CN107904185B - 一种乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乳杆菌菌株及应用,属于微生物技术领域,所述的乳杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为:CCTCC M 2017450,拉丁名为Lactobacillus spicheri IZ。所述乳杆菌菌株的菌落特征为:MRS琼脂平板,菌落乳白色,圆形,菌落直径为2mm±1mm,微凸起,湿润,边缘整齐,细胞形状为杆状,适宜生长温度25℃~35℃,为兼性厌氧型菌株。所述乳杆菌用于制备苞谷酸辣椒,在保留原有苞谷酸辣椒主体风味的同时能够显著抑制杂菌,使苞谷酸辣椒的次品率降低至0%,适用于苞谷酸辣椒的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物新品种及发酵工艺领域,具体涉及一种乳杆菌及其应用。
背景技术
乳杆菌是细菌的一科,为革兰氏染色阳性、无芽孢杆菌。乳酸菌在自然界中分布很广,在植物体表、乳制品、肉制品、啤酒、葡萄酒、果汁、麦芽汁、发酵面团、污水以及人畜粪便中,均可分离到。由于乳酸菌的生长产生酸性环境,从而抑制腐败菌的生长。中国传统的食品,如泡菜、榨菜、腌菜和酿酒等的制作保藏技术就是利用了乳酸菌的这一作用,对肠道及吸收好。
乳杆菌广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中,也见于温血动物的口腔、阴道和肠道内。乳杆菌科仅包括乳杆菌属,属类种之间差异较大,由一系列在表型性状、生化反应和生理特征方面具有明显差异的种组成。该属细菌分解糖的能力强,分解蛋白质类的能力低。乳杆菌耐酸,最适pH值为5.5~5.8,甚至更低。
苞谷酸是南方地区特别是武陵山区深受欢迎的民族特色发酵食品,它主要以玉米和辣椒为原料,通过乳酸菌、酵母等厌氧发酵,再经炒制(汤制)等加工而成,有着悠久的历史,其色泽亮丽、风味独特;发酵质量的好坏直接影响苞谷酸质量。由于原料、地理环境和加工工艺的不同,不同区域的苞谷酸产品呈现出独特的风味和口感,苞谷酸发酵过程中存在着复杂的微生物群落。它们能够产各种酶类,降解大分子物质,促进苞谷酸风味物质的代谢合成,包括游离氨基酸、有机酸、酯类等,赋予了苞谷酸丰富的营养成分和独特的风味特征。
苞谷酸辣子作为一种传统特色食品传统,是将苞谷打成面,和剁碎的红辣椒拌好,舂成坨后放到坛子里腌起来,吃的时候把腌好的苞谷酸辣坨坨从坛子里取出,用茶油或菜油炒熟(或汤制)后酸辣爽口。做法包括下述步骤:1)备料:玉米洗净干燥粉碎,新鲜红辣椒清洗、去蒂、晾干、粉碎;2)拌料:玉米粉和辣椒以一定比例混匀;3)自然发酵:将混匀料入坛密封自然发酵2~3个月;4)烹制:将发酵好的苞谷酸辣子置于炒锅(或汤锅)中,加入一定量的植物油及配料炒制(煮)10分钟左右。
普通乳酸菌在苞谷酸辣椒制备环境中容易形成次品,为此申请人从传统苞谷酸中分离出乳酸菌,并经过多次驯化,逐渐降低接种量,使其能够很好的适应苞谷酸辣椒的发酵体系,并在恶劣环境中胁迫,使其具备良好稳定性及抑菌能力,通过扩大培养,其能够显著提高苞谷酸辣椒等发酵类产品的生产稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳杆菌株,该菌株具有提高苞谷酸发酵稳定性的特点,可用于苞谷酸辣椒的发酵,该菌株已于2017年8月保藏于中国典型培养物保藏中心,该菌株保藏号为:CCTCC No:M 2017450,拉丁名Lactobacillus spicheri IZ, 地址:湖北省武汉市武汉大学,邮编:430072,电话:027-68754052。
