CN101519675B - 聚乙烯醇固定化米根霉发酵l-乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，具体是将聚乙烯醇和海藻酸钠于沸水浴加热共溶于水，与米根霉孢子悬液混合，用注射器将混合液滴入含有氯化钙的饱和硼酸溶液中，同时用磁力搅拌器不停搅拌，使颗粒成球形，好的固定化颗粒于低温下硬化，然后用磷酸二氢钠溶液处理，固定化细胞增殖生长后，用蒸馏水洗净，用于L-乳酸的分批和重复分批发酵。这种聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的改进方法克服了现有的聚乙烯醇球状载体以及通透性差的缺点，且具有机械强度高、产酸量高、产酸速率快和重复使用效果好的优点。

Description

聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法

技术领域

本发明涉及一种聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的改进方法。

背景技术

乳酸(Lactic acid)，又名2-羟基丙酸，分子式CH₃CH(OH)COOH，是重要的有机酸之一，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中，是食品工业中常用的酸味剂和防腐剂，也是医药、化工、皮革、香料等工业的重要的原料。L-乳酸做为环境友好的生物可降解材料聚L-乳酸(PLA)的原料，国内外对乳酸的需求量日益增加，发展前景十分广阔。乳酸的来源主要是化学法合成和微生物发酵生产。由于采用发酵法生产，碳源利用率很高，甚至可以达到100％，并且可以转化利用作物秸秆以及林业废料等可再生资源，因此国内外普遍使用微生物发酵法来生产乳酸。

米根霉(Rhizopus oryzae)由于具有产物光学纯度高、营养消耗简单、产物易于分离等特点而成为生产高光学纯度L-乳酸的理想菌株。但是由于米根霉菌丝比较发达，在通常的搅拌发酵罐中容易纠结成团和缠住搅拌轴，从而增加了传质阻力和动力消耗。许多工艺方法如表面生物转盘法、电渗析法和离子树脂等用于解决上述问题，但大都较复杂或成本太高，不利于规模化工业生产。相对而言，固定化技术是一种有利于发酵与分离耦合的生物反应技术，能提高微生物的耐性和利用率，能减少后期分离的工艺过程。目前适用于米根霉固定化的方法有吸附法、自絮集法和包埋法。吸附法中的菌丝体易脱落，自絮集法不易控制固定化细胞的大小。因此包埋法具有更广泛的用途。包埋法所用的固定化载体有聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠、聚丙烯酰氨(ACAM)、聚乙烯乙二醇(PEG)、琼脂、聚胺酯泡沫、角叉菜胶和聚丙稀酸等凝胶。海藻酸钠是最普遍的固定化载体，但其机械强度不高易破碎。聚丙烯酰氨等对细胞毒性比较大。聚乙烯醇(PVA)具有强度高，化学稳定性好，抗微生物分解性强，且价格低廉等一系列优点，是一种较为理想的包埋固定化载体，已应用于多种微生物的固定化。但常规的PVA-硼酸法制得的凝胶珠的通透性差，凝胶颗粒间易结团成块，且硼酸对生物毒性大，细胞活性会受到影响。因此，对常规的PVA-硼酸固定化米根霉方法进行改进是十分必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的聚乙烯醇球状载体以及通透性差的缺点，提供一种改进的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法。

为解决上述问题，本发明的技术方案为：

一种聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：将聚乙烯醇和海藻酸钠于沸水浴加热共溶于水，与米根霉孢子悬液混合，将混合液滴入含有3-5％氯化钙的饱和硼酸溶液中，同时不停搅拌，使颗粒成球形，好的固定化颗粒于低温下硬化，然后用磷酸二氢钠溶液浸泡处理，然后用水洗涤除去颗粒内生成的海藻酸钙，得到的聚乙烯醇固定化米根霉细胞进行增殖培养生长后，用蒸馏水洗净，用于L-乳酸的分批和重复分批发酵。

所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：米根霉孢子悬液中聚乙烯醇的浓度为4-10％，海藻酸钠的浓度为0.4-2％；所述的饱和硼酸溶液中含有2％氯化钙，其pH值为5.0-6.0；接入米根霉孢子悬液与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的体积比为1∶2-10；磷酸二氢钠溶液的浓度是0.2-0.4mol/L，浸泡处理时间是0.5-2小时。

所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：米根霉孢子悬液中聚乙烯醇的浓度为6％，海藻酸钠的浓度为0.8％；接入米根霉孢子悬液与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的体积比为1∶3.3；磷酸二氢钠溶液的浓度是0.3mol/L，浸泡处理时间是0.5-1小时。

所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：固定化颗粒于4℃下硬化24小时。

所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：得到的聚乙烯醇固定化米根霉细胞进行增殖培养生长后，用蒸馏水洗净，用于L-乳酸的分批和重复分批发酵的具体步骤是：

