CN101748082A - 乳杆菌发酵剂及其制备方法与专用菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳杆菌发酵剂及其制备方法与专用菌株。本发明的乳杆菌，其保藏编号为CCTCC M208151。本发明的乳杆菌发酵剂，其活性成分为所述的乳杆菌。本发明还公开了制备所述乳杆菌发酵剂的方法，包括如下步骤：1)植物乳杆菌SC79 CCTCC M208151在SC79优化培养基中发酵培养；2)收集步骤1)的菌体，然后向所述菌体中加入保护剂，获得所述发酵剂。本发明的乳杆菌发酵剂用量小、将该乳杆菌发酵剂和不产胞外多糖的酸奶菌株混合制备酸奶，产酸速度快，相对粘度、弹性、稠度、黏附性均优于常规酸乳，并且形成的粘性酸乳胶体脱水收缩作用敏感性小，持水力大于常规酸乳，不易析出乳清。
Description
技术领域
本发明涉及乳杆菌发酵剂及其制备方法与专用菌株。
背景技术
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是对人类健康有益的GRAS(美国FDA评价食品添加剂的安全性指标generally recognized as safe)的微生物。有些乳酸菌能分泌胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)，这些胞外多糖以荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)黏附于菌体表面或以粘质多糖(ropypolysaccharide)形式分泌到细胞外环境中。不同种类乳酸菌所产的胞外多糖也不同，其结构变化多样，生物活性也有所不同。乳酸菌胞外多糖能够保护菌体细胞抵抗干燥、噬菌体和抗菌素侵袭、抵御抗生素或有毒物质的伤害，帮助细菌黏附到固体表面以及参与细胞间的相互作用等。
产胞外多糖的乳酸菌及其产生的胞外多糖广泛应用于酸奶、低脂奶酪、餐后甜点等发酵乳制品的生产中，胞外多糖是天然的增稠剂和质地改良剂，可以增强发酵乳制品的流变学特性，同时胞外多糖也是一种物理稳定剂，能够结合水并限制物料脱水收缩，减少乳清析出，赋予产品吸引人的外观和令人满意的口感。此外，某些乳酸菌产生的胞外多糖具有降低胆固醇、免疫调节和抗癌活性，对人体起到保健作用。多年来欧洲的各公司研究了很多乳酸菌胞外多糖的特性，生产出一系列具有特殊性能的发酵产品。乳品制造者还利用含有胞外多糖的发酵剂来控制酸奶的脱水收缩，尤其在很多禁止添加动物或植物来源稳定剂的国家，乳酸菌胞外多糖普遍应用于酸奶中。此外，产胞外多糖乳酸菌还用于低脂乳制品中，从而减少了消费者对脂肪的摄入。
我国天然发酵制品种类繁多，各地区都有其独特的发酵食品，但是对这些资源的开发利用比较有限，因此从这些资源中分离筛选产胞外多糖的乳酸菌制备发酵剂用于发酵乳制品的生产中具有现实意义，有助于解决发酵乳生产过程中遇到的实际问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳杆菌发酵剂及其制备方法与专用菌株。
本发明所提供的乳杆菌，命名为植物乳杆菌SC79，其保藏编号为CCTCC M 208151，是从东北自然发酵白菜-酸菜中分离的。
所述植物乳杆菌SC79(lactobacillus plantarum)已于2008年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏号为CCTCCNO.M 208151。
所述植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151可产生乳酸菌胞外多糖。
本发明的另一个目的是提供一种乳杆菌发酵剂。
本发明所提供的乳杆菌发酵剂，其活性成分为植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151。
其中，所述发酵剂中含植物乳杆菌SC79 CCTCC M 2081511.3×1011-2.1×1011cfu/g。
所述发酵剂中还包括如下至少一种物质：脱脂乳粉、甘油、脯氨酸、海藻糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇。所述发酵剂中可包括脱脂乳粉、甘露醇、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖；所述发酵剂中，所述脱脂乳粉的含量为8.0-9.0g/100g，所述葡萄糖的含量为0.8-1.2g/100g，所述海藻糖的含量为0.8-1.0g/100g，所述甘露醇的含量为0.8-1.0g/100g，所述麦芽糖的含量为1.6-2.0g/100g。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述发酵剂的方法。