本发明保藏的乳酸菌菌落特征为:MRS琼脂平板生长菌落乳白色,圆形,菌落中等大小,直径2mm±1mm,微凸起,湿润,边缘整齐,细胞形状为杆状,适宜生长温度25℃~35℃,兼性厌氧。所述乳酸菌属于细菌界Bacteria,厚壁菌门Phylum Firmicutes,芽孢杆菌纲Bacilli,乳杆菌目Lactobacillales,乳杆菌科Lactobacillaceae,乳杆菌属Lactobacillus。
本发明还提供了所述乳杆菌的几个新用途。
第一,所述乳杆菌用于制备苞谷酸辣椒。
第二,所述乳杆菌用于提高苞谷酸辣椒的发酵稳定性,适用于苞谷酸辣椒的工业化生产。
第三,所述乳杆菌在苞谷酸辣椒制备过程中能够抑制杂菌,并保留苞谷酸辣椒的原有主体风味。
有益效果
本发明从传统苞谷酸辣椒中分离并保藏了一株Lactobacillus spicheri IZ,该菌株在苞谷酸制备中具有极高的发酵稳定性,所述的发酵稳定性体现在两个方面,首先是自身生长及发酵稳定,从而保证了苞谷酸辣椒制备过程的稳定性,第二是抑制杂菌的能力及产生良好风味,在苞谷酸的制备环境中,能够有效抑制杂菌,代谢风味稳定,从而提高产品稳定性;第三是特别适合于采用干辣椒制备苞谷酸辣椒发酵体系,降低干辣椒制备苞谷酸辣椒次品率,提高产品品质。本发明分离出的乳杆菌能够在玉米粉和辣椒粉组成的培养基上抑制杂菌,并产生良好风味,显著降低苞谷酸辣椒的次品率,同时保留了原有苞谷酸辣椒的主体风味。根据实验结果显示,接种本发明保藏的乳杆菌后,苞谷酸辣椒的次品率为0%,而接种普通乳酸菌后,采用同样的制备方法,其次品率为18.16%,可见本发明保藏的乳杆菌有降低苞谷酸辣椒次品率的作用,而此作用并非所有乳酸菌的共性。
附图说明:
图1:自然发酵次品苞谷酸辣椒气相色谱图;
图2:自然发酵良品苞谷酸辣椒气相色谱图;
图3:本发明实施例气相色谱图;
图4:有机酸标准色谱图;
图5:本发明对照组1有机酸色谱图;
图6:本发明实施例1有机酸色谱图;
图7:本发明乳杆菌在MRS培养基上的菌落形态图;
图8:本发明乳杆菌在显微镜下的细胞形态图;
图9:本发明乳杆菌的生长曲线图;
图10:本发明乳杆菌的产酸曲线图。
具体实施方式。
下面结合具体实施例子进一步阐明本发明,应理解这些实施例仅用于说明本发明,而不用于限制本发明的范围,在阅读了本发明之后,本领域的技术人员对本发明各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所规定的范围。
具体实施方式
该菌株已于2017年8月保藏于中国典型培养物保藏中心,该菌株保藏号为:CCTCCM 2017450,拉丁名Lactobacillus spicheri IZ, 地址:湖北省武汉市武汉大学,邮编:430072,电话:027-68754052。
本发明保藏的Lactobacillus spicheri IZ菌落特征为:MRS琼脂平皿,菌落乳白色,圆形,菌落中等大小,直径2mm±1mm,微凸起,湿润,边缘整齐,细胞形状为杆状,适宜生长温度25℃~35℃,兼性厌氧。所述Lactobacillus spicheri IZ属于细菌界Bacteria,厚壁菌门Phylum Firmicutes,芽孢杆菌纲Bacilli,乳杆菌目Lactobacillales,乳杆菌科Lactobacillaceae,乳杆菌属 Lactobacillus。其菌落形态和细胞形态见图7和图8。
本发明保藏的菌株筛选自自然发酵的苞谷酸辣椒产品,其获得步骤如下:
第一,通过从自然发酵的苞谷酸辣椒产品中筛选出一个Lactobacillus spicheri菌株。
