CN103667063A - 一种mlf乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种MLF乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂，其成分及成分含量为：脱脂乳粉10g、甘油2.5g、谷氨酸钠1.0g、苹果酸钠2.2g、海藻糖1.0g、山梨醇1.0g，水100mL；此外，还揭露了该复合保护剂的制备方法，制备过程简单、易于操作，且复合保护剂溶质均一、形态稳定，解决了保护剂制备中不溶性物质产生及高温灭菌常导致絮状沉淀产生的难题，简化了现有保护剂配制中需过滤除菌与高温灭菌相结合的复杂工序。利用该复合保护剂能够提高乳酸菌冻干发酵剂的细胞存活率及贮藏时间，从而为研发专用于我国南方亚热带特色水果果酒酿制的高活性发酵剂奠定了基础。

Description

一种MLF乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂及其制备方法

【技术领域】

本发明属于乳酸菌制品生产技术领域，尤其涉及一种具有MLF能力的乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂及其制备方法。

【背景技术】

高活性菌株是制备高效发酵剂的基础，传统的乳酸菌发酵剂存在种种弊端而逐渐被遗弃，取而代之的是一次性直投式发酵剂，此种产品以其活力高、体积小、携带方便等特点，大大提高了劳动生产率和产品质量。

本实验室自主选育出的植物乳杆菌R23、植物乳杆菌植物亚种RF17、副干酪乳杆菌副干酪亚种R37为具有高苹果酸乳酸发酵（malolacticfementation MLF）能力的优良乳酸菌，其中：植物乳杆菌R23是指本申请人于2011年09月20日申请的中国发明申请号为201110281566.2、名称为“一株植物乳杆菌R23”中所揭露的“植物乳杆菌R23”，其于2011年08月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏号为CGMCC No.5105；植物乳杆菌植物亚种RF17是指本申请人于2012年10月11日申请的中国发明专利号为201210385606.2、名称为“一种苹果酸乳酸转化高活力菌株”中所揭露的“植物乳杆菌植物亚种RF17”，其于2012年03月16日保藏于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012085；副干酪乳杆菌副干酪亚种R37是指本发明人于2013年01月17日申请的中国发明申请号为201310019848.4、名称为“一株副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株”中所揭露的“副干酪乳杆菌副干酪亚种R37”，其于2012年08月17日保藏于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012311。另外，梁璋成等发表的文章：“MLF植物乳杆菌R23培养基优化”（福建农业学报，2009，24（6）：570-574）、“厌氧对植物乳杆菌R23抗逆性及枇杷酒MLF的影响”（福州大学学报，2010，38（3）:456-460）、及“枇杷酒植物乳杆菌R23苹果酸乳酸发酵动力学研究”（福建农业学报，2010，25（3）：264-268），任香芸等发表的文章：“枇杷酒苹果酸乳酸发酵耐硫优良菌株的筛选”（食品与发酵工业，2010，36（2）：12-16）、“枇杷汁发酵优良乳酸菌的分离与筛选”（中国农学通报(增刊)，2010（8）：204-208），“苹果酸乳酸转化高活力菌株的选育”（中国食品学报，2013，13（8）:55-59），何志刚等发表的文章：“枇杷酒中苹果酸乳酸发酵优良乳酸菌的分离与鉴定”（中国食品学报，2011，11（1）：165-171）、“植物乳杆菌R23在枇杷酒中生长及苹果酸乳酸发酵特性研究”（中国食品学报，2011，11﹙4﹚:36-41），4）林晓姿等发表的文章：“植物乳杆菌R23酵解“早钟六号”枇杷果汁有机酸的动态分析”（中国食品学报，2011，11（3）：100-103）、“枇杷汁乳酸发酵优良菌株筛选及其发酵特性研究”（热带作物学报，2011，32（3）：550-553）、“两株自选乳酸菌的益生特性研究”（北京工商大学学报，2012，30（1）：30-35）、“葡萄全汁乳酸发酵菌株筛选及其风味分析”（食品科学技术学报，2013，31（3）：34-38），这些文章中报道了植物乳杆菌R23、植物乳杆菌植物亚种RF17及副干酪乳杆菌副干酪亚种R37的高产苹果酸乳酸酶能力，具有良好的苹果酸乳酸转化活力，以及高抗逆性和抗氧化等益生性，且可耐受120±2mg/L总二氧化硫、13±1%酒精、pH2.5±0.1酸度、0.5±0.05%胆盐以及较低的温度；各MLF乳酸菌还具备胞外代谢产物抗氧化能力强、对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率较高的特性，非常适用于高苹果酸果酒的生物降酸及果蔬乳酸发酵饮料的制备，已在枇杷、杨梅、刺葡萄等水果的发酵中得到良好应用（参阅上述相关文献）。但上述三株MLF乳酸菌的培养尚处于传统的继代式培养方式，各菌株在斜面上的存活时间较短，需2-3个月转接一次，菌种的活力在不断传代中会逐渐下降，从而导致其发酵效果下降，严重影响了发酵产品的品质和稳定性，因此研制高效乳酸菌直投式发酵剂势在必行。