本发明所提供的制备所述发酵剂的方法，包括如下步骤：
1)植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151在SC79优化培养基中发酵培养；
2)收集步骤1)的菌体，然后向所述菌体中加入保护剂，获得所述发酵剂；
所述每升SC79优化培养基包括如下物质：乳清780-800mL，葡萄糖20-25g，大豆蛋白胨10-12g，酵母膏10-12g，乙酸钠5-6g，半胱氨酸盐酸盐0.5-0.7g，吐温801.0-1.5mL，盐溶液(0.4g/L MgSO4·7H2O，0.15g/L MnSO4·4H2O，0.18g/LFeSO4·7H2O，0.05g/L NaCl)1.0-1.5mL，150-160mL胡萝卜汁、50-60mL平菇汁、0.005-0.006mol氯化钙、2.5-3.0g干酪素；
所述保护剂选自如下至少一种：脱脂乳粉、甘油、脯氨酸、海藻糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇。
其中，所述保护剂具体为脱脂乳粉、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和麦芽糖的混合物；
每100g所述菌体中可加入45-50g所述脱脂乳粉、5.0-6.0g所述葡萄糖、5.0-5.5g所述海藻糖和5.0-6.0g所述甘露醇、11.0-13.0g所述麦芽糖。
所述步骤1)的发酵培养过程中，可向所述SC79优化培养基中添加0.1MNa2HPO4-KH2PO4缓冲盐溶液，同时用20g/100mL NaOH溶液或NH3·H2O调节发酵液的pH值在5.8-6.0。所述步骤1)的发酵培养过程中，在发酵10h、13h、15h时，每升发酵液分别添加20g葡萄糖、13.3g大豆蛋白胨和13.3g酵母粉的混合物。
本发明的植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151胞外多糖的产量高。本发明的植物乳杆菌发酵剂以植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151为活性成分，植物乳杆菌SC79CCTCC M 208151活菌含量高。本发明的乳杆菌发酵剂用量小、将该乳杆菌发酵剂和不产胞外多糖的酸奶菌株混合制备酸奶，产酸速度快，相对粘度、弹性、稠度、黏附性均优于常规酸乳，并且形成的粘性酸乳胶体脱水收缩作用敏感性小，持水力大于常规酸乳，不易析出乳清。用本发明的乳杆菌发酵剂和不产胞外多糖的酸奶菌株混合制备酸奶，能够提高酸奶的黏度，赋予产品吸引人的外观和令人满意的口感。
附图说明
图1为SC79全细胞脂肪酸组分图谱。
具体实施方式
下述实施例中的实验结果均为3次重复实验的平均值。
实施例1、分离植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151
分离培养基(MRS培养基)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、KH2PO42g/L、无水乙酸钠5g/L、柠檬酸钠5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO4·4H2O0.05g/L、吐温801mL、琼脂15g/L、葡萄糖20g/L，pH 6.6，121℃灭菌15min取1mL酸菜汁接入11g/100mL脱脂乳中，37℃培养，凝乳后取样逐级稀释，选3个稀释度，每个稀释度取0.1mL涂布于MRS琼脂平板上，37℃培养48h，选取合适的平板，挑取其上的典型菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，革兰氏染色阳性，显微镜下观察为杆状，过氧化氢酶试验阳性的菌株初步鉴定为乳杆菌，继续划线培养分离纯化，直至得到纯菌。
用苯酚硫酸法测定多株纯培养菌种胞外多糖的产量，筛选出一株胞外多糖产量较高的乳杆菌SC79，负染法观察乳杆菌SC79，此菌株同时产生荚膜多糖。
对乳杆菌SC79进行以下三方面的检测：①形态特征与生理生化特性的检测；②全细胞脂肪酸组分的测定；③16S rRNA基因测序。
形态特征与生理生化特性的检测如表1所示。
表1.乳杆菌SC79形态特征与生理生化特性
全细胞脂肪酸组分的测定结果如图1所示。
16S rRNA基因测序结果表明，乳杆菌SC79的16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
形态特征与生理生化特性、全细胞脂肪酸组分、16S rRNA基因的结果表明乳杆菌SC79为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
