CN104987424A - 一种牛奶多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛奶多糖及其制备方法，涉及牛奶多糖技术领域。其由如下步骤制得：（1）发酵奶预处理；（2）牛奶多糖粗提取；（3）牛奶多糖的纯化；（4）紫外光谱鉴定牛奶多糖纯度；（5）蒽酮-硫酸法测定牛奶多糖的含量，即得。本发明制备方法不但操作简单，提取方便，提取率也相对较高。本发明牛奶多糖最大程度的保留了多糖的活性。

Description

一种牛奶多糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及多糖的提取与纯化，具体涉及一种从发酵奶中提取及纯化的牛奶多糖。

背景技术

随着科技的发展，人们对生活的质量要求越来越高，人们开始追求健康饮食。多糖对人体发挥重要作用且暂时没有发现副作用。从20世纪50年代末人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来，人们对多糖这类重要生命物质有了许多新的认识，多糖的应用已渗入到保健品，化妆品，食品，饲料等领域，从而使这一学科成为目前生命科学中最活跃的研究领域之一。

多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式（C₆H₁₀O₅）_n表示。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。

多糖化合物广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，也是构成生物的四大基本物质之一。从20世纪50年代末人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来，人们对多糖这类重要生命物质有了许多新的认识。

牛奶，最古老的天然饮料之一，被誉为“白色血液”，对人体的重要性可想而知。牛奶经过乳酸菌发酵后，由于乳酸菌代谢可以产生多糖类物质，所以经过发酵的酸奶其多糖含量会有所增加。研究表明多糖具有免疫调节，抗病毒和抗癌，降血糖和乳化等作用，较其他类的多糖品质更为优良，利用价值更高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从发酵奶中提取和纯化的牛奶多糖及其制备方法。

本发明所用的发酵奶原料是临沂格瑞食品有限公司生产的原味发酵奶。

本发明一种牛奶多糖，是从发酵奶中提取并分离纯化制得的，具体由如下制备方法制得：

（1）发酵奶预处理

采用超声波提取法对发酵奶进行预处理，真空过滤、浓缩得提取液；

 （2）牛奶多糖粗提取

采用氯化钠法分离纯化：在沸腾情况下，将（1）中所得提取液调节pH，加入氯化钠，搅拌，煮沸，冷却至室温，过滤，得脱蛋白多糖液；

（3）牛奶多糖的纯化

将（2）中经过脱蛋白与脱色处理的牛奶多糖配置成1%的多糖溶液，经DEAE-52纤维素柱层析，然后用NaCl进行洗脱，控制流速，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，再根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰管，接着经Sephadex G-100凝胶柱层析，然后用NaCl进行洗脱，控制流速，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，最后根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰管；    

（4）紫外光谱鉴定牛奶多糖纯度

    用分光光度计检测纯化出来的牛奶多糖在190-400nm范围内是否存在核酸、蛋白质吸收峰；测定牛奶多糖中是否含有核酸和蛋白质；

（5）蒽酮-硫酸法测定牛奶多糖的含量，即得。

所述步骤（1）中pH值调至9-10，加入氯化钠使浓度达到5%W/v，搅拌，煮沸30min。

所述牛奶多糖经离心分离得到沉淀物，真空干燥，呈固态浅棕色粉末状。

所述的牛奶多糖为片剂。

本发明牛奶多糖的制备方法，包括如下工艺步骤：

（1）发酵奶预处理

采用超声波提取法对发酵奶进行预处理，真空过滤、浓缩得提取液；

 （2）牛奶多糖粗提取

采用氯化钠法分离纯化：在沸腾情况下，将（1）中所得提取液调节pH，加入氯化钠，搅拌，煮沸，冷却至室温，过滤，得脱蛋白多糖液；

（3）牛奶多糖的纯化

将（2）中经过脱蛋白与脱色处理的牛奶多糖配置成1%的多糖溶液，经DEAE-52纤维素柱层析，然后用NaCl进行洗脱，控制流速，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，再根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰管，接着经Sephadex G-100凝胶柱层析，然后用NaCl进行洗脱，控制流速，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，最后根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰管；    

