CN102719492A

CN102719492A - 一种利用海藻酸钙法固定化植物乳杆菌发酵生产l-乳酸的方法

Info

Publication number: CN102719492A
Application number: CN2012102530412A
Authority: CN
Inventors: 金雅新
Original assignee: TAICANG MAOTONG HUAJIAN CO Ltd
Current assignee: TAICANG MAOTONG HUAJIAN CO Ltd
Priority date: 2012-07-21
Filing date: 2012-07-21
Publication date: 2012-10-10

Abstract

本发明提供了一种利用海藻酸钙法固定化植物乳杆菌发酵生产L-乳酸的方法，本发明以植物乳杆菌为出发菌株，采用海藻酸钠作为固定化材料包埋植物乳杆菌发酵生产乳酸，通过单因素实验确定了最适合乳酸发酵的固定化细胞制作条件。

Description

一种利用海藻酸钙法固定化植物乳杆菌发酵生产 L- 乳酸的方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用海藻酸钙法固定化植物乳杆菌发酵生产L-乳酸的方法。

背景技术

L-乳酸是21世纪最具应用潜力的有机酸之一。L-乳酸及其衍生物既是重要的有机化工原料，又是重要的精细化学品，被广泛应用于食品、农业、环保、医药、饲料、日用品、化工等领域。发酵法生产L−乳酸的菌种主要有乳酸杆菌属(Lactobacillus)和根霉属(Rhizopus)。用根霉发酵生产L−乳酸为好氧发酵，存在工艺能耗大、糖利用率低等缺点。采用乳酸菌发酵生产L−乳酸具有糖利用率高、不耗氧、能耗低、设备简单、操作方便等优点，在乳酸工业中具有广阔的发展前景。

细胞固定化技术，是利用物理或化学手段，将游离的微物(细胞)或酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性能反复利用的一项技术，大致可分成吸附法、共价结合法、交联法、包埋法等四大类。包埋法是将生物催化剂用物理或化学的方法包埋在各种载体中实现固定化的方法，是近年来发展迅速的一种新兴细胞固定化技术，具有操作简单、对细胞活性影响较小、效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法，也是食品的生产中最常用的固定化方法。包埋法常用载体主要有聚丙烯酰胺、琼脂、明胶、k-卡拉胶、海藻酸钠等。海藻酸钠是一类天然高分子多糖类，对微生物无毒害作用，而且价格低廉，是包埋中常用的载体。

发明内容

1. 一种利用海藻酸钙法固定化植物乳杆菌发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于发酵时，将增殖后的固定化细胞接入发酵培养基中进行发酵，一定时间取样，进行乳酸产量分析。

2. 其中，发酵培养基(g/L):玉米淀粉糖化液140、玉米浆75、碳酸钙30。

3. 固定化细胞增殖培养将固定化细胞按10%的接种量接入增殖培养基中，于37℃ 培养20 h。增殖培养完毕用无菌生理盐水洗涤3次，留作发酵实验。

4. 增殖培养基，葡萄糖3% 、蛋白胨1% 、酵母膏1.5% 、K₂HPO 0.5% 、碳酸钙3% ，pH 6.0。

5. 细胞固定化方法采用海藻酸钙法，将菌种移入种子培养基，于37℃下静置培养20 h，取一定量菌液，离心10 min，收集菌体后加到海藻酸钠溶液中，再搅拌均匀，用注射器将此混合液滴人到CaCl₂溶液中，将形成的海藻酸钙凝胶珠置于4℃ 冰箱中，继续固化4 h。

6. MRS种子培养基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母膏5、乙酸钠5、吐温80 1 mL、柠檬酸二铵2、K₂HPO₄ 2、MgSO₄·7H₂O 0.58、MnSO₄·4H₂O 0.25、灭菌前pH 6.5。

