CN114437960A - 发酵乳杆菌、菌剂及其制备方法和它们的应用、发酵食品及其制备方法 - Google Patents

发酵乳杆菌、菌剂及其制备方法和它们的应用、发酵食品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及发酵领域，公开了发酵乳杆菌、菌剂及其制备方法和它们的应用、发酵食品及其制备方法。该发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.21156。本发明提供的发酵乳杆菌具有适应温度广、产酸快、高产胞外多糖的特点。且用本发明的发酵乳杆菌制备发酵面制品、发酵谷物饮料和发酵果蔬汁等发酵食品时，得到的发酵食品风味独特、保质期长，还能够有效提高发酵食品的感官品质。

Description

发酵乳杆菌、菌剂及其制备方法和它们的应用、发酵食品及其 制备方法
技术领域
本发明涉及发酵领域，公开了一株发酵乳杆菌、一种菌剂、一种菌剂的制备方法以及根据该方法制备的菌剂、所述发酵乳杆菌或所述菌剂在制备发酵食品中的应用、一种发酵食品的制备方法和一种发酵食品。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种，具有丰富的物种多样性。我国青海、西藏、内蒙、新疆等地的传统发酵乳制品中蕴藏着丰富的乳酸菌菌种资源，是丰富的益生菌菌种宝库。
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，乳杆菌属(Lactobacillus)。在食品发酵领域，发酵乳杆菌可应用于发酵主食类产品如馒头、包子、面包、发饼、米糕等谷物发酵产品。
随着人们生活水平的提高，人们更关注食物的营养和健康。同时，传统发酵主食类产品也得到了更高的关注。传统发酵主食是以小麦粉、米粉等为原料，加水和菌剂，经过发酵、揉制/搅拌、成型及醒发等过程，最后经过汽蒸或烘焙熟化为成品。传统发酵面食品工业化生产过程中存在风味损失、口感单一、保质期短、易老化现象。
在生产酸面团的过程中，发酵乳杆菌的功能是使面团产酸和胞外多糖，从而改善制品品质，增加制品风味，延长制品保质期等。因此，筛选产酸强、多产胞外多糖以及感官特征突出的菌种是酸面团生产的主要目标。
发明内容
本发明的目的是为了筛选产酸强、多产胞外多糖以及感官特征突出的菌株，提供一株发酵乳杆菌、一种菌剂、一种菌剂的制备方法以及根据该方法制备的菌剂、所述发酵乳杆菌或所述菌剂在制备发酵食品中的应用，该发酵乳杆菌具有适应温度广、产酸快、高产胞外多糖的特点，且制得的发酵食品风味独特和保质期长的特点。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)，该发酵乳杆菌的保藏号为CGMCCNo.21156。
本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)。
本发明第三方面提供一种菌剂的制备方法，该菌剂由如上所述的发酵乳杆菌在发酵培养基中进行发酵培养后制得。
本发明第四方面提供根据如上所述的方法制备得到的菌剂。
本发明第五方面提供如上所述的发酵乳杆菌或如上所述的菌剂在制备发酵食品中的应用。
本发明第六方面提供一种发酵食品的制备方法，该方法包括将如上所述的发酵乳杆菌或如上任意一项所述的菌剂与发酵底物相接触。
本发明第七方面提供一种发酵食品，所述发酵食品根据如上所述的方法制备得到。
通过本发明的技术方案，能够获得如下的有益效果：
1、安全健康、成本低廉：本发明提供的发酵乳杆菌分离自甘肃省白银市会宁县老面中筛选出的可用于食品的安全菌株，无化学添加，绿色天然，营养健康；
2、本发明提供的发酵乳杆菌CGMCC No.21156具有适应温度范围广、产酸能力强、高产胞外多糖的特点，并能提高发酵制品品质，且风味独特(赋予产品甜香、奶香和乳酸风味)，对产品感官品质特性具有良好的改善作用；
3、本发明提供的发酵乳杆菌用于制备菌剂时，易于培养和制备，菌剂发酵乳杆菌活菌浓度高。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明提供的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.21156，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所(缩写为CGMCC)。
附图说明
图1为本发明所述的发酵乳杆菌的菌落形态。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)，该发酵乳杆菌的保藏号为CGMCCNo.21156。
本发明所述的发酵乳杆菌，是从甘肃省白银市会宁县老面中筛选出的。
所述的发酵乳杆菌CGMCC No.21156具有下述性质：
(1)形态学特征：如图1所示，在MRS培养基上菌落乳白色，圆形，表面光滑，湿润，不透明；显微镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色阳性。