（4）紫外光谱鉴定牛奶多糖纯度

    用分光光度计检测纯化出来的牛奶多糖在190-400nm范围内是否存在核酸、蛋白质吸收峰；测定牛奶多糖中是否含有核酸和蛋白质；

（5）蒽酮-硫酸法测定牛奶多糖的含量，即得。

糖在浓硫酸作用下，经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。

    本发明制得的牛奶多糖经离心分离得到沉淀物，真空干燥，即为牛奶多糖制品，固态粉末呈浅棕色。

  本发明涉及的牛奶多糖提取工艺其提取过程无酸、碱、酶及有机溶剂对牛奶多糖的影响，所得牛奶多糖生物活性较高。其中超声波提取法是利用超声波的机械效应、空化效应及热效应。机械效应可增大介质的运动速度及穿透力，能有效的破碎生物细胞和组织，从而使提取的有效成分溶解于溶剂之中；空化效应使整个生物体破裂，整个破裂过程在瞬间完成，有利于有效成分的溶出；热效应增大了有效成分的溶解速度，这种热效应是瞬间的，可使被提取成分的生物活性尽量保持不变。此外，许多次级效应也能促进提取材料中有效成分的溶解，提高了提取率。而且氯化钠法较适合牛奶多糖的分离方法，不但操作简单，提取方便，提取率也相对较高。另外，本发明制备的牛奶多糖可作为食品添加剂添加到需要强化牛奶多糖的食品中，也可以添加到保健品或药品直接食用，为方便食用可用本发明制备的牛奶多糖为基料，加入适量纯净水润湿、造粒、压片，制成片剂。

附图说明

图1是实施例中DEAE-52离子交换柱层析梯度洗脱曲线；

图2是实施例中ABMP-1 Sephadex G-100凝胶柱层析梯度洗脱曲线；

图3是实施例中ABMP-2 Sephadex G-100凝胶柱层析梯度洗脱曲线；

图4是实施例中ABMP-11,ABMP-12,ABMP-13 Sephadex G-100凝胶柱层析梯度洗脱曲线；

图5是实施例中ABMP-21,ABMP-22 Sephadex G-100凝胶柱层析梯度洗脱曲线；

图6是实施例中ABMP-11紫外光谱；

图7是实施例中ABMP-12紫外光谱；

图8是实施例中ABMP-13紫外光谱；

图9是实施例中ABMP-21紫外光谱；

图10是实施例中ABMP-22紫外光谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明不仅限于以下实施例。

一、发酵奶预处理

    将50ml纯酸奶中加入纯化水100ml，煮沸，冷却至70℃，超声波发生器的水预热在70℃，提取30min,中间每10分钟停顿1次，每次5分钟，真空过滤，滤液再加热至70℃，再提取30min，中间每10分钟停顿1次，每次5分钟，提取时间在4h内完成，真空过滤，反复4次，提取后量取提取液的体积，浓缩提取液。

二、牛奶多糖粗提取

采用氯化钠法分离纯化法：在沸腾情况下，将浓缩液的pH值调至9-10，加入氯化钠使浓度达到5%（W/v），搅拌，煮沸30min，冷却至室温，过滤，得脱蛋白多糖液。

三、牛奶粗多糖的分离纯化

   （1） DEAE-52离子交换柱层析分离牛奶多糖

     分析天平称取25g DEAE-52，常温下用蒸馏水浸泡2d，然后用0.5mol/L盐酸溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡3h，再用蒸馏水洗至中性。 将处理好的DEAE-52装填到离子交换柱内，新装好的柱子需要进行平衡处理，通常用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡，流速控制在0.5mL/min，当流出液的pH与平衡缓冲液pH一致时，层析柱达到平衡。 用吸管吸取离子交换柱内过多的平衡缓冲液至页面1cm高度，将经过脱蛋白处理的牛奶多糖配置成1%的多糖溶液，将样品用滴管缓慢的加到事先用Tris-HCl平衡过的柱子内，这时打开柱子出液口止水阀，使样品渗到层析介质内。

当样品凹液面接近柱床表面时用滴管缓慢滴加一定高度的蒸馏水，防止在洗脱的时候直接滴加洗脱液破坏柱床表面，然后依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl各100mL进行梯度洗脱，流速控制在0.5mL/min，每管收集5mL，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，最后根据梯度洗脱曲线收集合并洗脱峰管。

（2） Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化牛奶多糖

称取3g Sephadex G-100，常温下用蒸馏水浸泡2-3d。平衡液用0.2mol/L NaCl，用吸管吸取1-2mL收集的洗脱峰，加到平衡好的凝胶过滤层柱内，此时用400mL、0.2mol/L的NaCl进行洗脱，流速控制在0.5mL/min，每管收集5mL，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，最后根据梯度洗脱曲线收集合并洗脱峰管。

三、通过紫外光谱纯度鉴定牛奶多糖

    用分光光度计检测纯化出来的牛奶多糖在190-400nm范围内是否存在核酸、蛋白质吸收峰。测定牛奶多糖中是否含有核酸和蛋白质。

四、蒽酮-硫酸法测定牛奶多糖的含量

   （1） 黏度的测定

    量取100 mL 蒸馏水水于搅拌杯中，置于搅拌器上，开启搅拌。精确称取10.0 g 经105 ℃干燥2.5 h 的样品，缓慢加入到搅拌杯中，于800 r/min 下搅拌至完全溶解，静置1 h。 用10mL吸管吸取10mL样品溶液，注入黏度计中，将黏度计垂直放入25℃±0.1℃保温箱中，保温20min，用吸耳球将黏度计中液体吸至双球间第一刻度线上5mm处，让样品自由流动，待液体下流至第一刻度线时，按下秒表计时，到达第二刻度线时，计时停止，下流时间以s计，计算黏度。

