CN108949854B - 固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，包括以下步骤：（1）植物乳杆菌活化、（2）细胞琼脂固定化、（3）固定细胞发酵、（4）固液分离、（5）除蛋白、（6）沉淀多糖、（7）冷冻干燥。本发明使用固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖，细胞均匀分散在凝胶珠中，可以持久保持菌种活力和胞内酶活状态；还可保护菌体不受酸、碱、有害离子等不利条件的影响，进行持续性生产；并且固定化颗粒还有利于简化菌种活化、产物提取工艺。因此可以被反复多次使用，能有效地提高菌株使用率，降低生产成本，使高产量、连续化工业生产乳酸菌胞外多糖成为可能。

Description

固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺。

背景技术

微生物产胞外多糖(ExopoLy Saccharides，EPS)有一些对人体具有特殊效用，如促进免疫反应和抗溃疡活性，这些特性是其在功能性食品领域迅猛发展的强力保障，已被广泛应用于食品添加剂工业。近年来，微生物多糖类物质越来越受到重视。其中，对香菇多糖和细菌多糖研究最多，应用范围最广。

早在19世纪下半叶，科学家们已经确认了微生物可以合成EPS。当时就已经证实79属168种微生物都可以合成胞外多糖，与其对应还存在细胞内的多糖等。乳酸菌胞外多糖分子量大约为4.0×10⁴~6.0×10⁶之间。尽管长期以来研究者们对乳酸菌产EPS的化学组成存在着分歧，但是较一致认为从乳酸菌中分离得到的胞外聚合物是由α-和β-连接糖重复单元所组成的多糖，并且不同乳酸菌分泌的EPS类型不同。虽然单糖组成可能有些相似，多为半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，但是各成分比率不同。

由于乳酸菌是食品级工业生产细菌，具有比其他细菌更高的安全性，故此近年来乳酸菌EPS的研究逐渐增多。但产量过低，稳定性差仍是制约乳酸菌EPS大规模发酵生产的主要影响因素。在实际加工生产过程中，乳酸菌EPS生产成本过高也制约其大规模的工业化生产。因此，目前乳酸菌EPS仍主要用于提高奶制品和蛋糕奶酪等食品的质量。

但是值得注意的是，EPS也具有免疫学活性，抗癌细胞，抗肠道溃疡等生物学活性，在医学制药领域有巨大价值。来自全球范围科学工作者正尝试通过途径工程（第三代基因工程）来构建产量较高的菌体细胞系，但还尚未成功。

细胞固定化技术是将微生物菌体活细胞固定在特定的载体上，使其菌体细胞高密度密集并保持其生物学活性，在适宜的条件下还可进行菌体增殖，以满足发酵生产工艺的要求。30多年前乳酸菌固定化细胞发酵就开始引起人们的关注。将乳酸菌进行固定化有较多优点，目前主要用于生产乳酸、乳制品以及Nisin等。微生物细胞的固定化方法以包埋法和吸附法最为常用。研究表明，固定化乳酸菌在保护细胞、连续化生产中的作用是突出有效的。随着研究的不断深入，固定化乳酸菌发酵生产的范围也越来越广泛。

由于乳酸菌是食品级工业生产细菌，具有比其他细菌更高的安全性，故此近年来乳酸菌胞外多糖(ExopoLy Saccharides，EPS)的研究逐渐增多。但乳酸菌难于活化、稳定性差、EPS产量过低、EPS成分和结构复杂纯化困难等因素仍是制约乳酸菌EPS大规模发酵生产的主要因素。在实际加工生产过程中，乳酸菌EPS生产工艺复杂致使生产成本过高也制约其大规模的工业化生产。因此，目前乳酸菌EPS生产仅处于研究阶段，主要用于提高奶制品和蛋糕奶酪等食品的质量，一直没有办法工业化生产纯化产品。

利用固定化技术发酵生产乳酸菌胞外多糖是解决目前面临问题的有效方法之一。细胞固定化技术是将微生物菌体活细胞固定在特定的载体上，使其菌体细胞高密度密集并保持其生物学活性，在适宜的条件下还可进行菌体增殖，以满足发酵生产工艺的要求。将乳酸菌进行固定化有较多优点，已有用于生产乳酸、乳制品以及Nisin等。 但目前对于固定化乳酸菌发酵生产胞外多糖工艺还没有相关研究。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，包括以下步骤：

