CN101314620B - 一种干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有下述结构式I的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖的单一多糖LCP1，

Description

一种干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖，特别涉及一种干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖及其制备方法和应用。

背景技术

高血压是现代社会常见的文明病之一，是导致心脏病、脑溢血、梗死等重大疾病的主要风险因子。在西方工业化国家，占人口总数15％以上的人患有高血压，其中以中、老年人居多，并且有低龄化的趋势，尤其是男性，在美国，每4个成年男性中就有1人。该统计不包括血压偏高、尚未达到必须就医程度的人群。来自政府有关方面的数据表明，中国的2002年的高血压患者的人数超过1.3亿，超过总人口的10％。在高血压人群中，由于各种原因，仅有少数人采取了药物治疗措施。

在降压药物之外，通过改变日常的饮食组成和生活方式是用来预防高血压形成和调节高血压患者血压的重要途径。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是一种被公认为安全的乳酸菌，有着长期安全食用的历史。本申请人公开号为CN1916028的专利申请公开了干酪乳杆菌，特别是LC2W CGMCC NO.0828菌株在乳中生长时可以合成与分泌大量具有抗高血压活性的胞外多糖，但尚未能分离出其有效的单组分。

发明内容

本发明要解决的技术问题即是提供一种干酪乳杆菌胞外多糖的有效单组分——单一多糖LCP1及其制备方法。

本发明人即在上述专利申请公开的技术方案基础上，进一步对干酪乳杆菌胞外多糖进行分离提纯，惊奇地发现其中的单组分LCP1具有显著的抗高血压作用。本发明对该单组分进行了进一步的结构分析及理化性质测定，发现其是一种主要由鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)组成的单一多糖。

因此，通过1D(一维)和2D(二维)NMR谱图分析结果，结合单糖组成、红外光谱、甲基化等分析，本发明所指的一种干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1的结构式如下式I所示：

其中，n＝300～1000。

根据本发明，通过高效体积排阻色谱分析，上述单一多糖LCP1的重均分子量(Mw)为1.236×10⁶道尔顿、固有粘度([η])为1.875dL/g、回旋半径(Rg)为42.72nm、多分散性指数(Pd)为1.202和Mark-Houwink指数(α)为0.654。

本发明还提供上述单一多糖LCP1的制备方法，其可以采用硫酸铵沉淀法从干酪乳杆菌胞外多糖中分离，包括下列步骤：在浓度为0.8～1w/w％的干酪乳杆菌胞外多糖水溶液中，加入硫酸铵至其浓度为15～15.5w/w％，静置1小时，然后4℃、9000rpm离心30分钟，沉淀部分用水溶解，然后采用分子截留极限为12,000Dalton的膜在4℃透析48小时，再将截留液干燥。

根据本发明，所说的干酪乳杆菌胞外多糖是指按照现有技术，如上述本申请人的专利申请，将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在含乳培养基中发酵产生的胞外多糖，例如在20～40℃下，将干酪乳杆菌LC2W CGMCCNO.0828菌株在无菌培养基中发酵16～72小时得发酵液，也可以先发酵6～48小时，获得发酵种子液，再继续转种培养，其中，所述的无菌培养基含有0.0～10.0g/L酵母浸出物，0.0～60.0g/L的单糖、双糖和/或寡聚糖，0.0～10.0g/L蛋白胨和60.0～160.0g/L的脱脂奶粉；然后将上述发酵液在95～100℃加热10～30分钟，离心或过滤获得发酵上清液；再加入2～4倍体积的80～100体积％乙醇于上述发酵上清液中，离心或过滤收集沉淀物，在温度不超过115℃下干燥得多糖粗品。较佳的是采用三氯乙酸法去除蛋白和透析法去除其它杂质后的纯化的胞外多糖。