7. 海藻酸钠的最佳浓度为1.5%。

8. 选择0.5 mm作为固定化颗粒直径。

9. 选择2.0%为最佳的氯化钙浓度。

10. 最佳增殖时间为25 h。

本发明的有益效果在于：本发明采用海藻酸钠作为固定化材料包埋植物乳杆菌发酵生产乳酸，通过单因素实验确定了最适合乳酸发酵的固定化细胞制作条件。

附图说明

图1海藻酸钠浓度对固定化发酵的影响。

图2凝胶颗粒大小对固定化发酵的影响。

图3不同CaCl₂浓度对固定化发酵的影响。

图4 增殖时间对固定化发酵的影响。

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。

本发明所用的菌株为植物乳杆菌，购买于ACCC，编号为：ACCC11118。

实施例1

本实施案例说明海藻酸钠浓度对固定化发酵的影响，在乳酸菌的固定化过程中，海藻酸钠浓度决定着胶珠的成型和反应性能。浓度太低不能成珠；浓度过高挤珠闲难，还会使得壁材过厚，降低菌种与外界发酵的灵敏度。结果如图1所示。

由图1可看出，海藻酸钠浓度存0.5%～2.0%之间时，乳酸产量差别不大；浓度在1.5%时达到最大；浓度大于3.0%时，乳酸产量明显下降，这是由于凝胶的孔径缩小，增加了物质的传质阻力所致。

实施例2

本实施案例说明凝胶颗粒大小对固定化发酵的影响，由图2 可以看出，随着颗粒粒径的增大，乳酸的产量呈下降趋势。这是由于凝胶小球直径越大，越不利于传质，造成凝胶小球内部的细胞营养供给不足，代谢产物累积过多，小球内部环境恶化，不利于发酵的进行。颗粒直径在0.5～2.5 mm 时，乳酸产量差别很小，说明此范围内固定化颗粒的大小对乳酸产量影响不大。因此，选择0.5 mm作为固定化颗粒直径。

实施例3

本实施案例说明不同CaCl₂浓度对固定化发酵的影响，由图3可看出，氯化钙浓度对乳酸的产量影响不大，但是氯化钙浓度对固定化细胞的性质影响较大，浓度过低，凝胶颗粒较软，在发酵过程中易损坏，影响持续发酵的稳定性。在实验过程中，发现CaC1₂浓度在2.0% 时，所制作的同定化细胞形状均匀，软硬适中，具有弹性。所以，为使固定化细胞适应于连续发酵，选择2.0%为最佳的氯化钙浓度。

实施例4

本实施案例说明增殖时间对固定化发酵的影响，增殖时间的长短直接影响发酵初始时固定化颗粒内的含菌量，进而影响乳酸产量。由图4可看出，增殖时间对固定化发酵的影响显著，在增殖时间为25 h时，所得的乳酸产量最大。

Claims

1.一种利用海藻酸钙法固定化植物乳杆菌发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于发酵时，将增殖后的海藻酸钙法固定化细胞接入发酵培养基中进行发酵，一定时间取样，进行乳酸产量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基：玉米淀粉糖化液140 g/L、玉米浆75 g/L、碳酸钙30 g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化细胞增殖培养将固定化细胞按10%的接种量接入增殖培养基中，于37℃ 培养20 h；增殖培养完毕用无菌生理盐水洗涤3次，留作发酵。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，增殖培养基为：葡萄糖3% 、蛋白胨1% 、酵母膏1.5% 、K₂HPO 0.5% 、碳酸钙3% ，pH 6.0。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，细胞固定化方法采用海藻酸钙法，将菌种移入种子培养基，于37℃下静置培养20 h，取一定量菌液，离心10 min，收集菌体后加到海藻酸钠溶液中，再搅拌均匀，用注射器将此混合液滴人到CaCl₂溶液中，将形成的海藻酸钙凝胶珠置于4℃ 冰箱中，继续固化4 h。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于增殖时间为25 h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，MRS种子培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、乙酸钠5 g/L、吐温80 1 mL、柠檬酸二铵2 g/L、K₂HPO₄ 2 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.58 g/L、MnSO₄·4H₂O 0.25 g/L、灭菌前pH 6.5。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，海藻酸钠的浓度为1.5%。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于选择0.5 mm作为固定化颗粒直径。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于选择2.0%为氯化钙浓度。