（1）植物乳杆菌活化：将甘油保藏的植物乳杆菌菌种从冰箱内取出，待彻底解冻后，在无菌超净工作台用移液枪吸取250μL接种于5mL灭菌后的MRS培养基中，在培养箱中于37℃下培养24h，然后以5%的接种量进行传代，活化两次，活力得到恢复后，以5%的接种量进行摇瓶发酵扩大培养，与此同时，将菌液1mL与灭菌后的甘油溶液（1mL）按体积比1:1混合后放至于-20℃冰箱中冷藏保存，备用；

（2）细胞琼脂固定化：准确称取3.0克琼脂溶于100毫升蒸馏水中，在高压灭菌器中灭菌，灭菌后冷却至50℃待用，将经24h培养的乳酸菌发酵液进行离心（5000r / min ，10min），除去上清，用无菌水将植物乳杆菌细胞转移至灭菌的培养皿中，然后倒入灭菌后的琼脂溶液并充分进行混合，冷却固化后，用刀将其切成小方块得到固定化植物乳杆菌颗粒，用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存备用；

（3）固定细胞发酵：将固定化植物乳杆菌颗粒以3%的接种量接种于液体MRS液体培养基中摇瓶培养，于37℃下培养24h；

（4）固液分离：发酵终止后用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存可重复使用；同时过滤后发酵液中加入三氯乙酸溶液，震荡摇匀，于4℃下放置12h静置沉淀；

（5）除蛋白：在4℃，18000×g的离心力下离心30min，离心沉淀除蛋白取上清液；

（6）沉淀多糖：向步骤（5）所得上清液中加入无水乙醇，处理12h，沉淀多糖；

（7）冷冻干燥：在12000×g的离心力下离心30min，取沉淀，-80℃的冰箱冷冻2h；然后置于冷冻干燥机冷冻干燥1.5h；

（8）透析：将离心冷冻干燥处理后的沉淀物用温水溶解稀释20倍，装入透析袋（MD34，截留分子质量8000-14000）透析，再次检漏，确认无误后，在4℃冰箱进行透析，直至离子强度不变为止（12h左右）。得纯多糖溶液，以苯酚-浓硫酸法测OD值。

所述步骤（1）MRS液体培养基的组成为：葡萄糖20.0g，牛肉膏10.0g，吐温80 1.0g，蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母浸粉5.0g，一水硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.58g，1.0 L蒸馏水。

所述步骤（1）中甘油溶液的体积分数为50%。

所述步骤（2）中琼脂的浓度为30g/L，琼脂的粒径为1cm。

所述步骤（2）中固定化植物乳杆菌颗粒为切割直径为1.0cm的固定化颗粒。

所述步骤（4）中三氯乙酸与水，按体积比为1:1混合均匀配成体积分数为50%的三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液与发酵液的体积比为1:5。

所述步骤（6）中加入无水乙醇的体积为上清液体积的3倍。

本发明的有益效果：本发明使用固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖，细胞均匀分散在凝胶珠中，可以持久保持菌种活力和胞内酶活状态；还可保护菌体不受酸、碱、有害离子等不利条件的影响，进行持续性生产；并且固定化颗粒还有利于简化菌种活化、产物提取工艺。因此可以被反复多次使用，能有效地提高菌株使用率，降低生产成本，使高产量、连续化工业生产乳酸菌胞外多糖成为可能。

乳酸菌产EPS能发挥保护菌体细胞免受侵蚀的作用。主要包括：保护乳酸菌细胞不受到某些有毒化合物的伤害；抵抗某些不利于菌体生长发育的环境；增强菌体抗性；鏊合金属离子和帮助细胞进行细胞间的识别。乳酸菌所产生的EPS还可以结合水分子，使菌体细胞耐受湿度较低的干燥环境。菌体细胞壁上的荚膜多糖可以保护菌体细胞免受噬菌体的裂解侵害。

固定化方法大大简化了工艺流程。不需要多次活化菌种，避免了发酵液中分离细胞这一步骤，从而简化后续产物提取，而且固定化后的乳酸菌细胞，生物活性能够被较好地保持，可以被反复多次使用，能有效地提高了菌株使用率，降低生产成本。

