CN100590191C - 米根霉无载体固定化细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了米根霉无载体固定化细胞培养方法，步骤如下：(1)进行高浓度孢子接种，形成浓的孢子悬乳液；(2)控制通气条件，生成一定数量的菌球体；控制培养基中钠与钾离子比例，使米根霉菌丝球扩增、保持细胞形态稳定；添加甲基硅油材料，形成一定直径的菌球体细胞；菌球体截流，得米根霉无载体固定化细胞；(3)获得的菌球体转接大罐时，控制其菌球体的更新与数目的扩增。本发明的优点在于：①悬浮培养体系中所形成菌球体的形状规则、大小较均一，②细胞集聚成菌球体的条件温和可控，③菌球体细胞密度大于104个/L，细胞活力大于95%，④容易实现大规模培养，⑤可节约大量固定化载体成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物与细胞工程技术领域，具体地说是利用米根霉细胞在搅拌培养体系中具有聚集、凝絮形成菌丝球的倾向，不借助细胞固定化介质而实施米根霉无载体固定化细胞培养的方法。
背景技术
作为重要的有机酸之一，乳酸广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领域。L-乳酸在食品工业中的使用是绝对安全的，因此世界卫生组织提倡在食品及医药行业使用L-乳酸取代目前广泛使用的DL-乳酸。L-乳酸的聚合物——聚L-乳酸(PLA)是无毒高分子化合物，具有生物相容性，聚L-乳酸是良好的绿色材料，对消除“白色污染”具有极其重要的意义。因此近年来L-乳酸的生物转化逐渐受到人们的重视。在众多的产乳酸微生物中，米根霉(Rhizopus oryzae)由于具有营养消耗简单、产物易于分离等特点而成为生产高光学纯度L-乳酸的理想菌株，但是由于细胞培养控制方面技术不成熟，工业生产受阻。
固定化细胞培养(cell immobilization culture)是20世纪50年代兴起的一种新型生物技术，是指利用物理或化学手段将游离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并可反复使用的一种技术。与传统分批游离发酵相比，利用固定化微生物技术具有细胞负荷高、生物催化高效、细胞可反复使用等优点，并可得到高的目标产量和原料转化率，易于实现细胞与产物分离，有利于实现工艺过程的自动化、连续化，降低生产成本，具体表现在：(1)生物反应器中可以获得极高的菌体浓度，因而发酵速率可以大大提高，反应器设备的生产强度得以强化；(2)产物分离纯化过程中菌体从发酵液中的分离十分容易；(3)固定化细胞可以重复或长期使用，这样既能够简化游离细胞过程需要不断培养菌体的操作，又减少了营养物质的浪费，提高了生产率。
在各种固定化技术中，天然高分子和合成高分子材料的吸附和包埋是研究最为活跃的微生物细胞固定化方法，米根霉的固定化发酵方面也是如此。米根霉的固定化方法主要有聚氨酯泡沫吸附法和海藻酸钙微胶囊法等。
固定化细胞技术与游离细胞过程相比具有多方面的突出优点。然而，传统的固定化细胞技术均通过使用各种载体材料，以包埋、吸附、交联等方式实现细胞固定化。载体材料的使用随之带来了许多细胞生理、生态、工艺、工程和经济方面的问题，主要体现在：(1)在生理方面，载体材料有时会对细胞产生比较大的生理毒性，影响目标代谢产物的生物合成；(2)在生态方面，载体材料使细胞或小细胞群体相互分隔，容易形成不利于细胞之间彼此协调的环境，影响代谢产物的生物合成；(3)在工艺方面，载体固定化细胞的大规模制备过程复杂，容易引起杂菌污染；(4)在工程方面，一方面载体固定化细胞的传质性能较差，外部营养基质和内部代谢产物浓度梯度较大，致使其整体活性较低，另一方面生物反应器中流体流动的冲刷和代谢过程内部产生气体的胀裂还会造成载体固定化细胞的破裂，影响其连续使用的寿命；(5)在经济方面，载体材料的使用和不断消耗带来了附加成本，使固定化细胞技术难以在传统的发酵工业中推广应用。因此，载体固定化细胞技术虽然已有近四十年的研究历史，真正实现大规模工业化成功应用的实例却不多。