本发明上述干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1具有显著的抗高血压作用。按每天每公斤体重口服15毫克该多糖，可以明显使收缩压明显降低，而且降压效果可以持续10小时以上。因此，本发明单一多糖LCP1可以用以制备预防和治疗高血压病的药品；或者饮食品，例如液态奶、酸奶及乳饮料等乳制品。

由此，本发明还提供一种防治高血压病的药物组合物，其包括作为活性成分的上述本发明干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1。

本发明另还提供一种乳制品，其包括上述本发明干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1。

附图说明

图1为本发明从干酪乳杆菌胞外多糖中采用硫酸铵沉淀法分离单一多糖LCP1的操作流程图。

图2为本发明单一多糖LCP1凝胶柱层析洗脱曲线图。

图3为本发明单一多糖LCP1的紫外扫描图谱。

图4为本发明单一多糖LCP1的红外图谱。

图5为本发明单一多糖LCP1的高效毛细管电泳图。

图6为本发明单一多糖LCP1的高效体积排阻色谱(HPSEC)图。

图7为本发明单一多糖LCP1的单糖组成离子色谱图。

图8为本发明单一多糖LCP1的¹H NMR谱图。

图9为本发明单一多糖LCP1的¹³C NMR谱图。

图10为本发明单一多糖LCP1的HSQC谱图。

图11为本发明单一多糖LCP1的COSY45谱图。

图12为本发明单一多糖LCP1的ROESY谱图。

图13为本发明单一多糖LCP1的HMBC谱图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例1 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖的制备

参照上述专利申请文件，先制得干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖，具体步骤为：

将干酪乳杆菌LC2W CGMCC NO.0828接种到添加0.1％-0.5％(w/v)酵母浸出物、1-3％(w/v)葡萄糖、总乳固体含量为10％(w/w)的无菌脱脂奶中，37℃培养24小时，然后按1-5v/v％接种量转接到上述无菌脱脂奶中，35-37℃发酵24小时；然后通过加热，将发酵乳的温度提升至95℃-100℃，并保温10分钟；待冷却至室温后，通过离心方式获得发酵乳上清液，上清液加入2-3倍体积经过预冷的95％(v/v)酒精，在0-6℃放置过夜；通过离心或过滤的方式收集沉淀物，经过冷冻干燥或低温烘干即可获得胞外多糖粗品。

将上述胞外多糖粗品用蒸馏水溶解，加入pronase E(蛋白酶E，EC3.4.24.31；Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)，酶与多糖粗品的比例为1:1000(w/w)，混合物在37℃保温1小时；然后加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的最终浓度为10％(w/w)，在4℃放置过夜，采用4℃、9000rpm离心20分钟或过滤的方式去除沉淀物；去除沉淀后的胞外多糖溶液采用分子截留极限为12000Dalton的膜对蒸馏水透析，在4℃透析72小时，中间多次换水；经过透析后的多糖溶液经过真空冷冻干燥，获得初步纯化的干酪乳杆菌胞外多糖。

实施例2本发明单一多糖LCP1的分离纯化

采用硫酸铵分级沉淀的方法。将8.0-10.0g实施例1制得的初步纯化的干酪乳杆菌胞外多糖溶于1000ml去离子水中，在80-90℃保温30分钟，使之完全溶解；待冷却至室温(25℃)后，一边搅拌，一边缓慢加入硫酸铵，至加入的硫酸铵浓度达到15-15.5％(w/w)，静置1小时，然后采用4℃、9000rpm离心30分钟。沉淀部分用200ml去离子水溶解，然后采用分子截留极限为12000Dalton的膜对该溶液在4℃透析48小时，中间多次换水。透析后的多糖溶液经过真空冷冻干燥，获得本发明单一多糖LCP1。其分离过程如图1所示。

将本发明单一多糖LCP1通过Sepharose CL-6B凝胶柱(D1.6×100cm，上海沪西分析仪器厂)进行色谱分离，30mg样品溶于3ml去离子水中，上柱。用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，流速0.3mL/min，用硫酸-苯酚法在λ＝490nm检测洗脱液中多糖含量，采用紫外检测器在线检测λ＝280nm处吸光度，结果见图2。