本发明找到了最佳固定化植物乳杆菌发酵生产EPS的工艺：植物乳杆菌为EPS最优化高产菌，对植物乳杆菌固定化发酵EPS最佳工艺条件为：琼脂强度30g/L（琼脂的凝固特性对控制温度非常重要）、粒径大小1cm、3%接种量37℃发酵24h，胞外多糖产量最高，达到1489.9mg/L。此最佳工艺条件固定化技术可以有效简化和改善胞外多糖的分离和再生性能，有利用乳酸菌胞外多糖的工业化生产。

附图说明

图1 为490nm分光光度计测得葡萄糖标准曲线。

图 2 为乳酸菌高产EPS菌株的筛选。

图 3为不同固定化材料对EPS产量的影响。

图4为不同温度对EPS产量的影响。

图 5为不同接种量对EPS产量的影响。

图 6为不同琼脂强度对EPS产量的影响。

图 7为琼脂粒径对EPS产量的影响。

图 8为平行实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，包括以下步骤：

（1）植物乳杆菌活化：将甘油保藏的植物乳杆菌菌种从冰箱内取出，待彻底解冻后，在无菌超净工作台用移液枪吸取250μL接种于5mL灭菌后的MRS培养基中，在培养箱中于37℃下培养24h，然后以5%的接种量进行传代，活化两次，活力得到恢复后，以5%的接种量进行摇瓶发酵扩大培养，与此同时，将菌液1mL与灭菌后浓度为50%（v/v）甘油按体积比1:1混合后放至于-20℃冰箱中冷藏保存，备用；所述步骤（1）MRS液体培养基的组成为：葡萄糖20.0g，牛肉膏10.0g，吐温80 1.0g，蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母浸粉5.0g，一水硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.58g，1.0 L蒸馏水；

（2）细胞琼脂固定化：准确称取3.0克琼脂（浓度为30g/L，琼脂的粒径为1cm）溶于100毫升蒸馏水中，在高压灭菌器中灭菌，灭菌后冷却至50℃待用，将经24h培养的乳酸菌发酵液进行离心（5000r / min ，10min），除去上清，用无菌水将植物乳杆菌细胞转移至灭菌的培养皿中，然后倒入灭菌后的琼脂溶液并充分进行混合，冷却固化后，用刀将其切成直径为1.0cm小方块得到固定化植物乳杆菌颗粒，用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存备用；

（3）固定细胞发酵：将固定化植物乳杆菌颗粒以3%的接种量接种于液体MRS液体培养基中摇瓶培养，于37℃下培养24h；

（4）固液分离：发酵终止后用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存可重复使用；同时过滤后发酵液中加入浓度为50%（v/v）的三氯乙酸溶液，震荡摇匀，于4℃下放置12h静置沉淀，其中三氯乙酸溶液与发酵液的体积（v/v）比为1:5；

（5）除蛋白：在4℃，18000×g的离心力下离心30min，离心沉淀除蛋白取上清液；

（6）沉淀多糖：向步骤（5）所得上清液中加入无水乙醇，处理12h，沉淀多糖；无水乙醇的体积为上清液体积的3倍；

（7）冷冻干燥：在12000×g的离心力下离心30min，取沉淀，-80℃的冰箱冷冻2h；然后置于冷冻干燥机冷冻干燥1.5h；

（8）透析：将离心冷冻干燥处理后的沉淀用温水溶解稀释20倍，装入透析袋（MD34，截留分子质量80000-14000）透析，再次检漏，确认无误后，在4℃冰箱进行透析，直至离子强度不变为止（12h左右）。得纯多糖溶液，以苯酚-浓硫酸法测OD值。

