CN100368530C - 一种双歧杆菌胞外多糖及其生产方法与专用生产菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双歧杆菌胞外多糖及其生产方法与专用生产菌株。本发明所提供的双歧杆菌胞外多糖，是发酵星状双歧杆菌(Bifidobacteriumasteroides)BM-10 CGMCC №1355，得到的胞外多糖。星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355来源于广西巴马长寿老人肠道，具有可靠的安全性，制成活菌制剂，可省去常规发酵、提取等繁琐工艺。对星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355产EPS合成条件进行优化后，其产量可达到1.21g/L。本发明的生产双歧杆菌胞外多糖的方法原料简单，对设备要求低，操作简单，成本较低，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种双歧杆菌胞外多糖及其生产方法与专用生产菌株。
背景技术
双歧杆菌属(Bifodobacterium)主要存在于人和动物的肠道内，对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、控制内毒素血症、延缓衰老、抗肿瘤等生理作用。它是人体肠道内典型的有益细菌，其生长繁殖贯穿在人的整个生命历程中。双歧杆菌在厌氧环境下迅速生长繁殖产生大量乳酸，降低系统pH值而抑制和杀死肠道病原菌，使菌群保持正常的微生态平衡。双歧杆菌的存在和含量是人体健康的一个标志。如果机体内双歧杆菌停止了生长，人和动物就很难健康生存。也正因为如此，有关双歧杆菌优良菌株、生理功能及应用等相关研究已成为近20年来长盛不衰的热点。
胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液或荚膜多糖，易与菌体分离，可通过深层发酵实现工业化生产。微生物多糖具有植物多糖不具备的优良性质，它们生产周期短，不受季节、地域和病虫害条件限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。它不仅可以作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等添加剂用于食品和制药中来改善产品的硬度和黏度，而且还具有抗氧化、抗衰老以及增强免疫等多种功能。到目前为止，已大量投产的微生物EPS主要有黄原胶(Xanthan gum)、结冷胶(Gellan gum)、小核菌葡聚糖(Seleeroglucan)、短梗霉多糖(Pullulan)、热凝多糖(Curdlan)等。
目前有关胞外多糖的专利报道多集中在真菌多糖和部分细菌多糖，很少见到益生菌胞外多糖的专利。如2000年5月，苏文金、郑忠辉、黄耀坚、宋思扬、陈晋安申请中国专利：一种海洋细菌胞外多糖的生产工艺及其用途，专利申请号为00106345.6；2004年7月，张俐娜、金勇、陈莉、陈立国、张志强申请中国专利：一种具有抗肿瘤活性的茯苓菌丝体胞外多糖的制备方法，专利申请号为200410060650.1；2004年5月，张伟云、杨金宇、陈佳萍、施佩花申请中国专利：一种真菌胞外多糖复合物的制备及其应用，专利申请号为200410041167.9；2001年4月，J·安巴、J·阿热日、S·沙尤申请了关于过度产生胞外多糖的乳酸菌突变体的专利(专利申请号为01808204.1)，但是也并不是对乳酸菌EPS的系统研究。
关于双歧杆菌的专利文献，多集中在功能性双歧杆菌菌株的开发利用，如：2002年7月，约翰·凯文·柯林斯、杰拉尔德·克里斯托弗·奥沙利文、利亚姆·奥马霍尼、弗格斯·沙纳汉、巴里·基利(营养健康有限公司)申请中国专利：益生菌双歧杆菌菌株，专利申请号为02818577.3；2003年7月，G·C·威斯科米、L·G·罗蒂尼(阿尔法·瓦瑟曼公司)申请中国专利：双歧杆菌和含有它们的制品，专利申请号为03178401.1；2003年2月，王伯瑶、王国兴、黄宁、吴琦(四川大学)申请专利：双歧杆菌细胞壁和双歧杆菌细胞壁蛋白在制药中的应用，专利申请号为03117357.8。而关于双歧杆菌代谢产物的研究寥寥无几。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有较高胞外多糖产量的双歧杆菌。
本发明所提供的双歧杆菌，是星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10，已于2005年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1355。
星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355分离自广西巴马长寿老人肠道。在改良MRS培养基上，星状双歧杆菌(Bifidobacteriumasteroides)BM-10CGMCC №1355的菌落为乳白色或微带黄色，略有凸起，且菌落周围粘稠状，直径约1.0-1.5mm。个体形态为不规则G+无芽孢杆菌，呈现杆状，有Y字形、V字形，有的还呈火柴头状，均是双歧杆菌特有的形态。