样品黏度w₀按公式：w₀＝C×τ

    w₀——样品黏度，单位为厘斯（mm²/s）；

    C—— 黏度计的常数值，单位为厘斯每秒（mm²/s）；

    τ——流动时间，单位为秒（s）；

    实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的2%。

（2） pH的测定

    量取270mL水于搅拌杯中，置于搅拌器上，开启搅拌。精确称量30.0g试样，缓慢加入到搅拌杯中，于800r/min 下搅拌30 min。在25℃±1℃条件下用酸度计测溶液的pH（精确至0.01 pH 值单位）。实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的2%。

（3） 蒽酮-硫酸法测定牛奶多糖的含量

用葡萄糖标准溶液精确绘制标准曲线，准确量取0.1ml的滤液，用蒸馏水定容至2.0ml，加入0.2%的蒽酮-硫酸试剂4.0ml，摇匀后沸水浴10min，冷却至室温，用分光光度计测定620nm处的吸光值，根据标准曲线，计算出相应浓度。

此法所得牛奶多糖为固态粉末，呈淡白色或者淡黄色，平均提取率为96.70％，浓度为25.68 mg/g，黏度为110mm²/s，PH值为7.0，没有核酸和蛋白质特征吸收峰。

Claims (5)

1.一种牛奶多糖，其特征在于：所述牛奶多糖是从发酵奶中提取，并分离纯化制得的；具体由如下制备方法制得：

（1）发酵奶预处理

采用超声波提取法对发酵奶进行预处理，真空过滤、浓缩得提取液；

 （2）牛奶多糖粗提取

采用氯化钠法分离纯化：在沸腾情况下，将（1）中所得提取液调节pH，加入氯化钠，搅拌，煮沸，冷却至室温，过滤，得脱蛋白多糖液；

（3）牛奶多糖的纯化

将（2）中经过脱蛋白与脱色处理的牛奶多糖配置成1%的多糖溶液，经DEAE-52纤维素柱层析，然后用NaCl进行洗脱，控制流速，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，再根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰管，接着经Sephadex G-100凝胶柱层析，然后用NaCl进行洗脱，控制流速，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，最后根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰管；    

（4）紫外光谱鉴定牛奶多糖纯度

    用分光光度计检测纯化出来的牛奶多糖在190-400nm范围内是否存在核酸、蛋白质吸收峰；测定牛奶多糖中是否含有核酸和蛋白质；

（5）蒽酮-硫酸法测定牛奶多糖的含量，即得。

2.如权利要求1所述的牛奶多糖，其特征在于：所述步骤（1）中pH值调至9-10，加入氯化钠使浓度达到5%W/v，搅拌，煮沸30min。

3.如权利要求1或2所述的牛奶多糖，其特征在于：所述牛奶多糖经离心分离得到沉淀物，真空干燥，呈固态浅棕色粉末状。

4.如权利要求3所述的牛奶多糖，其特征在于：所述的牛奶多糖为片剂。

5.一种如权利要求1所述牛奶多糖的制备方法，其特征在于：所述牛奶多糖是从发酵奶中提取，并分离纯化制得的；包括如下工艺步骤：

（1）发酵奶预处理

采用超声波提取法对发酵奶进行预处理，真空过滤、浓缩得提取液；

 （2）牛奶多糖粗提取

采用氯化钠法分离纯化：在沸腾情况下，将（1）中所得提取液调节pH，加入氯化钠，搅拌，煮沸，冷却至室温，过滤，得脱蛋白多糖液；

（3）牛奶多糖的纯化

将（2）中经过脱蛋白与脱色处理的牛奶多糖配置成1%的多糖溶液，经DEAE-52纤维素柱层析，然后用NaCl进行洗脱，控制流速，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，再根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰管，接着经Sephadex G-100凝胶柱层析，然后用NaCl进行洗脱，控制流速，用蒽酮-硫酸法进行追踪测定，最后根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰管；    

（4）紫外光谱鉴定牛奶多糖纯度

    用分光光度计检测纯化出来的牛奶多糖在190-400nm范围内是否存在核酸、蛋白质吸收峰；测定牛奶多糖中是否含有核酸和蛋白质；

（5）蒽酮-硫酸法测定牛奶多糖的含量，即得。