌粉存放2个月后存活率达到95％。

Claims (3)

1.一种植物乳杆菌固定化制剂制备方法，植物乳杆菌液体培养到对数期中后期时停止发酵离心收集菌体备用；冷冻干燥保护剂以10％脱脂乳为悬浮基质，添加2-5％小分子聚谷氨酸(20万Da)、1-2％大分子普鲁兰多糖、5-12％麦精，混合冷冻干燥保护剂溶液稀释菌体，将悬浮液中菌体浓度调节为1010cfu/mL左右。悬浮液1mL置于-20℃冰箱预冻4小时后，置于真空度为1.0pa的冷冻干燥器冻干24小时制得菌粉。
2.根据权利要求1所述一种植物乳杆菌固定化制剂制备方法，所述植物乳杆菌植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)保藏号为CGMCCNO.11763。
3.根据权利要求2所述一种植物乳杆菌固定化制剂制备方法，植物乳杆菌液体培养到对数期中后期时停止发酵离心收集菌体备用。冷冻干燥保护剂以10％脱脂乳为悬浮基质，添加3％小分子聚谷氨酸(20万Da)、1％大分子普鲁兰多糖、8％麦精，混合冷冻干燥保护剂溶液稀释菌体，将悬浮液中菌体浓度调节为1010cfu/mL左右。悬浮液1mL置于-20℃冰箱预冻4小时后，置于真空度为1.0pa的冷冻干燥器冻干24小时制得菌粉。
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