(2)本发明提供的发酵乳杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示，与NCBI发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)的序列比对，相似性达到99.99％。
SEQ ID NO:1：
GGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACGGTTTTAAGAGATTTGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTTCCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGGTTGGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGTCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGGTAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTACCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAGAAAACCGCCTGCACTCTCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTAAATACCGTCAACGTATGAACAGTTACTCTCATACGTGTTCTTCTTTAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGGCCGTGTCTCAGTCCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACAAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCAGAAGTGATAGCGAGAAGCCATCTTTTAAGCGTTGTTCATGCGAACAACGCTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTGTCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTACCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTGGC
结合生理生化鉴定出此菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
本发明提供的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.21156，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所(缩写为CGMCC)。
(3)温度适应范围广：所述发酵乳杆菌在10-40℃条件下均可制备酸面团。
(4)产酸强：使用MC液体培养基进行产酸能力测试，得出菌株CGMCC NO.21156发酵24h后pH能达3.66，产酸能力强；制备的酸面团时，产酸时间短、酸度高，适于发酵酸面团。
(5)面包质构特性：面包焙烤后硬度可达228g，内聚性可达0.673，胶粘性可达153.471，咀嚼性可达150.909。
(6)面包发酵风味特征：发酵产品中除含有苯乙醇、壬醛共有风味物质外，还含有辛酸乙酯与辛酮等成分，赋予产品清香的风味；含有苯乙醇，赋予产品甜香风味；含有乳酸乙酯，赋予产品乳酸香味。
(7)面包感官描述性评价特征：发酵乳杆菌发酵的面包感官评价分析结果为气孔细小均匀、湿润度高、回弹快、柔软、爽口不粘牙、乳酸香味突出。
由此可见，本发明提供的发酵乳杆菌温度适应范围广，产酸能力强、改善发酵制品品质和风味特性，对产品感官品质特性具有良好的改善作用。
所述发酵乳杆菌可以通过冻存管保存，冻存管中的发酵乳杆菌在使用前，可以先通过斜面培养，使其恢复活力。斜面培养基可以是本领域常用的培养基，比如可以为MRS固体培养基。斜面培养的条件可以是本领域常规的条件，比如温度可以为20-40℃，时间为1-2天。经过斜面培养的发酵乳杆菌可以恢复活力，用于后续的培养和发酵。
本发明提供的发酵乳杆菌经过液体培养能够产生大量发酵乳杆菌活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述发酵乳杆菌增殖即可，例如可以将发酵乳杆菌菌体接种于培养基中，并且在厌氧条件下，在20-40℃的温度下培养10-24小时后，得到培养液。
所述培养基可以为本领域公知的各种适合发酵乳杆菌培养的培养基，例如可以为MRS培养基。
