CN101273757B

CN101273757B - 罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN101273757B
Application number: CN2008101030564A
Authority: CN
Inventors: 张董燕; 季海峰; 王四新; 黄建国; 单达聪; 王雅民
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Changsha WIK Feed Co., Ltd.
Priority date: 2008-03-31
Filing date: 2008-03-31
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2028-03-31
Also published as: CN101273757A

Abstract

本发明涉及“罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂及其制备方法”，属微生物饲料制剂添加剂。罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)冻干制剂，其特征在于冻干制剂中的保护剂的重量百分比为：蔗糖1％、脱脂乳12％、乳糖4％、甘油1％、淀粉2％，其余为水。本发明涉及的罗伊氏乳酸杆菌分离于北京油鸡盲肠黏膜，经中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)鉴定为罗伊氏乳酸杆菌，本发明先将该菌株进行发酵扩大，然后进行冷冻干燥，其冷冻干燥制剂的活菌数达到10¹⁰cfu/g，可以直接饲喂动物，最后通过动物安全性实验以及动物饲养实验证明了该菌株具有较高的安全性和功能性。

Description

罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物饲料添加剂及其制备方法，尤其涉及一种含有由罗伊氏乳酸杆菌组成的直接饲喂的活菌冻干制剂及其制备方法。

背景技术

近年来养殖业中存在的问题是长期使用抗生素，结果往往会破坏动物肠道的正常菌群以及药物残留等，这对人类构成潜在的威胁，这些问题也已经危及到人类的安全、食物的安全和农牧业的发展。而以乳酸菌为代表的微生物制剂却能起到与抗生素恰恰相反的作用，它能够扶持动物肠道内有益菌的生长和繁殖，从而抑制有害菌的生长，最终达到维持肠道微生态平衡的作用。

乳酸杆菌在自然界中分布广泛，在动物消化道中为主要优势菌群，如：在猪肠道正常菌群中乳酸杆菌有：嗜酸乳酸杆菌(lactobacillus acidophilus)、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)、短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)、纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivirius)。而鸡肠道中正菌群的乳酸杆菌则有：嗜酸乳酸杆菌(lactobacillus acidophilus)、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivirius)，乳酸杆菌亚种(Lactobacillus spp.)、卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)等。

罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)是普遍存在于人和动物肠道的有益乳酸杆菌，它属于专性异型乳酸发酵菌，已有研究表明罗伊氏乳酸杆菌可定植于动物肠道内，代谢可产生乳酸、乙酸等物质，有抑制肠道有害菌生长和繁殖的作用。该菌株已经被(FDA)和(AAFCO)列入安全的饲料级微生物菌种名单之中，我国卫生部公告2003年第3号公布罗伊氏乳酸杆菌可作为人类保健食品的微生物菌种，但是在2006年公布的5种可以添加到饲料中的乳酸杆菌菌种中并没有罗伊氏乳酸杆菌。既然罗伊氏乳酸杆菌可作为人类的保健食品，申请人认为同样应该可以作为饲料添加剂供动物食用，以克服抗生素带来的危害。

发明内容

本发明针对上述领域的不足，提供一种罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂，可以直接饲喂动物。

罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)冻干制剂，其特征在于冻干制剂中的保护剂的重量百分比为：脱脂乳12％、蔗糖1％、乳糖4％、甘油1％、淀粉2％，其余为水。

所述罗伊氏乳酸杆菌活菌数≥10¹⁰cfu/g。

所述罗伊氏乳酸杆菌来源于北京油鸡盲肠黏膜。

上述冻干制剂的制备方法，将罗伊氏乳酸杆菌液体发酵扩繁，将发酵液离心取菌泥，将菌泥加入到有保护剂的磷酸盐缓冲液中，冻干即可，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.5～6.7.

所述发酵工艺中所用的培养基为改良的MRS液体培养基；接种量为10％；发酵温度为37℃；pH为6.4～6.5；消泡剂为PDA+有机硅；转速为100rpm；发酵时间为24h，所述改良的MRS液体培养基的碳源以菊粉替代部分葡萄糖，它们占液体培养基的重量比分别为菊粉3％，葡萄糖1.7％，所述菊粉中单糖重量百分比为10％。