本发明的第二个目的是提供一种双歧杆菌胞外多糖及其生产方法。
本发明所提供的生产双歧杆菌胞外多糖的方法，是发酵星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355得到的胞外多糖。
所述方法中，用于培养星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的培养基中的碳源和氮源分别为蔗糖和大豆蛋白胨。用于培养星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的培养基中的无机盐含有MnSO4。
用于培养星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的培养基优选由下述成分组成：蔗糖5.00％，大豆蛋白胨3.00％，MnSO41.45％，牛肉膏3.00％、吐温800.10％，磷酸氢二钾0.20％，乙酸钠0.50％，柠檬酸铵0.20％，硫酸镁0.058％，半胱氨酸盐酸盐0.03％，玉米浆3.00％，水1000mL；所述百分数均为质量百分比。
所述方法中的培养温度可为25-30℃，培养时间可为24-28h，培养基的初始pH值可为5.0-6.0。
所述培养温度优选为25℃，培养时间优选为24h、培养基的初始pH值优选5.5。
所述方法中，得到的双歧杆菌胞外多糖可按照以下步骤进行纯化：
1)在发酵上清液中加入无水乙醇，-20℃沉淀12h，然后4℃下冷冻离心收集沉淀；
2)利用8,000～12,000Da孔径的透析袋，对去离子水，透析12h后以6000rpm的离心速度离心，收集上清液，得到多糖溶液；
3)按多糖溶液总体积的1/2加入Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振荡后静置，离心，取上清重复，直至无游离蛋白；
4)采用凝胶层析法纯化步骤3)得到的上清液，所述凝胶层析法的分离条件为：以Sepharose CL-6B为凝胶填料，加样4mL，样品浓度为4.0g/L，0.05％NaCl作为洗脱剂，以30mL/h的流速洗脱，收集490nm吸收峰处样品，得到一分子量为3.92×105Da的杂多糖。
所述方法中，步骤1)中所加入的无水乙醇体积与发酵上清液的体积相同；步骤3)中用Sevag试剂提取6次，每次振荡20min；步骤4)中所用的层析柱的柱长为800mm，柱内径为16mm。
上述方法得到的双歧杆菌胞外多糖也属于本发明的保护范围。
发酵星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355得到的胞外多糖具有较强的粘度，对乳酸菌的生长有一定的促进作用，具有较强的体外清除DPPH自由基的能力和增强星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355对肠上皮细胞Caco-2的粘附作用等优良特性。
星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355来源于广西巴马长寿老人肠道，具有可靠的安全性，制成活菌制剂，可省去常规发酵、提取等繁琐工艺。对星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC№1355产EPS合成条件进行优化后，其产量可达到1.21g/L。本发明的生产双歧杆菌胞外多糖的方法原料简单，对设备要求低，操作简单，成本较低，适于工业化生产。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的分离和鉴定
1、菌株的筛选
经无菌袋采集回来的广西巴马长寿老人肠道样品，及时移入超净工作台，以无菌纸称取25克，溶解于225mL的生理盐水中，振荡均匀，得到10-1的菌悬液。以针管取1mL此菌悬液注入9mL的生理盐水管中，得到稀释度为10-2的菌悬液，厌氧条件下逐级稀释，直到10-10。
每个稀释度分别取0.4mL，接种到加有0.3％无菌CaCO3粉末的改良MRS培养基(蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸铵0.2％，乙酸钠0.5％，葡萄糖2％，MgSO4.7H2O 0.058％，MnSO4.7H2O 0.025％，吐温800.1％，半胱氨酸盐酸盐0.03-0.04％，玉米浆0.3-0.4％，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.5)的厌氧管内，接种后立即于冰浴中滚管，在管壁上形成一层均匀的培养基混合液的薄膜，37℃恒温培养。培养24h后取出观察，稀释度越大的管壁上单个菌落越清晰，在产生溶解圈的菌落(疑为乳酸菌)中，那些菌落表面粘稠或者菌落周围有扩散现象的菌株为产EPS的可疑菌株。
将产EPS的可疑菌株，分别接种于改良MRS好氧管和厌氧管里，37℃培养，检测其24h内所产EPS的量并进行比较。挑选好氧管内不生长、厌氧管内生长且EPS产量较大的菌株(确定为严格厌氧菌，增加双歧杆菌的概率)作为目标菌株。将其中一株目标菌株BM-10进行鉴定。