苯酚硫酸法测定EPS

精确称取分析纯葡萄糖4mg，用双蒸水溶解后，定量转移至100mL容量瓶中，用双蒸水定容至容器刻度线，摇匀，得葡萄糖溶液，浓度为40μg/mL。

取8支20mL的定糖管，按表1加入试剂，然后用苯酚硫酸法测定吸光度，以0号管中的溶液作参比。

表1葡萄糖标准曲线各溶液添加量

乳酸菌EPS的检测用此方法较为合适，相对误差仅为千分之二，具有较高的正确度。EPS通过浓硫酸的作用水解成小分子单糖类物质，然后迅速失去水分生成醛类衍生物。醛类衍生物能够与苯酚溶液发生化学反应生成橙红色的化学物质。可用紫外可见分光光度计在490nm下进行吸光度的测定。打开紫外分光光度计，按下自检按钮，预热约20分钟，将冷却后的标准溶液倒入比色杯中，使用0管中的液体作为空白，测量490nm处的OD值。然后以葡萄糖标准液的浓度值作为横坐标，相应的OD值作为纵坐标，通过绘制葡萄糖标准曲线以获得线性方程y=0.0095x-0.0067及相关系数R^2=0.9955（图1）。

一、乳酸菌产胞外多糖菌株的筛选

不同乳酸菌产生ESP的能力存在明显的差异，据报道嗜热链球菌EPS产量为50～350 mg／L、保加利亚乳杆菌EPS产量为60～150 mg／L、乳酸乳球菌EPS产量为25～600 mg／L、干酪乳杆菌EPS产量为50～60 mg／L。本实验从6株乳酸菌（德氏保加利亚乳酸杆菌，植物乳杆菌，干酪乳杆菌，嗜酸乳杆菌，乳酸乳球菌乳酸亚种LL9，嗜热乳杆菌）进行筛选，它们由于代谢途径的差异，在不同的温度及培养环境下具有不同的胞外多糖生产合成能力。综合考虑菌体细胞最适生产温度和成本问题后，选择37℃作为筛选温度，培养基选取MRS培养基，时间为24h。对六株菌体所产胞外多糖进行处理分析，最后选出产量最高的菌株进行后续实验。

乳酸菌细胞生产的EPS要想在实际生产中得到广泛应用，首先要做的工作就是要获得EPS高产菌株，降低EPS生产成本。本实验通过对六株乳酸菌EPS合成能力进行研究，筛选出EPS高产菌。以5%接种量在MRS培养基摇瓶发酵24h，经提取纯化测EPS产量，结果如图2所示。

从图2中可以看出，六株乳酸菌均能合成EPS，但合成能力存在差异，其中植物乳杆菌产EPS最高为1513.1mg/L，干酪乳酸菌产量最低为1064.6mg/L，其余菌株的EPS产量介于二者之间。因此在后续的研究中，我们确定了植物乳杆菌为EPS高产菌株。

二、单因素实验

筛选出高产EPS菌株后，可进行单因素实验。包括对固定化载体的种类、载体强度、粒径大小、发酵温度和接种量等进行实验。

（1）固定化载体对乳酸菌固定化发酵的影响

固定化载体可以影响菌种活性。试验中，我们采取琼脂包埋法、海藻酸钙包埋法、卡拉胶包埋法、明胶与戊二醛交联包埋法这四种方法进行发酵实验，以确定最适包埋载体。实验条件为5%接种量，发酵温度37℃。

在此次试验中，四种不同载体类型固定化植物乳杆菌，5%接种量，37℃摇瓶发酵，通过提取纯化，最后由分光光度计测得EPS产量，其结果如下图3所示：

从条形图中可以看出，经过固定化材料处理后，植物乳杆菌EPS产量有所下降，但琼脂包埋法对乳酸菌EPS合成影响最小，为1096.2mg/L。经过固定化处理后，琼脂法产量最高，所以选择琼脂作为固定化材料继续进行下一步研究，探索最佳工艺条件。

（2）发酵温度对乳酸菌固定化发酵的影响

发酵温度可以影响乳酸菌菌体的生长以及EPS的合成。实验菌株分别以 30℃、35℃、37℃、40℃进行发酵，测定EPS产量，确定适宜发酵温度。实验条件为粒珠直径0.5cm，接种量5%，胶体强度为30g/L。

微生物经固定化后，发酵的最适温度有时会发生变化，一般情况下固定化酶的最适温度都比游离酶有所提高，所以最适发酵温度也随之提高。本实验研究固定化细胞后最适EPS合成温度。不同温度下，固定化植物乳杆菌发酵后测得EPS产量如下图4所示：

由图可知，固定化植物乳杆菌的最适温度为37℃。当发酵温度低于37℃时，EPS产量明显减少，30℃达到最低。结果表明，植物乳杆菌固定化后发酵产EPS最适温度没有发生变化，依然37℃为最适温度。