(1)增殖固定化米根霉细胞：增殖培养基中接入20％(v/v)固定化细胞，增殖条件为150r/min，37℃下增殖24小时；

(2)接种量的确定：接种量为20％(v/v)；

(3)发酵温度确定：发酵温度为38℃；

(4)重复分批发酵：将上批固定化米根霉细胞用蒸馏水洗净，转入新鲜发酵培养基中用于下批发酵，可重复发酵，产酸100～106g/L。

海藻酸钠可解决聚乙烯醇结块成团的问题，得到球状颗粒，磷酸盐与聚乙烯醇的酯化反应使得颗粒结构更加坚固，同时磷酸盐能破坏颗粒中的海藻酸钙，可以扩大凝胶孔径，提高通透性。

本发明固定化方法简单可行，可提高L-乳酸产量并且将来便于用于工业上连续化生产的发酵工艺，克服了传统米根霉发酵生产L-乳酸存在的问题：1、由于米根霉菌丝比较发达，在通常的搅拌发酵罐中容易纠结成团和缠住搅拌轴，从而增加了传质阻力和动力消耗；2、游离菌不利于分批发酵或者是连续发酵，并且在分批接菌的过程中容易染菌；3、聚乙烯醇固定化细胞在用碳酸钠或氢氧化钠作为中和剂的发酵体系中保持稳定，解决传统的碳酸钙作为中和剂时制取乳酸所造成的污染。

与现有技术相比，本发明所提供的这种改进方法具有下列特点：

(1)、机械强度高，聚乙烯醇制得的颗粒易结块，而本发明的聚乙烯醇和海藻酸钠混合液制成的珠体效果佳；

(2)、产酸量高，与游离细胞发酵相比，在投糖15％的情况下，L-乳酸产量提高了20％，产量达到106.48g/L；

(3)、产酸速率快，用磷酸二氢钠处理后的固定化细胞产乳酸的速率提高到2.74g/L·h，发酵时间比未处理的固定化细胞发酵缩短了一半；

(4)、重复使用效果好，本发明的固定化细胞可以在不含氮源的新鲜培养基中反复使用14次，产乳酸的活性保持稳定。

具体实施方式

用无菌水将斜面上的米根霉孢子洗下，用玻璃珠打散，制得孢子悬液。称取海藻酸钠(化学醇)、聚乙烯醇(聚合度，1750)用50mL无菌水沸水浴加热溶解，灭菌后加入15mL孢子悬液，混匀，滴入含2％氯化钙的饱和硼酸溶液(pH为5.0-6.0)中，并用磁力搅拌器不停搅拌。固定化颗粒在4℃固化24小时，然后用蒸馏水洗净后，浸在0.3mol/L磷酸二氢钠溶液中0.5-1小时。得到的固定化细胞在37℃，150r/min的条件下增殖培养24小时，转入新鲜的发酵培养基(15％葡萄糖)中用于L-乳酸发酵。摇瓶发酵条件是50mL发酵培养基中接入10mL固定化细胞，在38℃，170r/min下培养36小时；在鼓泡式发罐中的发酵条件为pH＝6.0、38℃、1.0vvm，接种量为20％(v/v)。将发酵液稀释到合适的浓度，用生物传感仪测定出残糖和乳酸产量。摇瓶实验表明，固定化细胞产酸活性高，L-乳酸产量达106.48g/L，固定化颗粒活性高，能重复使用14批。在以碳酸钠或氢氧化钠为中和剂的发酵条件下，固定颗粒强度高，球形规则，没有颗粒破裂细胞泄漏的情况发生。

Claims (3)

1.一种聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：将聚乙烯醇和海藻酸钠于沸水浴加热共溶于水，与米根霉孢子悬液混合，将混合液滴入含有2％氯化钙的饱和硼酸溶液中，同时不停搅拌，使颗粒成球形，好的固定化颗粒于低温下硬化，然后用磷酸二氢钠溶液浸泡处理，然后用水洗涤除去颗粒内生成的海藻酸钙，得到的聚乙烯醇固定化米根霉细胞进行增殖培养生长后，用蒸馏水洗净，用于L-乳酸的分批和重复分批发酵，米根霉孢子悬液中聚乙烯醇的浓度为6％，海藻酸钠的浓度为0.8％；接入米根霉孢子悬液与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的体积比为1∶3.3；磷酸二氢钠溶液的浓度是0.3mol/L，浸泡处理时间是0.5-1小时。

2.按照权利要求1所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：固定化颗粒于4℃下硬化24小时。

3.根据权利要求1所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：得到的聚乙烯醇固定化米根霉细胞进行增殖培养生长后，用蒸馏水洗净，用于L-乳酸的分批和重复分批发酵的具体步骤是：

(1)增殖固定化米根霉细胞：增殖培养基中接入20％(v/v)固定化细胞，增殖条件为150r/min，37℃下增殖24小时；

(2)接种量的确定：接种量为20％(v/v)；

(3)发酵温度确定：发酵温度为38℃；

(4)重复分批发酵：将上批固定化米根霉细胞用蒸馏水洗净，转入新鲜发酵培养基中用于下批发酵，可重复发酵，产酸100～106g/L。