2、菌株BM-10的鉴定
通过果糖-6-磷酸解酮酶试验，有机酸的测定，有氧生长试验，细胞形态观察，接触酶试验，硝酸还原试验，靛基质反应等进行属的鉴定。鉴定结果如表1所示。确定菌株BM-10为双歧杆菌属。
表1.菌株BM-10属的鉴定指标与鉴定结果
| 鉴定项目 | 试验结果 | 鉴定项目 | 试验结果 |
| 革兰氏染色细胞形态对氧的反应 | +多形性，多为火柴头状在好气固体培养基上不 | 靛基质反应乙酸含量(mol/L)乳酸含量 | -198119 |
| 硝酸盐还原过氧化氢酶 | 生长-- | (mol/L)乙酸∶乳酸F6PPK | 1.66+ |
注：“+”表示反应阳性，“-”表示反应阴性。
进一步采用Biolog全自动微生物鉴定仪分析鉴定，结果表明菌株BM-10为Bifidobacterium asteroides，即星状双歧杆菌，该菌株已于2005年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1355。
实施例2、利用星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC№1355生产胞外多糖
1、多糖的检测
苯酚-硫酸试剂可与游离的糖或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起显色反应，吸收值与糖含量呈线性关系。
将星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355在改良MRS液体培养基(同实施例1)中，37℃厌氧培养24h，在发酵上清液中加入无水乙醇，-20℃沉淀12h，然后4℃下冷冻离心收集沉淀；利用8,000～12,000Da孔径的透析袋，对去离子水，透析12h后以6000rpm的离心速度离心，收集上清液，得到多糖溶液；按多糖溶液总体积的1/2加入Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振荡后静置，离心，取上清重复，直至无游离蛋白，得到粗多糖水溶液，取该粗多糖水溶液0.1mL，加入1.9mL蒸馏水，然后加入1mL 6％苯酚溶液，缓慢加入5mL浓硫酸，静置10min后，充分振荡，放置20min后，利用722分光光度计，检测其在490nm波长下的吸光值，并计算多糖的含量。结果表明多糖的含量为317.39g/L。
2、胞外多糖生产条件的优化
选择适合于双歧杆菌生长的MRS、改良MRS、PTYG培养基，分别采用2％的接种量，37℃下厌氧培养24h，测定其生长量及EPS的含量，确定基本培养基。
分别对比不同的培养基初始pH值(2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0)、发酵温度(20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、42℃)及接种量(0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％)对EPS产量的影响，确定最适培养条件。
分别对比不同种类的碳源(蔗糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖)、氮源(大豆蛋白胨、普通蛋白胨、聚蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨)和无机盐类对EPS产量的影响，确定最佳培养基成分，以待进行下一步试验。
根据上述培养基成分选择的结果，以合适的因素水平，设计三元二次回归正交旋转实验。
表2.三元二次回归正交旋转设计因素水平编码值表
| 编码 | Z<sub>1</sub>碳源％ | Z<sub>2</sub>氮源％ | Z<sub>3</sub>盐类％ |
| +1.682+10-1-1.682Δ<sub>j</sub> | 5.003.992.501.010.001.49 | 3.002.391.500.610.000.89 | 2.001.591.000.410.000.59 |
为了得到更大产量的双歧杆菌EPS，针对其合成条件进行了优化。确定了改良MRS培养基为最适宜生产EPS的基本培养基后，通过单因素试验，以EPS的合成量为评价指标，分别确定了最佳的培养时间24h、培养温度25℃、培养基的初始pH值5.5和接种量3％，最佳的碳源、氮源和无机盐类分别为蔗糖、大豆蛋白胨和MnSO4。以蔗糖、大豆蛋白胨和MnSO1为因素设计三元二次正交回归旋转试验，以EPS的合成量为评价指标，确定因素最佳组合为蔗糖5.00％，大豆蛋白胨3.00％，MnSO41.45％，培养基中其他组分同改良MRS即：牛肉膏3.00％、吐温80 0.10％、磷酸氢二钾0.20％、乙酸钠0.50％、柠檬酸铵0.20％、硫酸镁0.058％，半胱氨酸盐酸盐0.03％、玉米浆3.00％，蒸馏水1000mL(以上均为质量百分比)。此培养条件下，菌株BM-10胞外多糖的产量可达1.21g/L。
3、星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355胞外多糖纯化条件的优化
