CN101153297A - 米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度l-乳酸新工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L－乳酸新工艺方法，涉及如下步骤：(1)制备高密度高活性米根霉孢子乳悬液，(2)米根霉菌球体细胞无菌转接至500L机械搅拌罐的扩培，(3)500L罐单罐首批发酵，(4)500L罐单罐重复发酵，(5)500L罐单罐连续进行15批次半连续高强度发酵。本发酵工艺方法中悬浮培养体系所形成菌球体的形状规则、大小较均一；能够成功实现反复发酵，节约菌体消耗的N源及其它无机盐，降低发酵成本；其发酵周期短，发酵强度大，适于工业生产；所形成的产物L－乳酸光学纯度均在99.5％以上，满足食品医药要求，完全适于制备高质量聚L－乳酸。
Description
技术领域
本发明涉及霉菌发酵L-乳酸的新工艺，更具体地说是利用米根霉细胞在搅拌培养体系中具有聚集、凝絮形成菌丝球的倾向形成菌球体，进而通过菌球体反复发酵，从而实现米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸的新工艺，属于微生物与发酵工程领域。
背景技术
乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，它的用途极为广泛。乳酸、乳酸盐及其衍生物广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领域。人体中只含有L-乳酸脱氢酶，只能代谢L-乳酸。L-乳酸在食品工业中的使用是绝对安全的，因此世界卫生组织提倡在食品及医药行业使用L-乳酸取代目前广泛使用的DL-乳酸。L-乳酸的聚合物——聚L-乳酸(PLA)是无毒高分子化合物，具有生物相容性，聚L-乳酸是良好的绿色材料，对消除“白色污染”具有极其重要的意义。
在众多的产乳酸微生物中，米根霉(Rhizopus oryzae/AS 3.819)由于具有产物光学纯度高、营养消耗简单、产物易于分离等特点而成为生产高光学纯度L-乳酸的理想菌株，但是由于发酵工艺控制方面技术不成熟，工业生产受阻。
菌球体连续发酵与传统分批游离发酵相比，利用菌球体自固定技术具有细胞负荷高、生物催化高效、细胞可反复使用等优点，并可得到高的目标产量和原料转化率，易于实现细胞与产物分离，有利于实现工艺过程的自动化、连续化，降低生产成本，具体表现在：(1)生物反应器中可以获得极高的菌体浓度，因而发酵速率可以大大提高，反应器设备的生产强度得以强化；(2)产物分离纯化过程中菌体从发酵液中的分离十分容易；(3)菌球体细胞可以重复或长期使用，这样既能够简化游离细胞过程需要不断培养菌体的操作，又减少了营养物质的浪费，提高了生产率。
在连续或半连续发酵工艺中，产物和菌体的分离常常是发酵成败的关键和难点，通过控制菌球粒径大小，减轻菌液分离负担，有利于成功实现连续或半连续发酵。米根霉深层发酵生产L-乳酸过程中，菌体形态复杂，多以丝状、片状、球体、团状、絮状、结块等形态生长。米根霉菌体形态强烈的影响着发酵过程中传质、溶氧等性能，对其有效的控制是发酵成功的关键因素之一。因此在控制菌球形态基础上成功实现半连续高强度发酵对L-乳酸产业意义重大。
发明内容
本发明旨在提供一种运行成本低、发酵强度高、适于工业化生产的米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法。
实现上述目的具体工艺步骤如下：
米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法包括如下工艺步骤：
A、制备高密度高活性米根霉孢子乳悬液：
将米根霉孢子接种于10L机械搅拌发酵罐的液体培养基中，温度为32℃，通气流量2.0L/(L·min)，搅拌线速度2.4m/s，培养24小时，得到形态规则、颗粒均匀的高密度高活性米根霉菌球体细胞；
其液体培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸二氢钠0.3g/L，硫酸锌0.44g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.01g/L；液体培养基体积为7.5L；
B、米根霉菌球体细胞的扩培：
将10L高密度高活性米根霉菌球体细胞无菌转接至500L机械搅拌罐的液体培养基中，温度为32℃，增大通气流量至3.0L/(L·min)，增大搅拌线速度至3.6m/s，24小时实现菌球体细胞的更新与扩培，菌球体密度超过104个/L，制得500L罐的米根霉菌球体细胞；
其液体培养基同A步骤中的液体培养基；
C、500L罐单罐首批发酵：
将上述制得的500L罐米根霉菌球体细胞，在温度为32℃、控制通气2.0L/(L·min)条件下，培养24小时至44小时，通过流加中和剂氢氧化钙控制发酵液pH为5.5，发酵结束后正压放料375L，截流米根霉菌球体，首批罐发酵得产物L-乳酸，浓度112g/L；