其中，MRS培养基优选包括：蛋白胨0.5-1.5重量％，牛肉粉0.3-0.8重量％，酵母粉0.2-0.6重量％，葡萄糖1-3重量％，吐温80 0.05-0.2重量％，K2HPO4.7H2O 0.1-0.3重量％，乙酸钠·3H2O 0.4-0.6重量％，柠檬酸三铵0.1-0.4重量％，MgSO4·7H2O 0.01-0.05重量％，MnSO4·4H2O 0.001-0.01重量％，pH为6-6.5。121℃高压灭菌15-20min。当培养基为固体培养基时，优选还包含琼脂1.5-2重量％。
本发明可以进一步分离上述培养液中的发酵乳杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。
本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)。
根据本发明，为了更进一步提高发酵食品的发酵特性，优选的，所述菌剂还含有酵母菌。其中，所述酵母菌可以是本领域具有发酵能力强、持气能力强的菌株，例如，所述酵母菌可以为酿酒酵母。
根据本发明，所述菌剂中，酿酒酵母和发酵乳杆菌的比例可以在较宽的范围内选择，例如，酿酒酵母和发酵乳杆菌的活菌数比为1：(10-11-1011)。更优选地，酿酒酵母和发酵乳杆菌的活菌数比为1：(10-4-104)。
根据本发明，所述菌剂的形式可以不受特别的限制，比如可以为液体菌剂、半液体菌剂、浓缩菌剂或固体菌剂。其中，固体菌剂可以是干燥菌剂，例如，可以为冻干菌剂、喷雾干燥菌剂等。
其中，所述半液体菌剂是指浓缩后的发酵液或者是和发酵底物混合的发酵液，固体菌剂可以是干燥制备得到的菌剂，例如，可以为冻干菌剂、喷雾干燥菌剂或真空干燥菌剂等。
优选地，所述菌剂中的活菌数为108cfu/mL以上，更优选为1010cfu/mL以上。
本发明第三方面提供一种菌剂的制备方法，该菌剂由如上所述的发酵乳杆菌在发酵培养基中进行发酵培养后制得。
优选地，所述菌剂以液体菌剂、半液体菌剂、浓缩菌剂或固体菌剂的形式存在。
优选地，该方法包括：将如上所述的发酵乳杆菌在发酵培养基中进行培养，并使活菌数达到108CFU/mL以上，得到的发酵液即为菌剂A。
根据本发明，所述发酵培养基可以是本领域常规的发酵培养基，比如可以为MRS培养基。培养的条件在第一方面已经进行了阐述，在此不再赘述。
根据本发明，优选地，该方法还包括对如上所述的发酵液进行进一步处理，得到菌剂。
优选地，所述处理的方式选自如下所示的方式的一种：
(1)将得到的发酵液和底物混合得到菌剂B；
(2)对得到的发酵液进行浓缩，得到菌剂C；
(3)对得到的发酵液进行浓缩和干燥，得到菌剂D。
应当理解的是，菌剂A为液体形态的菌剂，菌剂B为半液体菌剂，菌剂C为浓缩菌剂，菌剂D为固体形式存在的菌剂。
根据本发明，方式(1)中，所述底物可以根据所述发酵菌剂的预定用途不同而不同，例如，当所述菌剂预定用于谷物发酵时，则所述底物变为待发酵的相应底物。其中，所述底物包括但不限于米粉、面粉、小米粉。
其中，所述底物的用量不受特别的限制，只要能够使得步骤(1)得到的液体菌剂转变为半液体菌剂即可。
根据本发明，方式(2)和(3)中，所述浓缩的方法可以为本领域常规的技术手段，只要能够实现发酵液的浓缩即可，比如，可以为离心、过滤等，只要不显著影响发酵乳杆菌的活性即可。
根据本发明一种优选的实施方式，对所述发酵菌液进行离心以得到菌剂C。所述离心，例如，可以在冷冻离心机中以5000-12000rpm的速度离心5-20min获得菌体沉淀，从而得到菌剂C。
根据本发明，方式(3)中，所述干燥的方式包括但不限于冻干、烘干、风干、真空干燥和喷雾干燥等。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述干燥的方式包括：向浓缩后的物料中加入保护剂，并调整活菌浓度至1010cfu/mL以上，并将所得混合物料干燥后得到菌剂D。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述菌剂为固体菌剂，所述菌剂的制备方法包括：
(1)将如上所述的发酵乳杆菌在发酵培养基中进行发酵培养，并使活菌数达到108cfu/mL以上，得到发酵液；
(2)将步骤(1)得到的发酵液进行离心处理，得到菌泥；
(3)将菌泥与冻干保护剂混合，并调整活菌浓度至1010cfu/mL以上，冷冻干燥后，得到所述菌剂。
根据本发明，所述保护剂可以为本领域常规的各种保护剂，例如，可以为脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油等中的至少一种。本领域技术人员可以根据需要选择并调整保护剂的用量。
根据本发明，优选地，在向所述浓缩菌剂中加入冻干保护剂之前，优选的，该方法还包括使用缓冲液对所述浓缩菌剂进行洗涤。其中，所述缓冲液可以为本领域常规的用于对菌体进行冲洗的缓冲液，例如，可以为生理盐水或PBS缓冲液。
根据本发明，为了进一步提高所述菌剂制备的发酵食品的风味，优选的，该方法还包括引入酵母的步骤。
其中，所述酵母可以以任意形式在任意步骤中引入，例如，在方式(1)中，所述酵母可以以酵母发酵液的形式与发酵乳杆菌的发酵液先混合，然后再引入底物，从而得到含有酵母和发酵乳杆菌的半液体菌剂；或者，在步骤(3)中，所述发酵乳杆菌以浓缩后的发酵液的形式与酵母的浓缩后的发酵液先混合，然后再引入保护剂；或者，在菌剂D中直接加入固体形式的酵母菌剂。