实施例3本发明单一多糖LCP1的理化性质测定和结构分析

1、LCP1纯度鉴定和分子质量测定

1.1LCP1的紫外光谱，如图3所示。

1.2LCP1的红外光谱，如图4所示。

1.3毛细管电泳检测LCP1的纯度

毛细管电泳技术的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析，虽然中性多糖不带电荷，但是它可以在碱性条件下与硼酸盐形成络合阴离子，在毛细管电泳中进行迁移，并可以利用多糖羟基200nm处的吸收峰进行测定。分析方法：流动相含Na₂HPO₄(40mM)、硼酸钠(10mM)和SDS(40mM)，并用HCl调pH为9.0，用流动相配制LCP1浓度为3mg/mL溶液，毛细管柱采用未涂层熔融石英毛细管柱(直径75μm，长60cm)，在25KV电压下电泳20min，200nm检测。LCP1毛细管电泳结果见图5，显示了LCP1为单一峰，这进一步确定了LCP1为一种分子量均一的纯多糖。

因此，通过上述检测过程，证明所获得的LCP1，是一种不含蛋白成分的单一多糖。

1.4LCP1分子量和理化特性分析

采用高效体积排阻色谱分析(HPSEC)法。将LCP1溶解在0.1mol/L的NaNO3溶液中，50℃搅拌溶解1h，冷却，用0.45μm尼龙膜过滤后进样，以已知分子量、固有粘度和dn/dc(比折光指数增量)的两种普鲁兰多糖为标样进行测定。高效体积排阻色谱系统包括：Shimadzu SCL-10Avp泵和自动进样器；Viscotek检测系统(示差折光检测器、粘度计和右角激光光散射检测器)；二根串联色谱柱(Shodex Ohpak KB-806M和Ultrahydrogel linear)。以0.1mol/L的NaNO₃为流动相，流速为0.6mL/min，进样量100μL。使用Viscotek公司提供的TriSEC软件计算LCP1的平均分子量、固有粘度、回旋半径、多分散性指数和Mark-Houwink指数。

LCP1高效体积排阻色谱图(图6)显示LCP1为一均匀对称的峰，图中LS、RI和DP三线分别为激光光散射、示差折光和粘度信号响应值。LCP1的重均分子量(Mw)、固有粘度([η])、回旋半径(Rg)、多分散性指数(Pd)和Mark-Houwink指数(α)测定结果见表1，LCP1的平均分子量为1.236×10⁶Da。回旋半径又称回转半径，是单个高分子分子链在空间伸展程度的一种尺度，适于对高分子聚合物分子尺寸的表征，HPSEC测得的LCP1回旋半径为42.72nm。多分散性指数是衡量样品相对分子质量分布均一性的参数，Pd＝Mw/Mn(Mn为数均分子量)，Pd越接近1说明样品均一性越好，LCP1多分散性指数为1.202，说明LCP1分子量分布范围非常窄，分子大小比较均匀。当Mark-Houwink指数α为0.5-0.8时表明聚合物分子是一种无规卷曲的构型，α<0.5时分子构型接近球形，而α>0.8时分子构型是杆状，HPSEC测得α为0.654，故LCP1分子在0.1mol/L NaNO₃溶液中呈无规卷曲构型。

表1LCP1的Mw、[η]、Rg、Pd和Mark-Houwink指数α

2、干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1的结构分析

采用部分酸水解、Smith降解和甲基化分析等方法，结合GC-MS、NMR和FT-IR等测试手段对LCP1的结构进行分析。

2.1LCP1单糖组成分析

采用离子色谱法测定单糖组成。准确称取LCP1样品10.00～25.00mg，溶于1mL1mol/L的硫酸溶液，100℃水解2h，水解液稀释20倍，通过高效离子色谱(HPAEC-PAD)分析其单糖组成。离子色谱测定条件为，色谱柱：Carbopace PHI.PGI；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；检测器：脉冲安培检测器，金电极。采用NaOH溶液线性梯度洗脱(NaOH浓度100mmol/L～300mmol/L)。