植物乳杆菌SC79已于2008年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉大学)，保藏号为CCTCC NO.M 208151。
植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151在MRS液体培养基中37℃培养32h，测定培养过程中胞外多糖产量和荚膜多糖产量。
胞外多糖和荚膜多糖产量测定结果表明，植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151的胞外多糖和荚膜多糖产量分别达到175mg/L和42mg/L。
实施例2、乳杆菌发酵剂
一、乳杆菌发酵剂的生产工艺的优化
a、优化培养基
本发明选用营养丰富、易于细胞分离的乳清培养基作为基础培养基，在基础乳清培养基中，植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151于37℃培养16h后的活菌数为6.2×109cfu/mL。
I碳源的优化
在基础培养基中分别以麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇代替葡萄糖，培养16h后，检测发酵液的OD600、活菌数。
检测结果表明，在基础培养基中添加葡萄糖(2g/100mL)植物乳杆菌SC79 CCTCCM 208151活菌数最高。
综上实验结果，以2g/100mL葡萄糖作为植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151生长的最佳碳源。
II氮源的优化
分别用1g/100mL的蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、0.5g/100mL柠檬酸铵、磷酸二氢铵代替添加2g/100mL葡萄糖的基础培养基中的氮源，培养16h后，检测发酵液的OD值、活菌数。
检测结果表明大豆蛋白胨、酵母粉和牛肉膏对植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151的促生长作用较好。
将大豆蛋白胨、酵母粉和牛肉膏分别按1g/100mL、1.5g/100mL、2g/100mL、2.5g/100mL、3g/100mL的浓度添加到含2g/100mL葡萄糖的基础培养基，培养16h后，检测发酵液的OD值、pH值。
检测结果表明2g/100mL和2.5g/100mL的大豆蛋白胨、酵母粉或牛肉膏对植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151都有一定的促生长作用。
为检测复合氮源对植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151的影响，大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏多种配比混合后添加到含2g/100mL葡萄糖的基础培养基，培养16h后，检测发酵液的OD值、活菌数。
检测结果表明大豆蛋白胨∶酵母粉＝1∶1添加，对植物乳杆菌SC79 CCTCC M208151的促生长作用的效果最好。
综上实验结果，选择1g/100mL大豆蛋白胨和1g/100mL酵母粉作为植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151生长的最佳氮源。
III促生长因子的选择
各种蔬菜汁的制备方法：
胡萝卜汁：取新鲜的胡萝卜清洗、去皮、切丁，按100g胡萝卜与100mL蒸馏水的比例，用果汁机打碎，80目滤布滤除果渣，95℃煮沸10min后，10000r/min，4℃，离心10min，将上清115℃流通蒸汽灭菌15min，4℃备用。
西红柿汁：取新鲜的西红柿清洗、切丁，用果汁机打碎，80目滤布滤除果渣，95℃煮沸10min后，10000r/min，4℃，离心10min，将上清115℃流通蒸汽灭菌15min，4℃备用。
平菇汁：取新鲜的平菇清洗，切丁，按100g平菇与100mL蒸馏水的比例，用果汁机打碎，80目滤布除渣，95℃煮沸10min后，10000r/min，4℃，离心10min，将上清115℃流通蒸汽灭菌15min，4℃备用。
香菇汁：取新鲜的香菇清洗，切丁，按100g香菇与100mL蒸馏水的比例，用果汁机打碎，80目滤布除渣，95℃煮沸10min后，10000r/min，4℃，离心10min，将上清115℃流通蒸汽灭菌15min，4℃备用。
黄豆芽汁：取新鲜的黄豆芽清洗，用果汁机打碎，80目滤布除渣，95℃煮沸10min后，10000r/min，4℃，离心10min，将上清115℃流通蒸汽灭菌15min，4℃备用。