影响冻干发酵剂菌体存活率的因素有菌体浓度、浓缩条件、保护剂成分、预冻速率、干燥过程、包装形式及保藏温度等。其中冻干保护剂是最为复杂、最难选择的关键因素。因此在冻干乳酸菌时要优选适合于冻干菌种的保护剂，减少冻干时活菌的损失，进而提高直投式发酵剂的发酵活力。不同保护剂对不同菌种的保护效果是不同的，单一的保护剂并不能满足冷冻干燥的要求，所以，冻干保护剂一般都是按一定配方混合使用，因此，选择保护剂的技术是制备高效发酵剂的一项关键技术，关系到发酵剂的发酵效率和用量。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种MLF乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂，该复合保护剂能够提高MLF乳酸菌冻干发酵剂的细胞存活率及贮藏时间。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种MLF乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂的制备方法，该方法操作简便。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之一的：

一种MLF乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂，该复合保护剂的成分及成分含量为：脱脂乳粉10g、甘油2.5g、谷氨酸钠1.0g、苹果酸钠2.2g、海藻糖1.0g、山梨醇1.0g，水100mL。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之二的：

一种MLF乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂的制备方法，其包括如下具体操作：

（1）依据上述复合保护剂所述的成分含量准确称量该复合保护剂的各成分，备用；

（2）先将称量好的谷氨酸钠溶解于盛有100mL水的烧杯中，接着将甘油、苹果酸钠、海藻糖及山梨醇加入，并用玻璃棒搅拌使之彻底溶解；然后放入脱脂乳粉，再加8-10粒玻璃珠，使脱脂乳粉充分混匀，混匀后将玻璃珠分离出并将混合液倒于三角瓶中，加硅胶塞，于105±2℃下湿热灭菌10～15min，冷却至室温即可获得所述复合保护剂。

本发明的有益效果在于：本发明复合保护剂中的苹果酸钠对MLF乳酸菌具有特定的保护作用，利用该复合保护剂能够提高MLF乳酸菌冻干发酵剂的细胞存活率及贮藏时间，从而为研发专用于我国南方亚热带特色水果果酒酿制的高活性发酵剂奠定了基础；此外，该复合保护剂的制备方法易于操作，复合保护剂的溶质均一、形态稳定，解决了现有保护剂制备中不溶性物质产生及高温灭菌常导致絮状沉淀产生的难题，并简化了现有保护剂配制中需过滤除菌与高温灭菌相结合的复杂工序。

【具体实施方式】

为了方便阐述，本发明以下说明过程中，将植物乳杆菌R23、植物乳杆菌植物亚种RF17、副干酪乳杆菌副干酪亚种R37简称为R23、RF17和R37；此外，本发明中所涉及的百分比，在无特殊说明的情况下均为质量百分比。

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1  菌株：R23、RF17和R37。

1.1.2  培养基：

改良TJA培养基：酵母膏0.5%、牛肉膏1%、乳糖2%、葡萄糖0.2%、乙酸钠0.5%、K₂HPO₄0.2%、番茄汁5%(v/v)、吐温-800.1%、琼脂1.5%-2.0%、pH6.8±0.2。

LHR20培养基：酵母膏0.74%、牛肉膏1.0%、蛋白胨0.5%、蔗糖2.0%、柠檬酸铵0.2%、MgSO₄0.036%、MnSO₄0.005%、吐温-800.1%、苹果酸钠35%（5.7%，v/v）、番茄汁15%、平菇浸汁5%、0.2N Na₂HPO₄-0.2N KH₂PO₄缓冲盐稀释4倍，121℃下湿热灭菌20min。