LCP1单糖组成的HPAEC-PAD色谱图见图7，结果显示LCP1主要由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比约为3:5:2(见表2)。

表2LCP1的单糖组成

2.2LCP1的甲基化分析

称取约2～3mg经过充分干燥的本发明单一多糖LCP1样品于具塞反应瓶中，加入无水DMSO充分溶解后，分别加入NaOH干燥粉末和碘甲烷进行甲基化反应，反应液用二氯甲烷萃取，过Na₂SO₄柱，收集滤液，N₂挥发至干。

甲基化反应产物用TFA溶液水解，反应产物冷却后用N₂挥发至干，再用NaBD₄进行还原；将还原产物反复用乙酸/甲醇液以及甲醇除去硼酸根，N₂挥发至干；加入0.5mL乙酸酐于100℃进行衍生，反应结束后用N₂挥发至干，即为部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAA)。用二氯甲烷萃取，过Na₂SO₄柱，收集滤液，采用GC-MS分析，结果如表3。

GC-MS分析条件：OV1701毛细管柱(Φ0.25mm×30m，膜厚0.25mm)，程序升温：起始温度150℃，以3℃/min升温至250℃，停留10min，载气为氦气。EI⁺源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度200℃，检测器电压350V。

表3  LCP1的甲基化分析(mol.％)

甲基化分析结果表明：LCP1主要由1-Rha、1，3-Rha、1-Glc、1，4-Glc、1，2-Gal和1，3，4，6-Glc组成，通过峰面积计算得到的其含量摩尔比约为2:1:2:2:2:1，Rha、Glc和Gal各单糖含量摩尔比约为3:5:2，即鼠李糖(Rha)：葡萄糖(Glc)：半乳糖(Gal)＝3:5:2。

2.3¹H NMR、¹³C NMR、HSQC、HMBC分析

¹H NMR主要用于确定多糖结构中糖苷键构型。通常α型糖苷异头碳的质子信号大于δ5.0，β型糖苷异头碳的质子信号一般小于δ5.0，耦合常数³J_1，2也有助于解析异头质子。此外，¹H NMR的特征信号可以确定某些糖残基或基团：异头质子(H1)和6位脱氧糖的甲基(H6)信号的线宽和积分可用于区别糖单元的类型及其相对含量；6位脱氧糖的甲基(H6)质子信号出现在高场区δ0.8～1.5；乙酰基的甲基质子信号出现在低场区δ1.8～2.3。LCP1的¹HNMR谱图如图8。

¹HNMR图谱显示：高场区δ1.22和δ1.32处较强的共振信号为Rha残基的甲基质子信号，此信号通常以两个分得很开的成对峰出现，表明Rha残基有2种不同的糖苷键连接方式，这与甲基化分析结果相符，部分酸水解产物¹H NMR结果与甲基化综合分析确定δ1.32信号为1，3-Rha的甲基质子信号，δ1.22信号为1-Rha的甲基质子信号；δ2.01和δ2.15为O-乙酰基的甲基质子信号，两重峰说明乙酰基取代位置发生在糖链中糖残基的不同位置。

¹³C NMR可通过异头碳的共振区(δ90～110)峰的个数确定糖残基的数量和相对含量。通常，α-型糖苷异头碳的化学位移在δ95～101范围内，而多数β-型糖苷异头碳的化学位移位于δ101～105。此外，由¹³C NMR的特征信号可以确定某些糖残基或基团，如乙酰基的碳信号出现在低场区δ170～180；6位脱氧糖的甲基碳信号出现在高场区δ15～20；乙酰基(CH₃COO-)的甲基碳信号出现在较高场区δ22～25。LCP1的¹³C NMR谱图如图9。