（3）珠粒大小对乳酸菌固定化发酵的影响

胶珠大小决定乳酸菌的生物反应界面，从而影响乳酸菌EPS的发酵能力。实验选取切割直径分别为 0.5cm、 1.0cm、1.5cm做出的固定化颗粒进行发酵，测定EPS产量，确定适宜珠粒大小。实验条件为接种量5%，发酵温度37℃，胶体强度为30g/L。

不同微生物的发酵生产都会有自己的最适接种量。如果接种量太大或太小，就会影响产品合成。在此次试验中选择15%、13%、10%、8%、5%接种量进行研究。接种量对乳酸菌生产EPS的影响如图5所示。

由图可知，接种量为5%时，乳酸产EPS产量为1443.6mg/L。表明此时接种量最适，最有利于乳酸菌发酵生产EPS。

（4）胶体强度对乳酸菌固定化发酵的影响

胶体强度能够影响菌体与培养基的物质交换和EPS的渗透效率。实验分别以15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L的胶体强度进行发酵，测定EPS，确定适宜的胶体强度。实验条件为粒珠直径0.5cm，接种量5%，发酵温度37℃。

琼脂糖的强度会对EPS产量产生极大影响。若琼脂浓度过低，那么将导致包埋后胶体强度较低，易碎易散，还有可能发生菌体渗漏导致包埋失败。而琼脂糖浓度过高，琼脂胶体强度足够不易破裂。但是会影响培养基营养物质与菌体接触效率，使菌体生长发育缓慢，合成EPS效率降低，甚至导致EPS不能透过琼脂扩散到发酵液中，发酵液中检测不到或只检测到极少的产物，这将极大地影响乳酸菌EPS的产量。本实验对15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L的琼脂强度进行了研究。琼脂强度对乳酸菌EPS产量影响如图6所示。

由图可知，当琼脂浓度为35g/L时，乳酸菌EPS产量为1458.3mg/L。说明此时琼脂强度对乳酸菌菌体与培养液影响最小。既不影响菌体吸收营养物质，又不影响EPS向培养基溶液中进行扩散，故选择琼脂浓度为35g/L为最适胶体强度。

（5）接种量对乳酸菌固定化发酵的影响

接种量的多少将会直接影响菌体的生长与代谢。本实验所筛选出来的乳酸菌分别以 5%、8%、10%、13%、15%的接种量进行研究，测定乳酸菌EPS产量，以确定最适接种量。实验条件为：粒珠直径0.5cm，发酵温度 37℃，胶体强度为30g/L。

琼脂包埋法琼脂块的大小会对乳酸菌EPS产量产生较大影响。过大不利于乳酸菌与培养基进行物质交换，切的过小不利于实验操作和实际发酵生产。本实验采用固定化载体材料的胶珠粒径大小为0.5cm、1cm、1.5cm。琼脂粒径大小对乳酸菌EPS产量的影响如图7所示。

由图可知，当琼脂粒径大小为1cm时，乳酸菌EPS产量为1477.3mg/L，此时EPS产量最高。说明此时被包埋在琼脂中的微生物能较好的与培养基进行物质交换，琼脂固定化的影响最小。故选择1cm为最适固定化颗粒粒径。

根据以上实验选出最佳固定化材料及载体浓度，逐次以此条件进行发酵，测定其EPS产量。依次选出最佳条件。

三、正交实验

从以上几个考察因素中，通过对比观察试验所得数据，选出3个对EPS

产量影响最大的因素，按L₉(3)³正交表安排三因素三水平正交实验，如下

表所示。

表2 正交实验因素

实验结果如表3 所示。

表3正交实验结果

据正交实验结果，通过对R值的分析可知，单因素对乳酸菌EPS产量的影响程度为：接种量>琼脂强度>温度。最适发酵条件为琼脂强度30g/L，发酵温度37℃和接种量为3%。

四、平行实验验证

由于该最优组合没有出现在正交实验中，所以仍需平行实验进行验证。三个平行实验的实验结果如图8 所示。

从平行实验结果分析可知，在3%接种量30g/L琼脂强度37℃培养条件下EPS平均产量为1489.9mg/L。

本发明从6株乳酸菌（德氏保加利亚乳杆菌，植物乳杆菌，干酪乳杆菌，嗜酸乳杆菌，乳酸乳球菌乳酸亚种LL9，嗜热乳杆菌）进行筛选，它们具有不同的胞外多糖生产合成能力。5%接种量，37℃摇瓶发酵，植物乳杆菌的EPS产量最高，产量为1513.1mg/L，为EPS高产菌株。