第二,在玉米辣椒培养基(玉米粉85%,辣椒粉15%,70℃热处理30min)中接入0.5%活化好的大肠杆菌,0.5%枯草芽孢杆菌、0.5%粘质沙雷氏菌和3%筛选出的Lactobacillusspicheri,无菌水调节水分45%~50%,搅拌均匀,25℃~30℃厌氧发酵30天,并采用MRS琼脂平板分离出Lactobacillus spicheri菌株。
第三,玉米辣椒培养基(玉米粉85%,辣椒粉15%,70℃热处理30min)中再接入活化好的0.5%毕赤酵母,0.5%汉逊酵母,0.5%热带假斯酵母,3%MRS琼脂平板分离出的Lactobacillus spicheri,无菌水调节水分45%~50%,搅拌均匀,25~30℃厌氧发酵30天,继续用MRS琼脂平板分离出Lactobacillus spicheri。
第四,将分离出的Lactobacillus spicheri接种于pH3.0玉米辣椒培养基中,搅拌均匀,25~30℃放置6h,分离乳杆菌;依此循环,依次将乳杆菌接种量降低为2.5%、2%、1.5%、1%,其它条件不变。
第五,从上述玉米辣椒培养基环境中再次筛选出活力交强的Lactobacillusspicheri类的菌株,得到全新的CCTCC M 2017450,拉丁名Lactobacillus spicheri IZ的菌株。
本发明保藏的Lactobacillus spicheri IZ的DNA碱基测序如下:
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实施例1
本实施例提供了一种高稳定性的工厂化苞谷酸辣椒的制备工艺,具体步骤如下:
1)辣椒预处理:将新鲜辣椒用清水洗净,清洗完成后用0.03%(m/V)的柠檬酸钠溶液浸泡50min,浸泡后并去蒂,用鼓风干燥箱在40℃的条件下烘干36h,至辣椒中的水分含量低于13%,将干燥的辣椒用蔬菜粉碎机粉碎,粉碎后过4mm孔径筛网,得到新鲜辣椒粉。
2)玉米预处理:将玉米用清水洗净,并在50℃的干燥箱中鼓风干燥24h,至玉米水分含量低于13%;干燥完成后剥出洗净后的玉米粒,用粉碎机粉碎,过10目筛,再过40目筛,其中40目玉米粉占30%,10目玉米粉占70%,混合后得到颗粒直径在≤2mm的玉米粉。
3)大米预处理:将市售大米除米糠、碎米、谷皮和杂质后,浸泡30h,并蒸煮25min,冷却,得到熟大米。
4)红曲霉曲种子液制备:将中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC编号为3.2666,分离自汾酒小曲的红曲霉接种至玉米粉培养液中,其中,所述玉米粉培养液的配方为:玉米粉:10g/L,葡萄糖:15g/L,蛋白胨:15g/L, K2HPO4:5g/L,MgSO4:1g/L,余量为无菌水。红曲霉在种子液在振荡培养箱中活化,活化温度28℃,振荡培养箱转速175r/min,培养时间48h,得到红曲霉种子液。
5)红曲霉曲制备:将活化后红曲霉种子液接种至熟大米上,接种量5%~10%,在26±3℃的条件下培养4~5天,培养结束得到红曲霉曲。
6)Lactobacillus spicheri IZ种子液制备:CGTCC编号为M 2017450的Lactobacillus spicheri IZ于液态MRS培养基中活化,37℃恒温静止培养24h,得到Lactobacillus spicheri IZ种子液。
7)混合发酵:按照混合曲发酵后的玉米粉80%(m/m),红曲霉曲4.7%,新鲜辣椒粉15%(m/m),盐0%,Lactobacillus spicheri IZ种子液0.3%(m/m)的比例将原料混合均匀,用无菌水调节水分含量至50%,置于密闭发酵容器中,控制压力0.01~0.10Mpa,温度为25~30℃的条件下,厌氧发酵15天,得到苞谷酸辣椒。