根据本发明，所述酵母的加入量可以在较宽的范围内选择，优选的，所述酵母的加入量使得，在所得到菌剂中，酵母和发酵乳杆菌的活菌数的比例可以为1：(10-11-1011)，更优选为1：(10-4-104)。
所述菌剂的产品形态可以包括但不限于胶囊、片剂、口服液和粉剂。
本发明第四方面提供根据如上所述的方法制备得到的菌剂。
本发明第五方面提供如上所述的发酵乳杆菌或如上所述的菌剂在制备发酵食品中的应用。
根据本发明，所述发酵食品优选选自发酵谷物饮料、发酵豆制品、发酵果蔬汁和发酵面食中的至少一种。
优选地，所述发酵面制品为馒头、面包、包子、发饼或发糕。
在生产发酵食品的常规生产过程中，可以把发酵乳杆菌CGMCCNo.21156或菌剂按照常规使用方法接种到待处理的发酵底物中，在能够使所述发酵乳杆菌繁殖的温度、压力下进行发酵。
本发明通过在发酵底物中加入发酵乳杆菌CGMCC No.21156制备酸面团，将酸面团应用于发酵面食品可以改善产品的质构、香味、抗老化、延长产品的保质期。
本发明第六方面提供一种发酵食品的制备方法，该方法包括将如上所述的发酵乳杆菌或如上任意一项所述的菌剂与发酵底物相接触。
根据本发明，本领域技术人员可以根据预定的发酵食品的种类将所述发酵乳杆菌或菌剂接种到相应的发酵底物中制备酸面团，发酵结束后，再按照常规的方法进行相应发酵食品的制备。
优选地，发酵底物选自米粉、面粉和小米粉中的至少一种。
所述发酵食品的制备方法为本领域常规的制备方法，在此不再赘述。
本发明第七方面提供一种发酵食品，所述发酵食品根据如上所述的方法制备得到。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
MRS培养基(Man Rogosa Sharpe Broth)：蛋白胨1重量％，牛肉粉0.5重量％，酵母粉0.4重量％，葡萄糖2重量％，吐温80 0.1重量％，K2HPO4.7H2O0.2重量％，乙酸钠·3H2O0.5重量％，柠檬酸三铵0.2重量％，MgSO4·7H2O 0.02重量％，MnSO4·4H2O 0.005重量％，琼脂粉1.5重量％，加热溶解，调节pH至6.2±0.2，121℃高压灭菌15-20min。
MC液体培养基：大豆蛋白胨0.5重量％，牛肉粉0.3重量％，酵母粉0.3重量％，葡萄糖2重量％，乳糖2重量％，碳酸钙1重量％，琼脂1.5重量％，1％中性红溶液0.5重量％。将前面7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.0±0.2，加入中性红溶液，分装后121℃高压灭菌15-20min。
在无特殊说明的情况下，使用的试剂和材料均通过商购获得。
在无特殊说明的情况下，操作均为本领域常规的操作。
用作对照菌株的商业发酵乳杆菌为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的发酵乳杆菌CICC No.22537。
实施例1
本实施例用于说明所述发酵乳杆菌的鉴定。
所述发酵乳杆菌分离自甘肃省白银市会宁县老面团中。
(1)形态学特征和生理生化性质：如图1所示，在MRS培养基上菌落乳白色，圆形，表面光滑，湿润，不透明；显微镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色阳性。
(2)生理生化鉴定
利用法国梅里埃生化鉴定系统对筛选菌株进行生理生化鉴定，鉴定结果见下表1。经生理生化鉴定，分离菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)。
表1
控制 - INO 肌醇 - MLZ D-松三糖
GLY 甘露醇 - MAN 甘露醇 - RAF D-棉子糖
ERY 赤藻糖醇 - SOR 山梨醇 - AMD 淀粉
DARA D-阿拉伯糖 - MDM 甲基-αD-吡喃甘露糖苷 - GLYG 糖原
LARA L-阿拉伯糖 - MDG 甲基-αD-吡喃葡萄糖苷 - XLT 木糖醇
RIB D-核糖 + NAG N-乙酰葡萄糖胺 - GEN D-龙胆二糖
DXYL D-木糖 - AMY 苦杏仁苷 - TUR D-土伦糖
LXYL L-木糖 - ARB ARBULIN - LYX D-来苏糖
ADO D-侧金盏花醇1 - ESC 七叶灵柠檬酸铁 - TAG D-塔格糖
MDX 甲基-βD吡喃木糖苷 - SAL 水杨苷 - DFUC D-岩藻糖
GAL D-半乳糖 - CEL D-纤维二糖 - LFUC L-岩藻糖
GLU D-葡萄糖 + MAL D-麦芽糖 + DARL D-阿拉伯糖
FRU D-果糖 - LAC D-乳糖 + LARL L-阿拉伯醇
MNE D-甘露糖 - MEL D-蜜二糖 + GNT 葡萄糖酸钾
SBE L-山梨醇 - SAC D-蔗糖 + 2KG 2酮基葡萄糖酸钾
RHA L-鼠李糖 - TRE D-海藻糖 - 5KG 5酮基葡萄糖酸钾
DUL 卫矛醇 - INU 菊粉 -
[注]：表中“+”代表生化反应结果为阳性，“-”代表生化反应结果为阴性。