上述冻干制剂在动物饲料添加剂中的应用。

所述动物为家禽或家畜。

所述家禽为鸡。

本发明从北京油鸡盲肠黏膜上分离得到一株乳酸杆菌，经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定为罗伊氏乳酸杆菌，通过抑菌实验证明了该菌株具有较强的抗k88型大肠杆菌能力，其对大小鼠的急性毒性试验证明了大、小鼠LD₅₀≥5000mg/kg。采用50L发酵罐扩大培养，其发酵工艺参数为：培养基：MRS液体培养基；接种量：10％；发酵温度：37℃；pH：6.4～6.5；消泡剂：PDA+有机硅；转速：100rpm；发酵时间：24h。发酵结束后，离心取菌泥，将菌泥加入到含有保护剂的磷酸盐缓冲液中，保护剂成分为脱脂乳12％、蔗糖1％、乳糖4％、甘油1％、淀粉2％，将保护剂乳化，然后冻干。并将该菌株的冻干制剂添加到AA肉仔鸡饲料中，进行42d的饲养试验，通过肉仔鸡生产性能、盲肠微生物和小肠绒毛结构证明了该菌株在动物生产中的实用性。

附图说明

图1添加菊粉后罗伊氏乳酸杆菌生长OD_600nm值

图2添加菊粉后罗伊氏乳酸杆菌pH值

图350L发酵罐不同时间对罗伊氏乳酸杆菌生长OD_600nm值和pH值的影响

图4不同保护剂对罗伊氏乳酸杆菌存活率的影响

图5冻干制剂对肉仔鸡日增重的影响

图6冻干制剂对肉仔鸡盲肠黏膜和粪中乳酸菌与大肠杆菌的影响

图7小肠绒毛结构电镜观察结果

其中A为对照组，B为抗生素组，C为冻干制剂组

具体实施方法，

实施例1 罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂

1-1乳酸杆菌的分离鉴定

将活鸡剖杀，无菌操作刮取盲肠黏膜1g，置于盛有9ml无菌生理盐水的带有玻璃珠的三角瓶中，充分震荡摇匀，然后吸取0.5ml菌液于盛有4.5ml无菌生理盐水的试管中，此稀释度为10^-1，重复以上过程，依次制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液。选择10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度，吸取0.1ml菌液分别滴于MRS培养基平板上，采用烛缸法37℃培养24～48h，挑取形态不同的菌落在MRS培养基上划线接种做纯培养，而后置于4℃冰箱保存备用。

然后挑取纯培养物进行染色，镜检；选取无芽孢革兰氏阳性杆菌进行接触酶、硝酸盐还原、明胶液化等生化实验，以及糖醇发酵试验，结果与《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸细菌分类及实验方法》对照，确定菌种。然后送至中国工业微生物菌种保藏中心进行鉴定检验。

中国工业微生物菌种保藏管理中心对该乳酸杆菌为罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)的鉴定结果如下：

注：表中“+”表示≥90％菌株阳性，“-”表示≥90％菌株阴性，“ND”表示未测定。

1-2罗伊氏乳酸杆菌的抑菌性能测定

将罗伊氏乳酸杆菌和大肠杆菌分别在各自适宜的培养基内繁殖，传1代。取20h培养物，调整菌的浓度为10⁷cfu/ml。

(1)取MRS液体培养基4ml的试管4支，分别接种乳酸杆菌0.1ml，同时接种大肠杆菌0.1ml，置恒温培养箱37℃培养。取培养物24、48、72、96、120h的培养液倒麦康凯琼脂平板，检查大肠杆菌存活情况，记录活菌数。

(2)取MRS液体培养基4ml的试管4支，分别接种乳酸杆菌0.1ml，培养24h后，接种大肠杆菌0.1ml，置恒温培养箱37℃再培养。取大肠杆菌单独管作为对照，取培养物24、48、72、96、120h的培养液倒麦康凯琼脂平板，检查大肠杆菌拮抗情况，记录活菌数。

(3)取MRS液体培养基4ml的试管4支，接种大肠杆菌0.1ml，培养24h后，接种乳酸杆菌0.1ml，置恒温培养箱37℃再培养。取培养物24、48、72、96、120h的培养液倒麦康凯琼脂平板，检查大肠杆菌拮抗情况，记录活菌数。

该菌株的抑菌性能测定结果为：在罗伊氏乳酸杆菌与大肠杆菌共同培养和先接种罗伊氏乳酸杆菌24h后接种大肠杆菌的情况下，大肠杆菌活菌数很低；在大肠杆菌接种24h后接种罗伊氏乳酸杆菌，72h后大肠杆菌全部失活。

1-3罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂的制备

1-3-1罗伊氏乳酸杆菌50L发酵罐扩大培养

1-3-1-1.罗伊氏乳酸杆菌培养基的优化

1-3-1-1-1材料

菊粉：单糖比例为10％。

1-3-1-1-2方法

改变原有培养基(MRS)的碳源成分，以菊粉替代部分葡萄糖，使培养基碳源占2％，菊粉中单糖含量为10％。共分为4组：I组菊粉1％，葡萄糖1.9％；II组菊粉2％，葡萄糖1.8％；III组菊粉3％，葡萄糖1.7％；IV组菊粉4％，葡萄糖1.6％。采用封口静置培养条件，测定菌株生长OD_600nm值和pH值。见表1、图1、图2。