啤酒：哈尔滨啤酒，95℃煮沸15-20min后，115℃流通蒸汽灭菌15min，4℃备用。
将胡萝卜汁、西红柿汁、平菇汁、香菇汁、啤酒、氯化钙、半胱氨酸盐酸盐、干酪素、乳清粉、黄豆芽汁等分别添加到基础培养基(含有2g/100mL葡萄糖、1g/100mL大豆蛋白胨和1g/100mL酵母粉)中，培养16h后检测发酵液的OD值、活菌数。
检测结果表明，胡萝卜汁、香菇汁、西红柿汁、氯化钙、半胱氨酸盐酸盐、干酪素对植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151的促生长效果较好。将优选的生长因子按不同量添加进行试验，结果表明添加15mL/100mL胡萝卜汁、5mL/100mL平菇汁、0.005mol氯化钙、0.25g/100mL干酪素时，对植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151的促生长作用效果最好。
综上所述，每升SC79优化培养基为包含：乳清780-800mL，葡萄糖20-25g，大豆蛋白胨10-12g，酵母膏10-12g，乙酸钠5-6g，半胱氨酸盐酸盐0.5-0.7g，吐温801.0-1.5mL，盐溶液(0.4g/L MgSO4·7H2O，0.15g/L MnSO4·4H2O，0.18g/L FeSO4·7H2O，0.05g/L NaCl)1.0-1.5mL，150-160mL胡萝卜汁、50-60mL平菇汁、0.005-0.006mol氯化钙、2.5-3.0g干酪素。
b、优化培养条件
选择培养温度30℃、34℃、37℃、40℃、43℃，培养基初始pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，摇床转数80r/min、180r/min等不同的培养条件进行单因素试验，实验结果表明植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151的最佳培养条件为培养温度37℃、培养基初始pH为6.5、80r/min摇床培养。
c、菌体的富集
分别用0.2M NaAC-HAC、0.2M Na2HPO4-NaH2PO4、0.2M K2HPO4-KH2PO4、0.2MNa2HPO4-KH2PO4、0.1M K2HPO4-KH2PO4和10g/100mL柠檬酸铵-5g/100mL乙酸钠-2g/100mL丙酮酸钠对植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151进行富集培养，测定富集培养发酵液的OD值和活菌数。
测定结果表明，植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151在SC79优化培养基中培养，并向培养基中添加0.2M Na2HPO4-KH2PO4缓冲盐溶液对植物乳杆菌SC79 CCTCC M208151的促生长作用效果最佳，活菌数达到5.6×1011cfu/mL。
植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151在SC79优化培养基中培养，并向培养基中添加0.2M Na2HPO4-KH2PO4缓冲盐溶液，然后分别用20g/100mL NaOH溶液、20g/100mLKOH溶液、饱和Ca(OH)2溶液、NH3·H2O和20g/100mL Na2CO3溶液作为中和剂，调节发酵液的pH维持在5.9-6.1左右，测定发酵液的OD值、pH值及活菌数。
测定结果表明以NH3·H2O作为中和剂效果最佳，活菌数为5.5×1011cfu/mL。
植物乳杆菌SC79 CCTCC M 208151在SC79优化培养基中培养，并向培养基中添加0.2M Na2HPO4-KH2PO4缓冲盐溶液，然后用NH3·H2O作为中和剂，调节发酵液的pH维持在5.8-6.0左右，在不同的时间段补加氮源和碳源，测定不同条件下发酵液的OD值及活菌数。
测定结果表明在培养10h、13h、15h分别添加葡萄糖(2g/100mL)、大豆蛋白胨(1.33g/100mL)和酵母粉(1.33g/100mL)的混合物，培养16h后活菌数最高，达到8.0×1011cfu/mL。
d、真空冷冻干燥制备发酵剂
1.真空冷冻干燥条件的选择
用真空冷冻干燥机(Labconco FreeZone 6)进行真空冷冻干燥，下述真空冷冻干燥的基本参数均为：-80～-70℃预冻1-1.5h，冷阱温度为-45～-50℃，真空度为0.03-0.05mbar，真空冷冻干燥时间为18-24h。