其中,所述MRS培养基按照如下配方配制:蛋白陈 10.0g,牛肉粉6.0g,酵母粉4.0g,葡萄糖 20.0g,吐温80 1.0mL,磷酸氢二钾 2.0g,乙酸钠 5.0g,柠檬酸三铵 2.0g,硫酸镁 0.2g,硫酸锰 0.05g,水1000ml。
实施例2
本实施例提供了一种高稳定性的工厂化苞谷酸辣椒的制备工艺,具体步骤如下:
1)辣椒预处理:将新鲜红辣椒用清水洗净,清洗完成后用0.01%(m/V)的柠檬酸钠溶液浸泡80min,浸泡后并去蒂,用40~45℃的鼓风干燥箱烘24~48h,至辣椒中的水分含量低于10%,将干燥的辣椒用蔬菜粉碎机中粉碎,粉碎后过2~6mm孔径筛网,得到新鲜辣椒粉。
2)玉米预处理:将玉米用清水洗净,并在45~50℃的干燥箱中鼓风干燥24~36h,至水分含量低于13%;剥出洗净后的玉米粒,用粉碎机粉碎,过10目筛,再过40目筛,其中40目玉米粉占20%,10目玉米粉占80%,混合后得到颗粒直径在≤2mm的玉米粉。
3)大米预处理:将市售大米除米糠、碎米、谷皮和杂质后,浸泡20h,并蒸煮25~30min,冷却,得到熟大米
4)红曲霉曲种子液制备:将中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC编号为3.2666,分离自汾酒小曲的红曲霉接种至玉米粉培养液中,其中,所述玉米粉培养液的配方为:玉米粉:10g/L,葡萄糖:15g/L,蛋白胨:15g/L, K2HPO4:5g/L,MgSO4:1g/L,余量为无菌水。红曲霉在种子液在振荡培养箱中活化,活化温度30℃,振荡培养箱转速200r/min,培养时间60h,得到红曲霉种子液。
5)红曲霉曲制备:将活化后红曲霉种子液接种至熟大米上,接种量5%~10%,在26±3℃的条件下培养4~5天,培养结束得到红曲霉曲。
6)Lactobacillus spicheri IZ种子液制备:CGTCC编号为M 2017450的Lactobacillus spicheri IZ于液态MRS培养基中活化,37±1℃恒温静止培养20~26h,得到Lactobacillus spicheri IZ种子液。
7)混合发酵:按照混合曲发酵后的玉米粉77%(m/m),红曲霉曲10%,新鲜辣椒粉10%(m/m),盐2%,Lactobacillus spicheri IZ种子液1%(m/m)的比例将原料混合均匀,用无菌水调节水分含量至55%,置于密闭发酵容器中,控制压力0.01~0.10Mpa,温度为25~30℃的条件下,厌氧发酵10天,得到苞谷酸辣椒。
其中,本实施例中所述MRS培养基按照如下配方配制:蛋白陈 10.0g,牛肉粉6.0g,酵母粉4.0g,葡萄糖 20.0g,吐温80 1.0mL,磷酸氢二钾 2.0g,乙酸钠 5.0g,柠檬酸三铵2.0g,硫酸镁 0.2g,硫酸锰 0.05g,水1000ml。
实施例3
本实施例提供了一种高稳定性的工厂化苞谷酸辣椒的制备工艺,具体步骤如下:
1)辣椒预处理:将新鲜红辣椒用清水洗净,清洗完成后用0.2%(m/V)的柠檬酸钠溶液浸泡20min,浸泡后并去蒂,用40~45℃的鼓风干燥箱烘24~48h,至辣椒中的水分含量低于10%,将干燥的辣椒用蔬菜粉碎机中粉碎,粉碎后过2~6mm孔径筛网,得到新鲜辣椒粉。
2)玉米预处理:将玉米用清水洗净,并在45~50℃的干燥箱中鼓风干燥24~36h,至水分含量低于15%;剥出洗净后的玉米粒,用粉碎机粉碎,过10目筛,再过40目筛,其中40目玉米粉占20%,10目玉米粉占80%,混合后得到颗粒直径在≤2mm的玉米粉。
3)大米预处理:将市售大米除米糠、碎米、谷皮和杂质后,浸泡60h,并蒸煮25~30min,冷却,得到熟大米