(1)残糖去除条件的优化
针对浓缩、醇沉、离心3个提取环节进行EPS提取条件的优化。采用醇提和透析的方法，分析并确定EPS粗提液中残糖去除条件为：
1)浓缩：利用真空旋转蒸发仪，60℃真空浓缩，将发酵上清液浓缩到原体积的1/3。
2)醇沉：在浓缩液中加入3倍体积无水乙醇，-20℃沉淀12h。然后以8000rpm的离心速度，4℃下冷冻离心3次，收集沉淀。
3)残糖的去除：采用透析法。用温水将上述沉淀溶解，利用8,000～12,000Da孔径的透析袋，对去离子水，透析12h后以6000rpm的离心速度离心，收集上清液(多糖溶液)。
(2)蛋白去除条件的优化
通过加热法(50℃加热30min)、等电点法(pH5.0)、Sevag法(按多糖溶液总体积的1/2加入Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振荡20min后静置，离心，取上清重复，直至无游离蛋白)、三氯乙酸法(10％TCA振荡均匀后静置30min)除蛋白，测定OD280nm检测残留的蛋白含量，并检测EPS产量。结果表明，Sevag法去蛋白效果最明显，以Sevag法中的各因素设计4因素3水平正交试验，在此选用Sevag试剂中氯仿同正丁醇的比例为A因素，提取次数为B因素，作用时间为C因素，多糖溶液同Sevag试剂的比例为D因素，各取三个水平，以蛋白去除效果为指标，进行下列正交试验。
表3.Sevag法去蛋白正交试验L9(34)设计与结果
| 处理号 | 因 素 | 蛋白质去除率(％) | EPS得率(％) | |||
| 123456789 | A(v/v)1(4：1)2(5：1)3(9：1)123123 | B(次)1(2)112(4)223(6)33 | C(min)3(40)1(20)2(30)231123 | D(v/v)2(1：1)1(2：1)3(1：2)132321 | 36.8337.5038.9536.9437.1737.1738.3935.4934.49 | 83.0697.7089.0296.6l112.3371.00108.5490.1186.18 |
| K<sub>1</sub>K<sub>2</sub> | 106.35110.75 | 99.55103.30 | 102.30101.75 | 103.590.1 | ||
| K<sub>3</sub>极差 | 90.8519.90 | 105.103.75 | 103.902.15 | 114.3524.25 |
综合考虑对各因素的影响，应优先选择处理7即：按多糖溶液总体积的1/2加入Sevag试剂，V氯仿∶V正丁醇＝4∶1，提取6次，每次振荡20min，此条件下蛋白质的去除率可达到38.39％。
(3)EPS的凝胶色谱纯化的优化
选用Sephacral S-100HR、Sepharose CL 6B两种分离范围有一定差异的凝胶填料，分析比较它们对菌株BM-10 EPS纯化的影响。
选择不同的加样量(2mL、4mL、6mL)、样品浓度(2.0g/L、4.0g/L和6.0g/L)、洗脱速度(15mL/h、30mL/h、45mL/h)，对比其对于EPS分离效果的影响，确定最佳的分离条件。紫外光谱扫描法及高效液相色谱法进行纯度鉴定。确定Sepharose CL-6B为凝胶填料，加样量4mL，样品浓度4.0g/L，洗脱剂为0.05％NaCl，洗脱速度为30mL/h为最佳的凝胶色谱分离条件。
4、胞外多糖的纯化
通过对星状双歧杆菌BM-10菌株合成的EPS分离纯化工艺的摸索，得到了使EPS产量较高且纯度较高的纯化路线，具体如下：
1)浓缩：利用真空旋转蒸发仪，60℃真空浓缩，将发酵上清液浓缩到原体积的1/3。
2)醇沉：在浓缩液中加入3倍体积无水乙醇，-20℃沉淀12h。然后以8000rpm的离心速度，4℃下冷冻离心3次，收集沉淀。
3)残糖的去除：采用透析法。用温水将上述沉淀溶解，利用8,000～12,000Da孔径的透析袋，对去离子水，透析12h后以6000rpm的离心速度离心，收集上清液(多糖溶液)。
4)去蛋白：采用Sevag法(按多糖溶液总体积的1/2加入Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振荡20min后静置，离心，取上清重复，直至无游离蛋白)，萃取6次，每次振荡20min。
5)纯化：采用凝胶层析法。以Sepharose CL-6B为凝胶填料，层析柱的柱长为800mm，柱内径为16mm。加样4mL，样品浓度4.0g/L，0.05％Natl作为洗脱剂，以30mL/h的流速洗脱，10min/管收集。收集490nm吸收峰处样品，经紫外光谱扫描和HPLC检测，无蛋白质和核酸检出，为单一多糖组分。
5、EPS分子量的检测
得到星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的胞外多糖的纯品以后，采用Agilent 1100高效液相色谱系统，ELSD检测器，ShodexKS2805凝胶色谱柱进行检测。标准品Dext ran T系列，均为Pharamacia公司产品。先采用标准葡聚糖Dext ran T系列制作标准曲线，然后根据多糖样品在相同色谱条件下的洗脱体积或保留时间，用标准曲线计算该样品的相对分子质量。流动相为蒸馏水，流速为1mL/min，柱温为60℃。经检测EPS的分子量为3.92×105Da。