本发明对植物乳杆菌进行固定化载体的选择，以海藻酸钙胶体、卡拉胶、明胶以及琼脂作为载体，实验结果显示琼脂包埋法的固定化效果最好，产量为1096.2mg/L。相对于其他固定化方法，该方法对EPS产量影响最小，因此为植物乳杆菌产EPS最佳包埋载体。

本发明对植物乳杆菌固定化发酵EPS工艺条件进行研究，获得最佳工艺条件为：琼脂强度30g/L、粒径大小1cm、3%接种量37℃发酵24h，胞外多糖产量最高，达到1489.9mn/L。

结果显示，植物乳杆菌固定化细胞基本与游离态细胞发酵EPS产量持平，可能是因为固定化载体中产物的扩散受到限制，影响产量的提高。但从工艺角度发现，固定化方法大大简化了工艺流程。不需要多次活化菌种，避免了发酵液中分离细胞这一步骤，从而简化后续产物提取，而且固定化后的乳酸菌细胞，生物活性能够被较好地保持，可以被反复多次使用，能有效地提高了菌株使用率，降低生产成本。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，其特征在于包括以下步骤：

（1）植物乳杆菌活化：将甘油保藏的植物乳杆菌菌种从冰箱内取出，待彻底解冻后，在无菌超净工作台用移液枪吸取250μL接种于5mL灭菌后的MRS培养基中，在培养箱中于37℃下培养24h，然后以5%的接种量进行传代，活化两次，活力得到恢复后，以5%的接种量进行摇瓶发酵扩大培养，与此同时，将菌液1mL与灭菌后的甘油溶液按照体积比1:1混合后放至于-20℃冰箱中冷藏保存，备用；

（2）细胞琼脂固定化：准确称取3.0克琼脂溶于100毫升蒸馏水中，在高压灭菌器中灭菌，灭菌后冷却至50℃待用，将经24h培养的乳酸菌发酵液进行离心，除去上清，用无菌水将植物乳杆菌细胞转移至灭菌的培养皿中，然后倒入灭菌后的琼脂溶液并充分进行混合，冷却固化后，用刀将其切成小方块得到固定化植物乳杆菌颗粒，用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存备用；

（3）固定细胞发酵：将固定化植物乳杆菌颗粒以3%的接种量接种于液体MRS液体培养基中摇瓶培养，于37℃下培养24h；

（4）固液分离：发酵终止后用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存可重复使用；同时过滤后发酵液中加入三氯乙酸溶液，震荡摇匀，于4℃下放置12h静置沉淀；

（5）除蛋白：在4℃、18000×g的离心力下离心30min，离心沉淀除蛋白取上清液；

（6）沉淀多糖：向步骤（5）所得上清液中加入无水乙醇，处理12h，沉淀多糖；

（7）冷冻干燥：在12000×g的离心力下离心30min，取沉淀，-80℃的冰箱冷冻2h，然后置于冷冻干燥机冷冻干燥1.5h；

其中，所述步骤（2）中琼脂的浓度为30g/L，琼脂的粒径为1cm。

2.根据权利要求1所述的固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，其特征在于：所述步骤（2）中固定化植物乳杆菌颗粒为切割直径为1.0cm的固定化颗粒。

3.根据权利要求1所述的固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，其特征在于：所述步骤（1）MRS液体培养基的组成为：葡萄糖20.0g，牛肉膏10.0g，吐温80 1.0g，蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母浸粉5.0g，一水硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.58g，1.0 L蒸馏水。

4.根据权利要求1所述的固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，其特征在于：所述步骤（1）中甘油溶液的体积分数为50%。

5.根据权利要求1所述的固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，其特征在于：所述步骤（4）中三氯乙酸与水，按体积比为1:1混合均匀配成体积分数为50%的三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液与发酵液的体积比为1:5。

6.根据权利要求1所述的固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，其特征在于：所述步骤（6）中加入无水乙醇的体积为上清液体积的3倍。

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