降酸试验培养基：番茄汁10%，酵母膏0.2%，牛肉膏0.4%，MgSO₄0.02%，乙酸钠0.5%，Tween-800.1%，柠檬酸铵0.2%，MnSO₄0.005%，胰蛋白胨1%，苹果酸0.5%，pH4.8±0.2，1×10⁵Pa下灭菌20min。

1.1.3主要试剂及仪器：

SPX-250BS-Ⅱ型生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；GI54DW型高压灭菌器，美国致微；真空冷冻干燥机，德国CHRIST；超低温冷冻储存箱，中科美菱低温科技有限公司；高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2方法

1.2.1菌体浓度测定：活菌计数法

取1mL菌液加入到9mL无菌水中，依次做10倍系列稀释，选取10^-6、10^-7、10^-8三个稀释倍数，每个稀释倍数各吸取0.2mL稀释液注入改良TJA平板中，每个稀释度做三个平板；之后将各平板均置于30℃下恒温培养箱中培养3d，然后选取菌落数在30～300之间的平板计菌落数。

1.2.2菌体存活率的计算方法

将冻干后的菌剂用LHR20培养基还原到冻干前的体积，将LHR20培养基与菌剂混匀后测定其中的活菌数（采用活菌计数法）。

细胞存活率（%）=冻干复水后1mL样液的活菌数（cfu/mL）/冻干前1mL样液的活菌数（cfu/mL）×100%

1.2.3总酸的测定方法

采用NaOH滴定法测定培养液的总酸，参照GB/T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法进行，以醋酸计。

1.2.4复合保护剂成分筛选的均匀试验

以10%脱脂牛乳为溶剂，以甘油、谷氨酸钠、苹果酸钠、海藻糖、乳糖和山梨醇为试验因子，进行U₇（7⁶）均匀试验设计，并测定各处理的细胞存活率，之后利用DPS软件对所得数据进行分析，获得适宜R23的复合保护剂成分。

1.2.5复合保护剂中各成分含量筛选的正交试验

以1.2.4均匀试验得到的复合保护剂成分为试验因素，进行L₁₆（4⁵）正交试验，并测定冻干发酵剂的细胞存活率，之后利用DPS软件对所得数据进行分析，确定R23冻干发酵剂的复合保护剂各成分的适宜含量。

1.2.6复合保护剂的制备

准确称量1.2.5正交试验确定的复合保护剂各成分的含量，备用；将称量好的谷氨酸钠溶解于100mL水中，接着将其它成分放入、混匀；之后于105±2℃下湿热灭菌10～15min，冷却至室温即可获得所述复合保护剂。

1.2.7菌体处理与冻干程序（即冻干发酵剂的制备）

将R23在LHR20培养基中活化15-18h，之后将菌液转移至50mL离心管中，并置于6000r/min、5℃条件下离心10min，离心结束后弃上清液留菌泥；以“复合保护剂：菌泥=3:1”的体积比将菌泥与复合保护剂混合，制成菌悬液，并按“2mL菌悬液/15mL西林瓶”分装入西林瓶中，之后置-40℃下预冻24h，得预冻好的菌剂；用75%酒精擦洗冷真空冻干燥机进行消毒，待开机预冷30min后，立即将预冻好的菌剂放入真空冷冻干燥机中，盖好盖子，立即开始抽真空，进入真空冷冻干燥过程，且冻干条件为：真空度0.2mbar，冷冻温度-50℃，冻干时间24h；在真空状态下将盖子压紧，取出，即获得乳酸菌冻干发酵剂。

1.2.8冻干发酵剂保藏稳定性测试

依据1.2.7冻干发酵剂的制备过程，将R23、RF17和R37分别制成冻干发酵剂，并分别于4-6℃下保存一年，每隔3个月测定各冻干发酵剂的细胞存活率，同时将各冻干发酵剂等量接种于降酸试验培养基中，28℃培养18h后，测定其总酸，计算发酵前后的降酸量，分析各冻干发酵剂在保藏过程中的稳定性。