HSQC是指异核单量子相干谱(Heteronuclear Single-qauntum Coherence)，它反映的是直接相连的¹H、¹³C核之间的耦合关系(¹J_CH)，其作用相应于H，C-COSY。LCP1的HSQC谱见图10，由HSQC发现LCP1有10个异头质子。

在确认异头质子后，一般从异头质子的对角线峰出发，首先找到H1/H2的交叉峰。再由H2对角线出发峰出发，依次找出H3-H6的对角峰和化学位移。LCP1的COSY45和ROESY谱图分别如图11和图12。

HMBC(异核多量子相关谱，Heteronuclear Multiple-bond Correlation)把¹H核与长程耦合的¹³C关联，提供分子骨架的结构信息，作为一种序列分析工具给出糖单元间的连接次序。LCP1的HMC谱图见图13。

综合以上谱图分析，结合LCP1的部分酸水解和甲基化结果，对LCP1糖残基的¹H和¹³C NMR的化学位移进行归属，结果见表4和表5。

表4LCP1糖残基的¹HNMR的化学位移(δ)

表5  LCP1糖残基的¹³C NMR的化学位移(δ)

2.4LCP1一级结构表征

综合以上LCP1的1D和2D NMR谱图分析结果，结合单糖组成、红外光谱、甲基化分析，确定LCP1具有的结构特征为：

1.LCP1含有1，4-连接β-D-葡萄糖，1，3，4，6-连接β-D-葡萄糖和1，3-连接鼠李糖按2：1：1比例构成的主链；

2.在1，3，4，6-连接葡萄糖的3位及6位有分支，在3位取代有单个的α-L-鼠李糖，而在6位取代有由两个1，2，6-连接半乳糖为核心构成的支链，半乳糖的2位及6位又分别取代有鼠李糖及葡萄糖；

3.¹H及¹³C-NMR谱均显示该多糖中含有乙酰基，HMBC谱中乙酰基质子与糖环碳原子无相关，但ROESY谱中，乙酰基质子葡萄糖的H2(3.21)有弱相关峰，表明它可能取代于葡萄糖的2位；

根据以上结构特征，LCP1的分子结构如上式I所示。其中，根据上述高效体积排阻层析过程中单个洗脱峰开始和结束时的分子量除以重复单位的分子量(1656Dalton)可以估算出n约为300～1000范围。

试验实施例1本发明干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1对自发性高血压大鼠的降压作用

17周龄，♂自发性高血压大鼠16只，随机分为2组，每组8只。对照组给予麦芽糊精15mg/kg/d。试验组给予LC2W胞外多糖组分LCP115mg/kg/d。大鼠在灌胃前一周开始测压，待血压稳定后开始实验。大鼠每天灌胃一次，连续七天，并分别在灌胃的第1、3、5和7天测定大鼠血压。在第一天实验中，先测定大鼠灌胃前血压，然后灌胃，并分别测定灌胃后2，4，6，8，10，24小时大鼠血压，观察样品对大鼠血压的作用。在第三、第五和第七天的实验中，测压的时间分别定在灌胃前和灌胃后2小时、4小时。结果如下：单次灌胃时，LC2W胞外多糖组分LCP1灌胃前大鼠的收缩压为187±8mmHg，灌胃后2，4和6小时分别下降至164±6，168±6和177±6mmHg，较灌胃前均显著下降(P<0.01)(表6)；而对心率没有明显影响(表7)。

表6LCP1单次灌胃对SHR血压的影响(X±SD，n＝8)

^*P<0.05，^**P<0.01 vs 0 h；#P<0.05，##P<0.01vs对照组

表7 LCP1单次灌胃对SHR心率的影响(X±SD，n＝8)