6、EPS物理特性及生理功能的检测
(1)溶解性的检测
取星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的胞外多糖干粉分别溶于水、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯等溶剂中，观察试验结果。结果表明，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、乙酸乙酯等有机溶剂。
(2)EPS粘度性质的检测
分别检测温度、pH值及NaCl浓度对EPS粘度的影响。结果如表1、2和3所示，表明星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355的胞外多糖具有较高的粘度，其25℃的粘度为3.0578。其粘度随温度的升高而降低，对于离子强度稳定，对于碱则不稳定。
表1EPS粘度随温度的变化
| 温度℃ | 25 | 30 | 50 | 70 | 85 |
| EPS粘度MPa·s | 3.0578±0.0215 | 2.8481±0.0117 | 2.2785±0.0045 | 1.7842±0.0227 | 1.6449±0.0433 |
表2EPS粘度随pH值的变化
| pH值 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 |
| EPS粘度MPa·s | 3.1133±0.0318 | 3.0944±0.0082 | 3.2478±0.0359 | 3.2533±0.0044 | 5.1029±0.0088 |
表3EPS粘度随离子强度的变化
| NaCl浓度g/l | 0.00 | 0.25 | 0.50 | 0.75 | 1.00 |
| EPS粘度MPa·s | 3.0572±0.0129 | 3.0671±0.0020 | 3.0418±0.0068 | 3.0528±0.0063 | 3.0537±0.0162 |
(3)EPS对病原菌的作用
将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、腊样芽胞杆菌活化，取无菌蒸馏水稀释，取0.1mL菌液于LB固体培养基表面，用灭菌玻棒抹均匀。
每个平皿放入7个牛津杯。多糖液按倍比稀释成3个浓度，分别为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL。中和(pH＝7)前后的多糖溶液均需要经0.2μm微孔过滤除菌。每个牛津杯分别注入0.2mL多糖溶液，无菌生理盐水作空白，置于37℃恒温培养箱中培养24h。测量抑菌圈大小，比较中和前后多糖溶液、生理盐水的抑菌能力。结果表明EPS对以上致病菌无明显的抑制作用。
(4)EPS对乳酸菌生长促进作用
将保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌分别接入10ml改良MRS培养基中，保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌2种菌分别进行如下四种处理：对照(不加糖)、5mLEPS(EPS浓度为100g/L，下面各处理均采用这个浓度)、0.5g葡萄糖、0.5g葡萄糖和5mLEPS，分别培养24h，测定活菌数，看其最终数量的变化趋势。测定0h，10h，24h3个时间点的活菌数。结果如表4和表5所示，表明与单独添加葡萄糖相比EPS对乳酸菌有一定的促进作用。
表4保加利亚乳杆菌不同处理方式的影响
| 活菌数×10<sup>8</sup>CFU | |||
| 处理方式对照(不加糖)5mLEPS0.5g葡萄糖 | 0h7.0777.0777.077 | 10h8.8928.9738.978 | 24h8.6998.9828.703 |
| 0.5g葡萄糖和5mL EPS | 7.077 | 9.021 | 8.810 |
表5干酪乳杆菌不同处理方式的影响
| 活菌数×10<sup>8</sup>CFU | |||
| 处理方式对照(不加糖)5mLEPS0.5g葡萄糖 | 0h7.0777.0777.077 | 10h8.9598.7789.179 | 24h9.0358.6998.826 |
| 0.5g葡萄糖和5mL EPS | 7.077 | 9.204 | 9.182 |
(5)清除自由基
参照文献Nandita S.，Rajini P.S.Free radical scavenging activity ofan aqueous extract of potato peel..Food Chemistry，2004，85：611-616和Yinrong L.，Yeap F.Antioxidant activities of polyphenols from sage(Salvia officinalis).Food Chemistry，2001，75：197-202进行操作，将0.8mL浓度为100g/L的双歧杆菌EPS和2.2mL的0.1mM DPPH溶液(含95％乙醇)混合，用力摇匀，于室温反应30min，离心，收集上清液。用等量的重蒸水作对照，2.2mL乙醇与0.8mL重蒸水混合液调仪器零点，在517nm处测定上清液以及对照溶液吸光值，结果如表6所示，表明EPS体外清除DPPH作用十分显著。