(3)分子鉴定：发酵乳杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示，与NCBI发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)的序列比对，相似性达到99.99％。
SEQ ID NO:1：
GGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACGGTTTTAAGAGATTTGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTTCCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGGTTGGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGTCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGGTAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTACCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAGAAAACCGCCTGCACTCTCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTAAATACCGTCAACGTATGAACAGTTACTCTCATACGTGTTCTTCTTTAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGGCCGTGTCTCAGTCCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACAAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCAGAAGTGATAGCGAGAAGCCATCTTTTAAGCGTTGTTCATGCGAACAACGCTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTGTCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTACCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTGGC
结合生理生化特征，鉴定出此菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCCNo.21156，保藏日期为2020年11月11日。
实施例2
本实施例用于说明发酵乳杆菌的温度适应性及产酸能力。
为了对此发酵乳杆菌的温度适应性能进行考察，将发酵乳杆菌接到MRS液体培养基中，然后分别置于在10℃、15℃、20℃、30℃、35℃和40℃恒温培养箱中发酵，每三小时测量一次培养液的pH值。以24h内培养液pH值作为产酸能力评价，结果如表2所示。
按照相同的方法，对对照菌株的产酸能力进行评价，评价结果见表2。
表2
Figure BDA0003426777350000131
由表2可以看出，发酵乳杆菌在10-40℃条件下均能达到较低的酸度，说明此发酵乳杆菌适应温度范围广，温度适应范围比对照菌株宽。
本发明的菌株CGMCC NO.21156在35℃下发酵3h后pH能达3.65，40℃下能达3.57；产酸时间短、酸度高，产酸强度大于对照菌株。
实施例3
本实施例用于说明发酵乳杆菌产胞外多糖的能力。
将菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养48h，取l0mL培养液，加入250uL体积分数为80％的三氯乙酸(脱除蛋白质)，在离心机中以8000r/min离心20min，离心后弃去沉淀，将上清液装入透析袋中，流水透析48h。透析后加入3倍体积95％的乙醇，在4℃下冷藏过夜，得到的多糖呈絮状沉淀析出，在离心机中以l0000r/min离心20min，弃去上清液，得到的沉淀即为胞外多糖，将沉淀溶解于l0mL蒸馏水中，得到胞外多糖水溶液。
总糖使用苯酚硫酸法：待测样2.0mL加入试管中后，依次加入1mL 6％苯酚，5mL浓硫酸，静置l0min，摇匀，室温放置20min后于490nm波长下检测吸光度。
还原糖使用3,5二硝基水杨酸法：待测样0.5mL，加入3,5二硝基水杨酸试剂混匀，沸水浴5min，冷却后加入4mL蒸馏水，混匀，在540nm下检测吸光度。
所述多糖的含量按照公式“多糖＝总糖-还原糖”进行计算，计算结果见下表3所示。
表3
浓度(mg/L) CGMCC NO.21156 对照菌株
多糖 783.0 288.3
可见，筛选的菌株CGMCC NO.21156胞外多糖产量高达783.0mg/L，具有很高的多糖产生能力，远高于经过优化培养条件的同类菌株的150-600mg/L，包括对照菌株的多糖产生能力。
实施例4