D、500L罐单罐重复发酵：
向含有截流米根霉菌球体的500L罐体内正压补入新培养基375L，在0小时至4小时内，通气和线速度分别为3.0L/(L·min)和3.6m/s，在其后的20小时内，通气和线速度分别为2.0L/(L·min)和2.4m/s，发酵结束后无菌正压放料375L，截流米根霉菌球体，得发酵产物L-乳酸，浓度113g/L；
新培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L，硫酸铵0.5g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，磷酸二氢钠0.05g/L，硫酸锌0.04g/L，硫酸镁0.02g/L，硫酸亚铁0.01g/L，新培养基体积为375L；
E、500L罐单罐连续进行15批次的半连续高强度发酵：
连续进行15批次的与D步骤相同单罐半连续发酵，每次重复发酵的装液系数为0.75，每次无菌正压放料排出发酵液375L，再向罐内正压补入新培养基375L；15批次的重复发酵过程中，培养基和培养条件均同步骤D；发酵结束后得发酵产物L-乳酸，其浓度为113g/L；
每批次产酸稳定在110g/L以上，发酵强度稳定在4.50g/(h·L)以上，细胞活力保持在90％以上，得到光学纯度在99.5％以上的L-乳酸。
本发明发酵工艺与常规米根霉间歇式分批发酵工艺相比，有益技术效果体现在以下几个方面：
(1)、本发酵工艺方法中悬浮培养体系所形成菌球体的形状规则、大小较均一，菌球体的平均粒径控制在0.5mm至3.0mm的范围内；细胞集聚成菌球体的条件温和、可控。
(2)、米根霉无载体固定化细胞培养可以在生物反应器中逐级扩大培养，不产生细胞固定化过程的附加成本。
(3)、能够成功实现反复发酵，节约菌体消耗的N源，降低发酵成本。
(4)、在反复发酵过程中，在24小时内产物乳酸浓度超过110g/L，发酵周期短，发酵强度大，适于工业生产。
(5)、所形成的产物L-乳酸光学纯度均在99.5％以上，满足食品医药要求，完全适于制备高质量聚L-乳酸。
附图说明
图1为米根霉半连续发酵菌球体细胞。通过图中可以看出菌球体呈现形状规则、大小均一的特征。
图2为米根霉菌球体从第11批次到第15批次的半连续重复发酵产L-乳酸情况。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。
实施例：
米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法包括如下工艺步骤：
(1)米根霉孢子的准备
将米根霉菌株(Rhizopus oryzae/AS 3.819)划线接种于马铃薯葡萄糖(PDA)平板，第一天设置培养温度为32℃，相对培养湿度70％，利于菌丝生长，第二天设置培养温度为34℃，相对培养湿度为30％，利于孢子生成，待黑色浓密孢子完全覆盖白色菌丝后即可准备收集，制得成熟米根霉孢子。
(2)制备高密度高活性米根霉孢子乳悬液：
将米根霉孢子刮洗至无菌水中，之后接种于带有直板式搅拌浆的10L发酵罐中，温度为32℃，罐内培养基采用：葡萄糖120g/L，硫酸铵((NH4)2SO4)4g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.3g/L，磷酸二氢钠(NaH2PO4)0.3g/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.44g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25g/L，硫酸亚铁(FeSO4)0.01g/L。利用血球计数板计数确保接种后的发酵罐中的孢子乳悬液浓度超过106个/mL。控制通气流量2.0L/(L·min)，搅拌线速度2.4m/s，培养24小时得到形态规则、颗粒均匀的米根霉菌球体。制得10L罐的高密度高活性米根霉菌球体细胞，见图1。
(3)米根霉菌球体细胞的扩培：
将10L罐内的培养基全部无菌转接至500L机械搅拌罐，培养基同步骤(2)，温度为32℃，增大通气流量至3.0L/(L·min)，增大搅拌线速度至3.6m/s，约24小时实现菌球体细胞的更新与扩培，菌球体密度超过104个/L。制得500L罐的米根霉菌球体细胞。
(4)500L罐单罐首批发酵：
针对500L罐的米根霉菌球体细胞进行继续培养，培养24小时至44小时范围，控制通气2.0L/(L·min)，通过流加中和剂氢氧化钙控制发酵液pH为5.5，发酵结束后通过罐体内置的旋转滤器无菌正压放料375L，截流米根霉菌球体。首批罐发酵得产物L-乳酸112g/L。
(5)500L罐单罐重复发酵：