通过测定冻干发酵剂粉中的活菌数对制备过程中脱脂乳浓度(8g/100mL、11g/100mL、15g/100mL)，离心条件(6000r/min、7000r/min、8000r/min、9000r/min)，菌体与脱脂乳的混匀时间(0min、10min、20min)进行真空冷冻干燥条件的筛选。
结果表明加入脱脂乳的浓度(11g/100mL)、8000r/min离心、加完脱脂乳直接预冻可提高冻干发酵剂粉中的活菌数。
2.保护剂的筛选
将下述保护剂分别添加到乳杆菌SC79 CCTCC M 208151发酵液中进行真空冷冻干燥：脱脂乳粉、环状糊精、甘露醇、山梨醇、维生素C、半胱氨酸盐酸盐、半乳糖、脯氨酸、蔗糖、海藻糖、果糖、麦芽糖、谷氨酸钠、葡萄糖和甘油，测定添加不同保护剂的发酵剂粉中活菌数。
测定结果表明，脱脂乳粉、甘油、脯氨酸、海藻糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇对乳杆菌SC79 CCTCC M 208151有一定的保护作用。
将脱脂乳粉、甘露醇、半胱氨酸盐酸盐、海藻糖、果糖、谷氨酸钠、葡萄糖、甘油按不同的配比添加到乳杆菌SC79 CCTCC M 208151中进行真空冷冻干燥，测定添加不同配比的保护剂的发酵剂粉中活菌数。
测定结果表明，每100g菌体中加入45-50g脱脂乳粉、5.0-6.0g葡萄糖、5.0-5.5g海藻糖和5.0-6.0g甘露醇、11.0-13.0g麦芽糖的混合作为乳杆菌SC79CCTCC M 208151的保护剂，发酵剂菌粉的活菌数为1.45×1011cfu/g。
二、制备乳杆菌发酵剂
a)乳杆菌发酵剂1
将活化的SC79 CCTCC M 208151按重量比3％接种到增菌改良培养基中进行发酵培养，37℃培养16h；发酵完毕后，将发酵液在4℃条件下，8000r/min离心10min，向菌体中添加脱脂乳粉、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和麦芽糖的混合物作为保护剂，每100g菌体中加入45g脱脂乳粉、5.0g葡萄糖、5.0g海藻糖和5.0g甘露醇、11.0g麦芽糖，然后在-70℃温度下预冷冻60min，真空度为0.03mbar，冷阱温度为-45℃的条件下进行真空冷冻干燥处理，真空包装制成含活菌数为1.3×1011cfu/g乳杆菌发酵剂1。乳杆菌发酵剂1中脱脂乳粉的含量为8.0g/100g，葡萄糖的含量为0.8g/100g，海藻糖的含量为0.8g/100g，甘露醇的含量为0.8g/100g，麦芽糖的含量为1.6g/100g。
每升SC79优化培养基由如下物质组成：乳清800mL，葡萄糖20g，大豆蛋白胨10g，酵母膏10g，乙酸钠5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，吐温801.0mL，盐溶液(0.4g/L MgSO4·7H2O，0.15g/L MnSO4·4H2O，0.18g/L FeSO4·7H2O，0.05g/L NaCl)1.0mL，150mL胡萝卜汁、50mL平菇汁、0.005mol氯化钙、2.5g干酪素。
将新鲜的无抗牛奶，均质，向其中添加蔗糖(6g/100mL)，杀菌后将乳杆菌发酵剂1按0.015g/100g添加到牛奶中，37℃培养6h后，无菌添加0.015g/100g嗜热链球菌发酵剂(法国罗地亚公司)，42℃发酵3h，凝乳的pH降到4.4，取出4℃后酸化24h，检测pH、黏度、持水性、硬度、凝聚性等各项指标。
pH、黏度、持水性、硬度、凝聚性各项指标的测定方法：
pH：采用PB-10酸度计(Sartorius)直接测定。
黏度：采用DV-III Ultra型粘度计(Brookfield公司)在25℃进行测定，采用LV3转子，转速100r/min，作用时间1min。
持水性：取重量W为10g发酵乳于离心管中，6000r/min，4℃，10min，称量上清液的重量W1，持水性＝(W-W1)/W×100％。
硬度、凝聚性：采用TA.XT.Plus质构分析仪(Stable Micro System公司)在25℃进行测定，采用A/BE探头(35mm)。
测定结果表明，酸奶的pH为4.42，黏度为975厘泊，持水性为56.5％，硬度为228.2g，凝聚性为68.5g。
b)乳杆菌发酵剂2