4)红曲霉曲种子液制备:将中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC编号为3.2666,分离自汾酒小曲的红曲霉接种至玉米粉培养液中,其中,所述玉米粉培养液的配方为:玉米粉:10g/L,葡萄糖:15g/L,蛋白胨:15g/L, K2HPO4:5g/L,MgSO4:1g/L,余量为无菌水。红曲霉在种子液在振荡培养箱中活化,活化温度26℃,振荡培养箱转速150r/min,培养时间36h,得到红曲霉种子液。
5)红曲霉曲制备:将活化后红曲霉种子液接种至熟大米上,接种量5%~10%,在26±3℃的条件下培养4~5天,培养结束得到红曲霉曲。
6)Lactobacillus spicheri IZ种子液制备:CGTCC编号为M 2017450的Lactobacillus spicheri IZ于液态MRS培养基中活化,37±1℃恒温静止培养20~26h,得到Lactobacillus spicheri IZ种子液。
7)混合发酵:按照混合曲发酵后的玉米粉87%(m/m),红曲霉曲2%,新鲜辣椒粉5%(m/m),盐4%,Lactobacillus spicheri IZ种子液2%(m/m)的比例将原料混合均匀,再用无菌水调节水分含量至43%,置于密闭发酵容器中,控制压力0.01~0.10Mpa,温度为25~30℃的条件下,厌氧发酵20天,得到苞谷酸辣椒。
其中,所述MRS培养基按照如下配方配制:蛋白陈 10.0g,牛肉粉6.0g,酵母粉4.0g,葡萄糖 20.0g,吐温80 1.0mL,磷酸氢二钾 2.0g,乙酸钠 5.0g,柠檬酸三铵 2.0g,硫酸镁 0.2g,硫酸锰 0.05g,水1000ml。
申请人通过色泽、气味、口感等感官评价对自然发酵的苞谷酸对其进行分类,并对其理化指标进行分析见表1,其中良品苞谷酸乙酸乙酯、乳酸乙酯及总酯含量明显高于其它组,而异丁酸含量显著低于次品苞谷酸,峰型见图1,图2,由此,总酯、异丁酸含量等对苞谷酸品质有重要影响。
检测方法:
样品前处理:准确称取25.000g样品于100ml烧杯中,加入80℃煮沸过的蒸馏水将烧杯中的内容物转移至匀浆机中匀浆2min,再将匀浆的样品全部转移至250ml容量瓶中,75℃水浴中处理40min(摇动3次),冷却,用煮沸过的凉蒸馏水定容至250ml,快速滤纸过滤,备用。
总酸:参照GBT 12456-2008 食品中总酸的测定;
亚硝酸盐:参照GB 500933-2010食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定;
蛋白质:参照GB 5009.5-2016食品中蛋白质的测定;
氨基酸:参照GB/T 5009.124-2003 食品中氨基酸的测定;
甲醇:参照GB 5009.266-2016食品中甲醇的测定;
总酯:参照GB/T10345-2007测定;
乙酸乙酯、乳酸乙酯、异丁酸:取过滤液100ml,加入100ml色谱纯乙醇,混匀,0.25um滤膜过滤,参照GB/T10345-2007测定;
有机酸:取前处理的滤液稀释适当倍数,0.45um滤膜过滤,液相色谱法测定,色谱仪为Dionex Ultimate 3000,Thermo Hypersil BDS C18 柱(250 mm×4.6 mm,5μm),VWD-3400 紫外检测器,波长:210 nm,柱温:25 ℃,流速:0.6 mL/min,流动相:V(甲醇)︰V(0.01mol/L 磷酸二氢钾缓冲液,pH 2.7) =3:97;进样量:20μL。
致病菌:参照GB29921-2013食品中致病菌限量;