表1 添加菊粉后罗伊氏乳酸杆菌生长OD_600nm值和pH值

注：表中数据为：均值±标准差。

结果如下：

在培养基中添加菊粉后，能不同程度的增加菌液的OD_600nm值，其中效果最好的为3％菊粉添加量。

1-3-1-2发酵罐扩大培养

1-3-1-2-1.材料

上述改良的MRS液体培养基。

1-3-1-2-2方法

本试验根据所用菌种最适温度为37℃，因此控制发酵罐温度为37℃，发酵培养基采用改良的MRS培养基，接种量为10％，装液量为50％，转速为100r/min，消泡剂为PDA 0.10％+有机硅0.02％，最初pH6.4～6.5，自始至终维持罐压在0.08MPa。分别在发酵的第7，11，15，19，21，23，25，27，29，31h取适量菌液测定其OD_600nm值和pH值，记录罗伊氏乳酸杆菌生长情况。见表2、图3。

表2 50L发酵罐不同时间对罗伊氏乳酸杆菌生长OD_600nm值和pH值的影响

试验结果表明：在发酵的20h后，罗伊氏乳酸杆菌开始平稳生长，进入稳定期，在23h时OD_600nm值达到最高值，为2.502，本发明在其OD_600nm值达到最高之后收取发酵液，因此确定24h为发酵结束时间。

1-3-2乳酸杆冻干制剂的工艺研究

1-3-2-1冻干保护剂的优选

乳酸菌在冻干过程中不可避免地会造成部分细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化，这对生产非常不利。若在冻干前加入适当的保护剂则可以减轻或防止冷冻和干燥两个过程对细胞的损害，使得乳酸菌尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。然而，乳酸菌具有种属特异性，即使在相同的外部条件下，同种菌的不同菌株在冻干过程中也可能表现出不同的特性。因此，根据菌种的特性选择适宜的保护剂在冻干过程中起着至关重要的作用。

1-3-2-1-1材料

脱脂乳、蔗糖、甘油、乳糖等作为冻干保护剂。

1-3-2-1-2冻干制剂的制备方法

罗伊氏乳酸杆菌发酵培养20h后，收取发酵液6000rpm离心10min取菌泥，加入不同组合的保护剂，制成与离心前发酵液浓度相同的菌悬液。将菌悬液倒入冻干机的物料干燥盘中，置于超低温冰箱中急速冷冻，以保证形成小的冰晶和冻结完全，预冻同时打开冷冻干燥机，当机器达到第二级制冷时，将物料干燥盘放入冻干机中，抽真空开始进行冻干。确定最佳保护剂。见表3、图4。

表3不同保护剂对罗伊氏乳酸杆菌存活率的影响

计数培养基为：葡萄糖17.0g，菊粉30.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，三水合乙酸钠5.0g，柠檬酸二氨2.0g，吐温(Tween)80 1.0mL，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O0.58g，MnSO₄·H₂O 0.19g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为6.5，121℃灭菌15min。

结果表明：当保护剂组合为12％脱脂奶粉、1％蔗糖、4％乳糖、1％甘油、2％淀粉时，罗伊氏乳酸杆菌的存活率达到97.26％，因此，确定此为最佳冻干保护剂。

1-3-2-2罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂的制备

罗伊氏乳酸杆菌采用50L发酵罐扩大培养，发酵罐工作参数分别为：发酵罐温度为37℃，培养基采用MRS培养基，接种量10％，装液量为50％，转速为100r/min，消泡剂为PDA 0.10％+有机硅0.02％，最初pH6.4～6.5，自始至终维持罐压在0.08MPa。发酵培养20h后，收取发酵液6000rpm离心10min取菌泥，将菌泥加入到含有保护剂的磷酸盐缓冲液中(pH＝6.6)，保护剂的组成为12％脱脂乳、1％蔗糖、4％乳糖、1％甘油、2％淀粉，制成与离心前发酵液浓度相同的菌悬液。将菌悬液倒入冻干机的物料干燥盘中，置于超低温冰箱中急速冷冻，以保证形成小的冰晶和冻结完全，预冻同时打开冷冻干燥机，当机器达到第二级制冷时，将物料干燥盘放入冻干机中，抽真空开始进行冻干。冻干后即得罗伊氏乳酸杆菌冻干产品，测定后活菌数为5.2×10¹⁰cfu/g。