将活化的SC79 CCTCC M 208151按重量比为3％的比例接种到SC79优化培养基中进行发酵培养，并向培养基中按照5mL/100mL添加为0.1M Na2HPO4-KH2PO4缓冲盐溶液，37℃条件下进行发酵培养，培养过程中流加20g/100mL NaOH调节发酵液的pH值在5.5，培养14h，得到高浓度菌液。发酵完毕后，将发酵液在4℃条件下，8000r/min离心10min，向菌体中添加脱脂乳粉、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和麦芽糖的混合物作为保护剂，每100g菌体中加入45g脱脂乳粉、5.0g葡萄糖、5.0g海藻糖和5.0g甘露醇、11.0g麦芽糖，然后在-70℃温度下预冷冻60min，真空度为0.03mbar，冷阱温度为-45℃的条件下进行真空冷冻干燥处理，真空包装制成含活菌数为1.5×1011cfu/g乳杆菌发酵剂2，乳杆菌发酵剂2中脱脂乳粉的含量为8.0g/100g，葡萄糖的含量为0.8g/100g，海藻糖的含量为0.8g/100g，甘露醇的含量为0.8g/100g，麦芽糖的含量为1.6g/100g。
每升SC79优化培养基由如下物质组成：乳清780mL，葡萄糖25g，大豆蛋白胨12g，酵母膏12g，乙酸钠6g，半胱氨酸盐酸盐0.7g，吐温801.5mL，盐溶液(0.4g/L MgSO4·7H2O，0.15g/L MnSO4·4H2O，0.18g/L FeSO4·7H2O，0.05g/L NaCl)1.5mL，160mL胡萝卜汁、60mL平菇汁、0.006mol氯化钙、3.0g干酪素。
新鲜的无抗牛奶，均质，然后向其中添加蔗糖(6g/100mL)，杀菌后将乳杆菌发酵剂2按0.0075g/100g添加到牛奶中，37℃培养6h后，无菌添加0.015g/100g嗜热链球菌发酵剂(法国罗地亚公司)和0.0075g/100g保加利亚乳杆菌发酵剂(法国罗地亚公司)，42℃发酵4h，凝乳的pH降到4.5，取出于8℃后酸化24h，检测pH、黏度、持水性、硬度、凝聚性等各项指标。
pH、黏度、持水性、硬度、凝聚性各项指标的测定方法同步骤a)。
测定结果表明，酸奶的pH为4.45，黏度为985厘泊，持水性为59.5％，硬度为218.1g，凝聚性为66.8g。
c)乳杆菌发酵剂3
将活化的SC79 CCTCC M 208151按重量比为3％的比例接种到SC79优化培养基中进行发酵培养，并向培养基中按照5mL/100mL添加为0.1M Na2HPO4-KH2PO4缓冲盐溶液，37℃条件下进行发酵培养，培养过程中流加NH3·H2O调节发酵液的pH值为5.5，培养10h和13h分别添加葡萄糖(2g/100mL)、大豆蛋白胨(1.33g/100mL)和酵母粉(1.33g/100mL)的混合物，培养18h后，得到高浓度菌液。发酵完毕后，将发酵液在4℃条件下，8000r/min离心10min，向菌体中添加脱脂乳粉、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和麦芽糖的混合物作为保护剂，每100g菌体中加入50g脱脂乳粉、6.0g葡萄糖、5.5g海藻糖和6.0g甘露醇、13.0g麦芽糖，然后在-70℃温度下预冷冻60min，真空度为0.03mbar，冷阱温度为-45℃的条件下进行真空冷冻干燥处理，真空包装制成含活菌数为1.8×1011cfu/g乳杆菌发酵剂3，乳杆菌发酵剂3中脱脂乳粉的含量为9.0g/100g，葡萄糖的含量为1.2g/100g，海藻糖的含量为1.0g/100g，甘露醇的含量为1.0g/100g，麦芽糖的含量为2.0g/100g。
每升SC79优化培养基由如下物质组成：乳清800mL，葡萄糖20g，大豆蛋白胨10g，酵母膏10g，乙酸钠5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，吐温801.0mL，盐溶液(0.4g/L MgSO4·7H2O，0.15g/L MnSO4·4H2O，0.18g/L FeSO4·7H2O，0.05g/L NaCl)1.0mL，150mL胡萝卜汁、50mL平菇汁、0.005mol氯化钙、2.5g干酪素。
将新鲜的无抗牛奶，均质，向其中添加蔗糖(6g/100mL)，杀菌后，将乳杆菌发酵剂3和嗜热链球菌发酵剂(法国罗地亚公司)分别按0.015g/100g的比例添加到牛奶中，25℃培养40min，28℃培养50min，31℃培养1h，34℃培养1.5h，37℃培养2h，42℃培养4h，凝乳的pH降到4.5，取出8℃后酸化24h，检测pH、黏度、持水性、硬度、凝聚性等各项指标。
pH、黏度、持水性、硬度、凝聚性各项指标的测定方法同步骤a)。
测定结果表明，酸奶的pH为4.50，黏度为1032厘泊，持水性为60.0％，硬度为272.3g，凝聚性为72.1g。
d)乳杆菌发酵剂4