黄曲霉毒素:参照GB 5009.22-2016食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定。
菌株生长曲线及产酸曲线测定:将活化好的乳酸菌按3%的接种量接入MRS液体培养基中,15~35℃静置培养48h,每隔3h在600nm测培养液菌体浓度,同时测定培养液pH。表1传统自然发酵制备的良品、一般、较差苞谷酸辣椒的各项理化指标表
不同发酵方式制备的苞谷酸辣椒的各项理化指标见表2,其中实施例组为采用实施例2的方法制备出的苞谷酸辣椒;对照组2为采用传统自然发酵法得到的苞谷酸辣椒,对照组2为采用实施例1的方法,但未添加红曲制备出的苞谷酸辣椒。
表2实施例及传统自然发酵制备的苞谷酸辣椒的各项理化指标表
由上表可以看出,本发明实施例方法制备的苞谷酸辣椒的酯类较对照组有显著提高,而且亚硝酸盐、甲醇等有害成分较对照组有显著的下降,其风味物质种类多,而且风味较好。
表3良品苞谷酸及次品辣椒指标
申请人选取20个不知道苞谷酸辣椒制备方法的评定者,让他们评定传统方法和本发明方法制备的苞谷酸辣椒,并进行打分。
申请人按照上述表格的任意两项指标判断发酵完成后是否在发酵过程中产生次品,对不同方法制备得到的苞谷酸辣椒的次品发生率进行统计。
实施例组和对照组的发酵环境温度均为25~30℃,采用本实施例法制备的苞谷酸辣椒的次品率发生概率是0%,即未出现次品苞谷酸辣椒的现象,而对照组1发生次品的比例是31.62%;对照组2发生次品的比例是7.34%,采用普通植物乳杆菌发酵的苞谷酸辣椒发生次品的比例是18.16%,由此可见,本实施例通过加入红曲和CGTCC编号为M2017450Lactobacillus spicheri IZ的共同作用显著降低了苞谷酸辣椒在发酵过程中发生次品的概率。
申请人选择了7个正常自然发酵的苞谷酸辣椒,对其指标进行了检测,结果如下:
表4对照组1各项检测指标表
申请人选择了7个采用本发明实施例的方法,采用保藏菌株,但不添加红曲霉曲制备的苞谷酸辣椒,对其指标进行了检测,结果如下:
表5对照组2各项检测指标表
申请人选择了7个采用本发明实施例的方法,采用保藏菌株,同时添加红曲霉曲制备的苞谷酸辣椒,对其指标经行了检测,结果如下:
表6实施例1组各项检测指标表
由表6可以看出,加入红曲霉曲和本发明保藏的菌株后,其苞谷酸辣椒各组的稳定性有显著提升,降低了产品甲醇、异丁酸等含量,增加了乳酸乙酯、乙酸乙酯、总酯等风味及游离氨基酸含量,提高了产品品质;由此可见,采用此方法能显著增强苞谷酸辣椒的产品稳定性,同时缩短了发酵周期,提高产品品质。
表7对照组1和实施例1组的有机酸含量对照表(%,w/w)
由表7及色谱图可以看出自然发酵和强化菌发酵的玉米酸酸类物质中有机酸都有乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸酸、甲酸等,实施例与对照组主要有机酸相似,不影响主体风味。
Claims (4)
1.一种乳杆菌菌株,其特征在于:所述乳杆菌(Lactobacillus spicheri)IZ保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为:CCTCC No: M 2017450。
2.一种权利要求1所述的乳杆菌菌株的用途,其特征在于:所述乳杆菌用于制备苞谷酸辣椒。
3.根据权利要求2所述的乳杆菌菌株的用途,其特征在于:所述乳杆菌用于提高苞谷酸辣椒的发酵稳定性,适用于苞谷酸辣椒的工业化生产。
4.根据权利要求2所述的乳杆菌菌株的用途,其特征在于:所述乳杆菌在苞谷酸辣椒制备过程中能够抑制杂菌,并保留苞谷酸辣椒的原有主体风味。
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