2结果与分析

2.1均匀试验结果

用均匀设计法考察各成分甘油(X₁)、谷氨酸钠(X₂)、苹果酸钠(X₃)、海藻糖(X₄)、乳糖(X₅)、山梨醇(X₆)对植物乳杆菌R23冻干后细胞存活率的影响，具体因素水平及实验设计见表1和表2。

表1均匀设计U₇（7⁶）因素水平表

表2U₇（7⁶）均匀试验设计及结果

以菌体存活率(Y)为目标值进行二次多项式逐步回归分析，得到回归方程为：

Y=62.4125+4.2479X₃+0.037X₁ ²+0.105X₂*X₄-0.1417X₂*X₅+0.0204X₄*X₆

回归方程系数R=1，其显著水平达P=0.0036，各偏相关检验均达极显著水平，方程检验结果可靠程度高，见表3。

表3均匀设计回归方程检验

由表3可知，R23经冻干后的细胞存活率与苹果酸钠的一次项、甘油的平方项、谷氨酸钠与海藻糖的互作项、山梨醇与海藻糖的互作项呈正相关，与谷氨酸钠及乳糖的互作项呈负相关；预测R23冻干菌体的最大存活率为99.1%，去除呈负相关作用因子，优选后的保护剂组合见表4；且按优选后的保护剂进行R23的冻干验证试验，其菌体冻干存活率可达91.5%。

表4优选后的保护剂组合

不同保护剂对不同菌种的保护效果是不同的，单一的保护剂并不能满足冷冻干燥的要求，所以，冻干保护剂一般都是按一定配方混合使用，常用的冻干保护剂主要由多元醇类、糖类和氨基酸类等复合而成；本申请所得配方符合菌剂成分的组合要求。

2.2正交试验结果

正交试验方案及各保护剂成分的添加量对R23生长的影响结果如表5、表6与表7。且由表5、表6及表7可知，各因子对植物乳杆菌R23细胞存活率的影响均达到极显著水平（α≤0.01），其主次顺序为：甘油＞苹果酸钠＞谷氨酸钠＞山梨醇＞海藻糖，最佳生长条件为A₃B₂C₄D₂E₃，即甘油2.5%，谷氨酸钠1.0%，苹果酸钠2.2%，海藻糖1.0%，山梨醇1.0%。在此条件下细胞存活率达95.3%。

表5L₁₆（4⁵）正交试验因素水平表

表6L₁₆（4⁵）正交试验设计和结果极差分析

表7L₁₆（4⁵）正交试验结果方差分析

2.3冻干发酵剂保藏稳定性测试结果

R23、RF17和R37分别制成的冻干发酵剂的保藏稳定性测试结果如表8所示。

表8冻干发酵剂的保藏稳定性

通过表8可知，R23与R37的细胞存活率在0-12月内无显著差异；RF17的细胞存活率在0-9个月无显著差异，第12个月与前几个月相比无极显著差异；三种菌株的冻干发酵剂在各时期的降酸能力均无显著差异，说明复合保护剂对这几种菌体细胞均起到良好的保护作用，可正常应用于果酒的生物降酸。

综上，利用本发明复合保护剂能够提高MLF乳酸菌冻干发酵剂的细胞存活率及贮藏时间，从而为研发专用于我国南方亚热带特色水果果酒酿制的高活性发酵剂奠定了基础；此外，该复合保护剂还具有制备过程简单、易于操作，保护剂溶质均一、形态稳定的特点。

Claims (2)

1.一种MLF乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂，其特征在于：该复合保护剂的成分及成分含量为：脱脂乳粉10g、甘油2.5g、谷氨酸钠1.0g、苹果酸钠2.2g、海藻糖1.0g、山梨醇1.0g，水100mL。

2.一种MLF乳酸菌冻干发酵剂的复合保护剂的制备方法，其特征在于：其包括如下具体操作：

（1）依据权利要求1所述的成分含量准确称量该复合保护剂的各成分，备用；

（2）先将称量好的谷氨酸钠溶解于盛有100mL水的烧杯中，接着将甘油、苹果酸钠、海藻糖及山梨醇加入，并用玻璃棒搅拌使之彻底溶解；然后放入脱脂乳粉，再加8-10粒玻璃珠，使脱脂乳粉充分混匀，混匀后将玻璃珠分离出并将混合液倒于三角瓶中，加硅胶塞，于105±2℃下湿热灭菌10～15min，冷却至室温即可获得所述复合保护剂。