表6EPS对DPPH的体外清除作用
| 组别 | OD值 |
| 对照 | 0.399 |
| EPS混合液 | 0.022 |
(6)细胞粘附试验
将培养好的人肠道上皮细胞Caco-2株进行消化，制成细胞悬液(105个/mL)，接种于含20％胎牛血清但不含抗生素的MEM培养液后，放置入内含洁净细胞飞片的24孔板(Costa公司)中，每孔内加入1mL细胞悬液，于5％CO237℃细胞培养箱中孵育至单细胞贴壁。无菌PBS液洗涤3次，每孔加入1mL菌液(含星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC №1355 108cfu/mL)与1mL MEM细胞培养液的混合液，37℃，CO2含量为5％的空气中孵育2h。用无菌PBS洗涤细胞飞片以除去未结合的细菌。然后火焰固定，革兰氏染色，显微镜下随机挑选20个视野，计数50个细胞上粘附的细菌数，每个处理作3个平行，再计算平均每个细胞所粘附的细菌数。结果如表7所示，表明EPS可明显增强菌株BM-10对肠上皮细胞Caco-2的粘附作用。
表7EPS对人肠道上皮细胞Caco-2株的粘附作用
| 组别 | 每个细胞粘附细菌数数(个) |
| 缓冲液 | 8 |
| EPS混合液 | 15 |
Claims (9)
1.星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355。
2.一种生产双歧杆菌胞外多糖的方法，是发酵星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355，得到胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中，用于培养星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355的培养基中的碳源和氮源分别为蔗糖和大豆蛋白胨。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：用于培养星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355的培养基中的无机盐含有MnSO4。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：用于培养星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10 CGMCC №1355的培养基由下述成分组成：蔗糖5.00％，大豆蛋白胨3.00％，MnSO41.45％，牛肉膏3.00％、吐温80 0.10％，磷酸氢二钾0.20％，乙酸钠0.50％，柠檬酸铵0.20％，硫酸镁0.058％，半胱氨酸盐酸盐0.03％，玉米浆3.00％，水1000mL；所述百分数均为质量百分比。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中的培养温度为25-30℃，培养时间为24-28h，培养基的初始pH值为5.0-6.0。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述培养温度为25℃，培养时间为24h，培养基的初始pH值5.5。
8.根据权利要求2至7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，得到的双歧杆菌胞外多糖按照以下步骤进行纯化：
1)在发酵上清液中加入无水乙醇，-20℃沉淀12h，然后4℃下冷冻离心收集沉淀；
2)利用8,000～12,000Da孔径的透析袋，对去离子水，透析12h后以6000rpm的离心速度离心，收集上清液，得到多糖溶液；
3)按多糖溶液总体积的1/2加入Sevag试剂进行提取，然后离心，直至上清液中无游离蛋白；所述Sevag试剂由氯仿和正丁醇组成，所述氯仿和正丁醇的体积比为4∶1；
4)采用凝胶层析法纯化步骤3)得到的上清液，所述凝胶层析法的分离条件为：以Sepharose CL-6B为凝胶填料，加样4mL，样品浓度为4.0g/L，0.05％NaCl作为洗脱剂，以30mL/h的流速洗脱，收集490nm吸收峰处样品，得到单一多糖组分。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中，步骤1)中所加入的无水乙醇体积与发酵上清液的体积相同；步骤3)中用Sevag试剂提取6次，每次振荡20min；步骤4)中所用的层析柱的柱长为800mm，柱内径为16mm。
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