1-3-3罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂的安全性能测定

将罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂送至国家指定检测中心进行了大、小鼠急性毒性LD₅₀实验，结果证明了大、小鼠LD₅₀均大于5000mg/kg，证明了该罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂属安全性饲料添加剂。

实施例2罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂在肉仔鸡生产中的应用效果

1.将冻干制剂按不同添加比例关系添加到AA肉仔鸡饲料中，试验分为空白组、抗生素组和0.3％冻干制剂组，分别在21日龄末和42日龄末测定肉仔鸡平均日增重。在21日龄末和42日龄末，与空白组和抗生素组相比，添加罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂组能够提高肉仔鸡平均日增重。表4、图5。

表4添加制剂组对肉仔鸡日增重的影响

组别	0～3W	4～6W	全期(0～6W)
				空白组	31.14±0.45	77.85±0.14	55.04±0.70
抗生素组	31.92±0.01	79.55±0.08	56.29±0.45
				菌组	32.49±0.41	82.77±0.12	58.22±0.61

结果显示：与空白组和抗生组相比，试验组添加罗伊氏冻干制剂能提高肉仔鸡日增重，但差异不显著(p＞0.05)。

2.饲养42d结束后分别从空白组、抗生素组和添加冻干制剂组随机抽取2只鸡进行屠宰，颈静脉采血后，放血处死湿法拔毛。取两侧盲肠，用细线扎口，屠宰试验结束后立即于超净工作台中刮取盲肠黏膜和粪便各1g，加入无菌生理盐水99ml，加入玻璃珠震荡摇匀，此为10^-2，依次进行稀释，制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的菌悬液。分别选择10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度吸取0.1ml涂布接种于MRS培养基平皿上(各稀释度设3个重复)，烛缸法37℃培养24小时后，选取乳白色，稍偏黄，表面光滑，凸起，边缘整齐不透明，质地软，直径0.6～2.7mm的菌落进行计数，并进一步作生化鉴定；同时选择10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度吸取0.1ml涂布接种于普通肉汤培养基平皿上(各稀释度设3个重复)，置37℃培养箱中培养24小时后，选取灰色，表面光滑、湿润、凸起，边缘整齐不透明，质地软、粘、直径1.0～3.0mm的菌落进行计数，并进一步作生化鉴定。

表5日粮中添加冻干制剂对肉鸡盲肠黏膜和粪中乳酸菌与大肠杆菌的影响

注：a.同列肩标无相同大写字母者差异极显著(P＜0.01)，同列肩标无相同小写字母者差异显著(P＜0.05)，同列不标任何字母表示差异不显著(P＞0.05)；b.表中数据为每克盲肠黏液或粪中乳酸菌与大肠杆菌含量的对数值。

结果表明，日粮中添加罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂能使盲肠黏膜上乳酸菌数量显著增加(p＜0.05)。表5、图6。

3.取抗生素组和添加冻干制剂组肉仔鸡的十二指肠1mm³左右，用缓冲液冲洗干净后，放置2.5％戊二醛溶液中，送至中国农大电镜实验室进行处理观察。

通过电镜观察，抗生素小肠绒毛显得比较凌乱，而添加冻干制剂组的小肠绒毛比较整齐。见图7。

Claims

1.罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)冻干制剂，其特征在于冻干制剂中的保护剂的重量百分比为：脱脂乳12％、蔗糖1％、乳糖4％、甘油1％、淀粉2％，其余为水。

2.根据权利要求1所述的罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂，所述罗伊氏乳酸杆菌活菌数≥10¹⁰cfu/g。

3.根据权利要求1所述的罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂，所述罗伊氏乳酸杆菌来源于北京油鸡盲肠黏膜。

4.根据权利要求1-3任一所述的罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂的制备方法，将罗伊氏乳酸杆菌液体发酵扩繁，将发酵液6000rpm离心10min取菌泥，将菌泥加入到有保护剂的磷酸盐缓冲液中，冻干即可，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.5～6.7。

5.根据权利要求4所述的制备方法，所述发酵工艺参数为：培养基为改良的MRS液体培养基；接种量为10％；发酵温度为37℃；pH为6.4～6.5；消泡剂为PDA+有机硅；转速为100rpm；发酵时间为24h，所述改良的MRS液体培养基的碳源以菊粉替代部分葡萄糖，它们占液体培养基的重量比分别为菊粉3％，葡萄糖1.7％，所述菊粉中单糖含量百分比为10％。

6.根据权利要求1-3任一所述的罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂在动物饲料添加剂中的应用，所述动物为家禽或家畜。

7.根据权利要求6所述的应用，所述家禽为鸡。