本实施例用于说明发酵乳杆菌发酵酸面团对面包产品应用特征影响。
分别使用本发明所述的发酵乳杆菌和对照菌株制备面包。
步骤：配料称重→搅打面团成膜→静置→切块、搓圆→静置→排气整形→醒发→烘烤。
观察面包的组织状态，拍照并测量吐司体积或高度。焙烤好的面包冷却1小时后，切成15mm厚的吐司切片。
(1)全质构分析：取吐司面包心，切成1.5cm厚度薄片，使用TA.XT.Plus质构仪进行全质构分析。选用P36R探头，采用TPA检测模式，测试速度为1.0mm/s，压缩到原始高度的50％，第1次和第2次压缩之间的松弛时间为5s，每个样品测5次并取平均值，结果见表4。
表4
菌株 硬度 内聚性 胶粘性 咀嚼性
本发明菌株 228.223 0.673 153.471 150.909
对照菌株 400.415 0.737 295.460 286.522
由表4可见，本发明所述的发酵乳杆菌制备酸面团，使得焙烤面包更柔软。
(2)面包喜好度测试：选择色泽、风味、湿润度、弹性、整体喜好度几个指标进行面包产品喜好度测试，不同发酵乳杆菌在很大程度上影响着实验结果，其中此发酵乳杆菌发酵的吐司具有气孔细小均匀、湿润度高、回弹快、柔软、爽口不粘牙、乳酸香味突出的特点。用本发明的发酵乳杆菌制备酸面团制作的吐司喜好度优于对照菌株制作的吐司。
(3)抗老化
取常温放置不同天数的面包测定面包焓值。面包的回生焓采用60Plus/60A差示扫描量热仪(DSC)进行测定，称取5mg(干基)的面包冻干粉末放入DSC盘，加入蒸馏水，使水与面包的质量比为3﹕1，DSC盘密封后，室温下平衡过夜，以10℃/min的速率加热DSC盘，使温度从25℃升温到120℃，同时以空的DSC盘作为对照，结果见表5。
表5
Figure BDA0003426777350000161
面包在贮藏过程中，面包体系由于支链淀粉的重结晶发生老化，从表5可以看出，应用差示量热扫描仪分析发酵乳杆菌酸面团面包的老化焓值在贮藏期内始终小于应用对照菌株制备的吐司，说明应用本发明的发酵乳杆菌制备的酸面团可以防止支链淀粉重结晶。
(4)面包保质期测定
将2个样品置于室温静置，根据微生物(菌落总数、霉菌、大肠杆菌)结果记录保质期，结果见表6。
表6
菌株 保质期/天
本发明菌株 8天
对照菌株 5天
从表6可看出，用本发明的发酵乳杆菌制备的酸面团制作的吐司保质期明显长于应用对照菌株制备的吐司。
实施例5
本实施例用于说明发酵乳杆菌制备酸面团发酵面包风味物质的研究。
焙烤好的面包冷却1小时后，取面包芯2g于40mL顶空瓶中，加入1μL浓度为0.816μg/μL内标2-甲基-3-庚酮后密封，将其放置于60℃的恒温水浴锅内，平衡20min。平衡结束后，再将SPME进样针插进样品瓶，小心推出纤维萃取头，吸附40min后，将纤维头缩回，小心拔出待气相色谱仪显示“ready”后，将SPME进样针小心快速的插入进样口，再次推出萃取头，进行5min解析，再缩回纤维头并拔出。
色谱条件：极性毛细管柱DB－WAX；固定相为聚乙二醇；载气为高纯氦气，流速1.0mL/min；进样口温度230℃；不分流模式；初始温度40℃，保持2min，以2℃/min升到50℃，再以5℃/min升到110℃，再以3℃/min升到230℃，保持4min。
质谱条件：电子电离(electron ionization，EI)源，电子能量70eV；离子源温度200℃；接口温度280℃，质量扫描范围29～800u；标准调谐，全扫描模式进行数据采集；无溶剂延迟。结果如表7所示。
表7
浓度/(μg/kg) 苯乙醇 壬醛 3-羟基-2-丁酮 乙酸 乳酸乙酯
本发明菌株 2.41 3.28 1.28 3.87 2.13
对照菌株 2.02 3.00 0.52 1.44 -
面包发酵风味特征：增强甜香味、奶香味、酸味。应用本发明的发酵乳杆菌发酵面包样品中的香气化合物3-羟基-2-丁酮、乳酸乙酯、乙酸等物质含量明显高于对照菌株制备的吐司产品，经查阅3-羟基-2-丁酮有奶香味，乙酸具有酸味特征。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中粮海嘉（厦门）面业有限公司
中粮营养健康研究院有限公司
中粮面业（秦皇岛）鹏泰有限公司
<120> 发酵乳杆菌、菌剂及其制备方法和它们的应用、发酵食品及其制备方法
<130> 68778
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1322
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum
<400> 1
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 60
gcgattccga cttcgtgcag gcgagttgca gcctgcagtc cgaactgaga acggttttaa 120
gagatttgct tgccctcgcg agttcgcgac tcgttgtacc gtccattgta gcacgtgtgt 180