^*P<0.05，^**P<0.01 vs 0 h；#P<0.05，##P<0.01vs对照组

干酪乳杆菌胞外多糖的单组分LCP1在大鼠连续灌胃过程中，观察第一天、第三、第五和第七天灌胃后2小时和4小时的大鼠血压变化，结果显示LCP1在灌胃第一、三、五和第七天均有明显的降压作用，见表8；对照组大鼠血压无明显差化，见表9。

表8LC2W胞外多糖单组分LCP1多次灌胃后对SHR血压的影响

^*P<0.05，^**P<0.01 vs 0 h；#P<0.05，##P<0.01vs对照组为麦芽糊精

表9对照组麦芽糊精多次灌胃后对SHR血压的影响

^*P<0.05，^**P<0.01 vs 0 h；#P<0.05，##P<0.01vs对照组麦芽糊精

LCP1在第三天灌胃后2小时出现一次性的心率减慢。在其它时间测定所获得的心率无明显的变化，见表10。

表10LC2W胞外多糖的单一多糖LCP1多次灌胃后对SHR心率的影响

^*P<0.05，^**P<0.01 vs 0 h；#P<0.05，##P<0.01vs对照组麦芽糊精

结论：

干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖组分LCP1单次灌胃对自发性高血压大鼠有较强和持续的降压作用，效应峰值约为灌胃后2小时，药后24小时恢复。

试验实施例2 干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1对正常Wistar大鼠血压的影响

采用尾动脉间接测压法，观察干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1对正常Wistar大鼠血压的影响。干酪乳杆菌胞外多糖的单组分LCP1按5mg/kg和25mg/kg的剂量灌胃，分别测定大鼠在灌胃前和灌胃的2、4、6、8、10、及24小时收缩压和心率的变化。

12周龄，♂，Wistar大鼠24只，随机分为3组：对照组给予麦芽糊精15mg/kg，试验组分别给予干酪乳杆菌LC2W胞外多糖单组分LCP15mg/kg和25mg/kg。每组8只大鼠。

大鼠在灌胃前一周开始测压二次，待血压基线稳定后开始实验。分别测定大鼠在灌胃前和灌胃后2、4、6、8、10、及24小时收缩压和心率的变化，观察样品对大鼠血压和心率的影响。

结果显示干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1对Wistar大鼠的收缩压和心率没有明显影响(P>0.05)。见表11和表12。

表11单一多糖LCP1对Wistar大鼠血压的影响(X±SD，n＝8)

^*p<0.05，^**p<0.01

表12单一多糖LCP1对Wistar大鼠心率的影响(X±SD，n＝8)

^*p<0.05，^**p<0.01

结论：本发明干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1对Wistar大鼠的收缩压和心率没有明显影响。

Claims (7)

1.一种具有下述结构式I的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖的单一多糖LCP1，

其中，n＝300～1000。

2.如权利要求1所述的单一多糖LCP1，其特征在于所述的单一多糖LCP1的重均分子量为1.236×10⁶道尔顿、固有粘度为1.875dL/g、回旋半径为42.72nm、多分散性指数为1.202和Mark-Houwink指数为0.654。

3.一种如权利要求1或2所述的单一多糖LCP1的制备方法，其采用硫酸铵沉淀法从干酪乳杆菌胞外多糖中分离，包括下列步骤：在浓度为0.8～1w/w％的干酪乳杆菌胞外多糖水溶液中，加入硫酸铵至其浓度为15～15.5w/w％，静置1小时，然后4℃、9000rpm离心30分钟，沉淀用水溶解，然后采用分子截留极限为12000Dalton的膜在4℃透析48小时，再将截留液干燥；其中，所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌LC2W CGMCC NO.0828菌株。

4.如权利要求1或2所述的干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1在制备防治高血压病的药品或饮食品中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的饮食品为乳制品。

6.一种防治高血压病的药物组合物，其包括作为活性成分的如权利要求1或2所述的干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1。

7.一种乳制品，其包括如权利要求1或2所述的干酪乳杆菌胞外多糖的单一多糖LCP1。

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