基于以上问题，人们提出了无载体固定化细胞技术(cell self-immobilizedculture)。无载体固定化即利用细胞自絮凝形成的颗粒作为一种固定化细胞的方法，是固定化细胞技术中全新的概念。与各种载体固定化细胞技术相比，这种无载体固定化细胞技术具有非常突出的优点，主要体现在：(1)细胞的固定化方法非常简单，可以在生物反应器中逐级扩大培养，不产生细胞固定化过程的附加成本；(2)不使用细胞生长和代谢产物生物合成所需营养物质以外的其它任何化学物质，细胞的生理和生态环境不受外来物质的干扰和影响，有利于目标代谢产物的顺利合成；(3)自絮凝细胞颗粒内部结构呈松散型，传质阻力很小，而且其颗粒内部表面不断自我更新，颗粒整体活性非常好；(4)在生物反应器中一定的生理、生态、物理、化学和流体力学条件下，小颗粒的絮凝和大颗粒的解离可以呈动态平衡，不存在载体固定化细胞的强度问题。综上所述，无载体固定化技术具有操作简便、不消耗辅助材料、无附加成本、反应器中菌体浓度高、发酵强度大、连续使用寿命长等优点，展示了良好的工业化应用前景。
巴斯德(Louis Pasteur)最先在酵母培养中观察到了凝絮作用，其现象是悬浮于液体中的单细胞集成絮凝物或丝状物，然后出现沉淀或漂浮。20世纪80年代初，K.Esser等人率先提出利用某些具有强自身絮凝能力的菌株形成颗粒，以此作为一种固定化细胞的方法，即利用细胞自絮凝形成的颗粒作为一种固定化细胞的无载体固定化细胞。近年来，微生物絮凝的研究日益受到重视，这主要是由于在液体深层发酵后期，菌种良好的絮凝性不仅可使发酵液澄清速度加快，提高细胞分离的性能，而且还可防止细胞自溶，因此细胞絮凝性是评价菌种优劣的一个重要指标。
米根霉深层发酵生产L-乳酸过程中，菌体形态复杂，多以丝状、片状、球体、团状、絮状、结块等形态生长。米根霉菌体形态强烈的影响着发酵过程中传质、溶氧等性能，对其有效的控制是发酵成功的关键因素之一。因此对米根霉细胞进行无载体固定化细胞培养具有重要理论和现实意义。
发明内容
本发明的目的是：提供一种利用霉菌细胞在搅拌培养体系中具有聚集、凝絮形成菌丝球的倾向，通过控制菌丝球的形成及其粒径分布，起到类似于载体固定化培养的目的，米根霉无载体固定化细胞培养方法。
实现上述目的具体的发明方法如下：
所用菌种为适合产高光学纯度L-乳酸的米根霉真菌(Rhizopus oryzae/AS 3.819)，米根霉(Rhizopus oryzae/AS 3.819)由于具有产物光学纯度高、营养消耗简单、产物易于分离等特点而成为生产高光学纯度L-乳酸的理想菌株。所有原始孢子均为该菌株培养成熟所得。
所有发酵培养体系均采用机械搅拌罐，且选用直板搅拌桨，生物反应器内置旋转滤器。
取250mL三角瓶内马铃薯葡萄糖(PDA)培养基斜面上生长2天的浓密黑色孢子，采用无菌水制备孢子悬液，无菌接种于5L机械搅拌罐中，温度为32℃，罐内培养基采用：葡萄糖120g/L，硫酸铵((NH4)2SO4)4g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.3g/L，磷酸二氢钠(NaH2PO4)0.3g/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.44g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25g/L，硫酸亚铁(FeSO4)0.01g/L，装液系数为0.75，发酵液总体积为3.75L。
确定孢子浓度超过106个/mL；控制2.0L/(L·min)通气流量，促进生成一定数量的菌球体；控制搅拌转速为400转/min，通过钠与钾离子比例为1∶1，有利于维持细胞稳态，并控制约105个孢子形成一个菌球体；待菌球体密度接近104个/L时，调控转速为800转/min，并无菌添加1g/L的甲基硅油材料，促使形成菌球体的形状规则、大小较均一，菌球体的平均粒径控制在0.5mm至3.0mm的范围内，且呈正态分布。
将形状规则、粒径均一，平均粒径在0.5mm至3.0mm范围内的菌球体从5L罐中无菌转接入50L罐内，50L罐的培养基与5L罐的培养基成分相同，且装液系数均为0.75，迅速增加转速至1200转/min，增加通气流量至3.0L/(L·min)，培养基与5L罐一致，在第12小时实现菌球体的更细与10倍的扩培，菌球体粒径均匀，呈正态分布，且密度约范围内，球体密度约104个/L。制得50L适于规模化反复发酵的米根霉无载体固定化细胞。