agcccaggtc ataaggggca tgatgatctg acgtcgtccc caccttcctc cggtttgtca 240
ccggcagtct cactagagtg cccaacttaa tgctggcaac tagtaacaag ggttgcgctc 300
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacgaccatg caccacctgt 360
cattgcgttc ccgaaggaaa cgccctatct ctagggttgg cgcaagatgt caagacctgg 420
taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 480
tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 540
agctccggca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacctagc actcatcgtt tacggcatgg 600
actaccaggg tatctaatcc tgttcgctac ccatgctttc gagtctcagc gtcagttgca 660
gaccaggtag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt ccaccgctac 720
acatggagtt ccactaccct cttctgcact caagttatcc agtttccgat gcacttctcc 780
ggttaagccg aaggctttca catcagactt agaaaaccgc ctgcactctc tttacgccca 840
ataaatccgg ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 900
gtgactttct ggttaaatac cgtcaacgta tgaacagtta ctctcatacg tgttcttctt 960
taacaacaga gctttacgag ccgaaaccct tcttcactca cgcggtgttg ctccatcagg 1020
cttgcgccca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtatg ggccgtgtct 1080
cagtcccatt gtggccgatc agtctctcaa ctcggctatg catcatcgcc ttggtaggcc 1140
gttaccccac caacaagcta atgcaccgca ggtccatcca gaagtgatag cgagaagcca 1200
tcttttaagc gttgttcatg cgaacaacgc tgttatgcgg tattagcatc tgtttccaaa 1260
tgttgtcccc cgcttctggg caggttacct acgtgttact cacccgtccg ccactcgttg 1320
gc 1322

Claims (10)

1.一株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)，其特征在于，该发酵乳杆菌的保藏号为CGMCCNo.21156。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其中，所述菌剂中的活菌数为108cfu/mL以上。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其中，所述菌剂以液体菌剂、半液体菌剂、浓缩菌剂或固体菌剂的形式存在。
5.一种菌剂的制备方法，其特征在于，该菌剂由权利要求1所述的发酵乳杆菌在发酵培养基中进行发酵培养后制得。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述菌剂为固体菌剂，所述菌剂的制备方法包括：
(1)将权利要求1所述的发酵乳杆菌在发酵培养基中进行发酵培养，并使活菌数达到108cfu/mL以上，得到发酵液；
(2)将步骤(1)得到的发酵液进行离心处理，得到菌泥；
(3)将菌泥与冻干保护剂混合，并调整活菌浓度至1010cfu/mL以上，冷冻干燥后，得到所述菌剂。
7.根据权利要求5或6所述的方法制备得到的菌剂。
8.权利要求1所述的发酵乳杆菌或权利要求2-4和7中任意一项所述的菌剂在制备发酵食品中的应用。
9.一种发酵食品的制备方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1所述的发酵乳杆菌或权利要求2-4和6中任意一项所述的菌剂与发酵底物相接触。
10.一种发酵食品，其特征在于，所述发酵食品根据权利要求9所述的方法制备得到。
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