通过无菌补料管连接，将另一罐内375L无菌新培养基采用正压方式，向含有上述截流米根霉菌球体的罐体进行无菌补料。温度为32℃，在0小时至4小时内，分别调节通气和线速度为3.0L/(L·min)和3.6m/s，在其后的20小时内，分别调节通气和线速度为2.0L/(L·min)和2.4m/s，新培养基采用：葡萄糖120g/L，硫酸铵((NH4)2SO4)0.5g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.05g/L，磷酸二氢钠(NaH2PO4)0.05g/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.04g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02g/L，硫酸亚铁(FeSO4)0.01g/L，发酵结束后通过罐体内置旋浆过滤器无菌正压放料375L，截流米根霉菌球体。得发酵产物L乳酸浓度113g/L。
(6)500L罐单罐连续进行15批次半连续高强度发酵：
连续进行15批次的单罐半连续重复发酵，即：每批次发酵结束后，采用无菌正压将375L的液体发酵培养基排出，之后通过无菌补料管连接，将另一罐内新培养基采用正压，向含有截流米根霉菌球体的罐体进行无菌补料375L。
在0小时至4小时内，分别调节通气和线速度为3.0L/(L·min)和3.6m/s，在其后的20小时内，分别调节通气和线速度为2.0L/(L·min)和2.4m/s，发酵结束后通过罐体内置旋浆过滤器无菌正压放料，得发酵产物L乳酸。
在15批次的重复发酵过程中，培养基和培养条件均同步骤(5)，装液系数为0.75，每次排出发酵液约370L。
对每次排出的370L发酵培养基检测表明，L-乳酸的浓度稳定在110g/L以上，残糖低于0.2％，发酵液中游离菌体及蛋白浓度低于0.2％，发酵强度稳定在4.50g/(h·L)以上，细胞活力保持在90％以上，完全实现了米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵，所得L-乳酸转化率90％以上，光学纯度在99.5％以上。
从图2中可以看出在最后持续5个批次发酵过程中，米根霉菌球体仍能保持较高发酵强度。
Claims (1)
1.米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、制备高密度高活性米根霉孢子乳悬液：
将米根霉孢子接种于10L机械搅拌发酵罐的液体培养基中，温度为32℃，通气流量2.0L/(L·min)，搅拌线速度2.4m/s，培养24小时，得到形态规则、颗粒均匀的高密度高活性米根霉菌球体细胞；
其液体培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸二氢钠0.3g/L，硫酸锌0.44g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.01g/L；液体培养基体积为7.5L；
B、米根霉菌球体细胞的扩培：
将10L高密度高活性米根霉菌球体细胞无菌转接至500L机械搅拌罐的液体培养基中，温度为32℃，增大通气流量至3.0L/(L·min)，增大搅拌线速度至3.6m/s，24小时实现菌球体细胞的更新与扩培，菌球体密度超过104个/L，制得500L罐的米根霉菌球体细胞；
其液体培养基同A步骤中的液体培养基；
C、500L罐单罐首批发酵：
将上述制得的500L罐米根霉菌球体细胞，在温度为32℃、控制通气2.0L/(L·min)条件下，培养24小时至44小时，通过流加中和剂氢氧化钙控制发酵液pH为5.5，发酵结束后正压放料375L，截流米根霉菌球体，首批罐发酵得产物L-乳酸，浓度112g/L；
D、500L罐单罐重复发酵：
向含有截流米根霉菌球体的500L罐体内正压补入新培养基375L，在0小时至4小时内，通气和线速度分别为3.0L/(L·min)和3.6m/s，在其后的20小时内，通气和线速度分别为2.0L/(L·min)和2.4m/s，发酵结束后无菌正压放料375L，截流米根霉菌球体，得发酵产物L-乳酸，浓度113g/L；
新培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L，硫酸铵0.5g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，磷酸二氢钠0.05g/L，硫酸锌0.04g/L，硫酸镁0.02g/L，硫酸亚铁0.01g/L，新培养基体积为375L；
E、500L罐单罐连续进行15批次的半连续高强度发酵：
连续进行15批次的与D步骤相同单罐半连续发酵，每次重复发酵的装液系数为0.75，每次无菌正压放料排出发酵液375L，再向罐内正压补入新培养基375L；15批次的重复发酵过程中，培养基和培养条件均同步骤D；发酵结束后得发酵产物L-乳酸，其浓度为113g/L；
每批次产酸稳定在110g/L以上，发酵强度稳定在4.50g/(h·L)以上，细胞活力保持在90％以上，得到光学纯度在99.5％以上的L-乳酸。
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