将活化的SC79 CCTCC M 208151按重量比为3％的比例接种到SC79优化培养基中进行发酵培养，并向培养基中按照5mL/100mL添加为0.1M Na2HPO4-KH2PO4缓冲盐溶液，37℃条件下进行发酵培养，培养过程中流加NH3·H2O调节发酵液的pH值在5.5，培养10h和13h分别添加葡萄糖(2g/100mL)、大豆蛋白胨(1.33g/100mL)和酵母粉(1.33g/100mL)的混合物，培养18h后，得到高浓度菌液。发酵完毕后，将发酵液在4℃条件下，8000r/min离心10min，向菌体中添加脱脂乳粉、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和麦芽糖的混合物作为保护剂，每100g菌体中加入50g脱脂乳粉、6.0g葡萄糖、5.5g海藻糖和6.0g甘露醇、13.0g麦芽糖，然后在-70℃温度下预冷冻60min，真空度为0.03mbar，冷阱温度为-45℃的条件下进行真空冷冻干燥处理，真空包装制成含活菌数为2.1×1011cfu/g乳杆菌发酵剂4，乳杆菌发酵剂4中脱脂乳粉的含量为9.0g/100g，葡萄糖的含量为1.2g/100g，海藻糖的含量为1.0g/100g，甘露醇的含量为1.0g/100g，麦芽糖的含量为2.0g/100g。
每升SC79优化培养基由如下物质组成：乳清780mL，葡萄糖25g，大豆蛋白胨12g，酵母膏12g，乙酸钠6g，半胱氨酸盐酸盐0.7g，吐温801.5mL，盐溶液(0.4g/L MgSO4·7H2O，0.15g/L MnSO4·4H2O，0.18g/L FeSO4·7H2O，0.05g/L NaCl)1.5mL，160mL胡萝卜汁、60mL平菇汁、0.006mol氯化钙、3.0g干酪素。
将新鲜的无抗牛奶，均质，向其中添加蔗糖(6g/100mL)，杀菌后，将乳杆菌发酵剂4、嗜热链球菌发酵剂(法国罗地亚公司)和保加利亚乳杆菌发酵剂(法国罗地亚公司)分别按0.0075g/100g、0.015g/100g和0.0075g/100g的比例添加到牛奶中，25℃培养40min，28℃培养50min，31℃培养1h，34℃培养1.5h，37℃培养2h，42℃培养4h，凝乳的pH降到4.5，取出8℃后酸化24h，检测pH、黏度、持水性、硬度、凝聚性等各项指标。
pH、黏度、持水性、硬度、凝聚性各项指标的测定方法同步骤a)。
测定结果表明，酸奶的pH为4.43，黏度为1052厘泊，持水性为60.5％，硬度为278.5g，凝聚性为72.6g。
序列表
<110>吉林省农业科学院
<120>乳杆菌发酵剂及其制备方法与专用菌株
<130>CGGNARW81995
<160>1
<210>1
<211>1445
<212>DNA
<213>植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400>1
atacatgcaa gtcgaacgaa ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga tttacatttg 60
agtgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg gggataacac 120
ctggaaacag atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag tttgaaagat 180
ggcttcggct atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt ggggtaacgg 240
ctcaccatgg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag 300
acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc 360
tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa 420
gaagaacata tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag aaagccacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg 540
ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gctcaaccga 600
agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagata tatgggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct 720
gtaactgacg ctgaggctcg aaagtatggg tagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780
cataccgtaa acgatgaatg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt gctgcagcta 840
acgcattaag cattccgcct ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac 900
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agctacgcga agaaccttac 960
caggtcttga catactatgc aaatctaaga gattagacgt tcccttcggg gacatggata 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat taagttgggc actctggtga gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgaactc gcgagagtaa gctaatctct 1260
taaagccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagt cggaatcgct 1320
agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccatg agagtttgta acacccaaag tcggtggggt aaccttttag gaaccagccg 1440
cctaa 1445
Claims (10)
1.一种乳杆菌，其保藏编号为CCTCC M 208151。
2.一种生产乳酸菌胞外多糖的方法，是发酵权利要求1所述的乳杆菌生产乳酸菌胞外多糖。
3.一种乳杆菌发酵剂，其活性成分为权利要求1所述的乳杆菌。
4.根据权利要求3所述的乳杆菌发酵剂，其特征在于：所述发酵剂中含权利要求1所述的乳杆菌1.3×1011-2.1×1011cfu/g。
5.根据权利要求3或4所述的乳杆菌发酵剂，其特征在于：所述发酵剂中还包括如下至少一种物质：脱脂乳粉、甘油、脯氨酸、海藻糖、麦芽糖、葡萄糖和甘露醇；所述发酵剂中优选包括脱脂乳粉、甘露醇、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖；所述发酵剂中，所述脱脂乳粉的含量为8.0-9.0g/100g，所述葡萄糖的含量为0.8-1.2g/100g，所述海藻糖的含量为0.8-1.0g/100g，所述甘露醇的含量为0.8-1.0g/100g，所述麦芽糖的含量为1.6-2.0g/100g。
6.制备权利要求3至5中任一所述乳杆菌发酵剂的方法，包括如下步骤：
1)植物乳杆菌SC79CCTCC M 208151在SC79优化培养基中发酵培养；
2)收集步骤1)的菌体，然后向所述菌体中加入保护剂，获得所述发酵剂；
所述每升SC79优化培养基包括如下物质：乳清780-800mL，葡萄糖20-25g，大豆蛋白胨10-12g，酵母膏10-12g，乙酸钠5-6g，半胱氨酸盐酸盐0.5-0.7g，吐温801.0-1.5mL，盐溶液(0.4g/L MgSO4·7H2O，0.15g/L MnSO4·4H2O，0.18g/LFeSO4·7H2O，0.05g/L NaCl)1.0-1.5mL，150-160mL胡萝卜汁、50-60mL平菇汁、0.005-0.006mol氯化钙、2.5-3.0g干酪素；
所述保护剂选自如下至少一种：脱脂乳粉、甘油、脯氨酸、海藻糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述保护剂为脱脂乳粉、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和麦芽糖的混合物；每100g所述菌体中加入45-50g所述脱脂乳粉、5.0-6.0g所述葡萄糖、5.0-5.5g所述海藻糖和5.0-6.0g所述甘露醇、11.0-13.0g所述麦芽糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的发酵培养过程中，向所述SC79优化培养基中添加0.1M Na2HPO4-KH2PO4缓冲盐溶液，同时用20g/100mLNaOH溶液或NH3·H2O调节发酵液的pH值为5.8-6.0。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的发酵培养过程中，发酵10h和13h时，每升发酵液添加20g葡萄糖、13.3g大豆蛋白胨和13.3g酵母粉的混合物。
10.权利要求1所述乳杆菌、权利要求3至5中任一所述的乳杆菌发酵剂在生产乳制品中的应用。
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