本发明的米根霉无载体固定化细胞培养方法与常规米根霉培养方法相比，有益技术效果体现在五个方面：
(1)米根霉无载体固定化细胞培养可以在生物反应器中逐级扩大培养，不产生细胞固定化过程的附加成本。
(2)不使用细胞生长和代谢产物生物合成所需营养物质以外的其它任何化学物质，细胞的生理和生态环境不受外来物质的干扰和影响，有利于目标代谢产物的顺利合成。
(3)本方法中悬浮培养体系所形成菌球体的形状规则、大小较均一，菌球体的平均粒径控制在0.5mm至3.0mm的范围内；细胞集聚成菌球体的条件温和、可控。
(4)菌球体细胞密度大于104个/L，细胞活力大于95％，发酵强度大，易于反复使用，适于工业生产。
(5)发酵产物L-乳酸光学纯度均在99.5％以上，满足食品医药要求，完全适于制备高质量聚L-乳酸。
附图说明
图1为米根霉无载体固定化细胞，通过图中可以看出菌球体呈现形状规则、大小均一的特征。
图2为不同平均直径的菌球体颗粒正态分布图，平均直径以0.4mm为间隔取近似值，其中菌球体直径在X±0.2mm范围内的默认其直径值为X，误差项为人工计算百分比误差，通过图中可以看出菌球体颗粒呈现正态分布。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例：
米根霉无载体固定化细胞培养步骤如下：
(1)米根霉孢子的准备
将米根霉菌株米根霉真菌(Rhizopus oryzae/AS 3.819)划线接种于马铃薯葡萄糖(PDA)平板，第一天设置培养温度为32℃，相对培养湿度70％，利于菌丝生长，第二天设置培养温度为34℃，相对培养湿度为30％，利于孢子生成，待黑色浓密孢子完全覆盖白色菌丝后即可准备收集，制得成熟米根霉孢子。
(2)米根霉孢子乳悬液的制备
将250mL三角瓶内的所有米根霉孢子全部刮洗至无菌水中，之后接种于带有直板式搅拌桨的5L发酵罐中，罐内培养基采用：葡萄糖120g/L，硫酸铵((NH4)2SO4)4g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.3g/L，磷酸二氢钠(NaH2PO4)0.3g/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.44g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25g/L，硫酸亚铁(FeSO4)0.01g/L，装液系数为0.75，发酵液总体积为3.75L。利用血球计数板计数确保接种后的发酵罐中的孢子乳悬液浓度超过106个/mL。其中钠与钾离子比例为1∶1有利于维持细胞稳态。制得米根霉孢子乳悬液。
(3)米根霉无载体固定化细胞的培养调控
温度为32℃，刚开始米根霉孢子乳悬液中菌球体数目几乎为零，孢子浓度约106个/mL，此时控制2.0L/(L·min)通气流量，控制搅拌转速为400转/min，且培养基中的钠与钾离子比例为1∶1，有利于菌球体数量的扩增。在培养至12小时的时候，菌丝球浓度约为103个/L，此时若不增加转速，则菌球体直径会急剧上升，且数目不增，因此调控转速为800转/min，控制约105个孢子形成一个菌球体，菌球体密度接近104个/L。在第20小时至第24小时的培养过程中，无菌添加约4.0g的甲基硅油材料，使其浓度约1.0g/L，促使形成菌球体的形状规则、大小较均一，菌球体的平均粒径控制在0.5mm至3.0mm的范围内，球体密度约104个/L，且颗粒直径呈正态分布。制得较适于反复发酵的米根霉无载体固定化细胞。
(4)米根霉无载体固定化细胞的扩培
采用无菌接种管，将形状规则、粒径均一，平均粒径在0.5mm至3.0mm范围内的菌球体从5L罐中无菌转接入50L罐内，温度为32℃，50L罐的培养基与5L罐的培养基成分相同，且装液系数均为0.75，迅速增加转速至1200转/min，增加通气流量至3.0L/(L·min)，培养基与5L罐一致，在第12小时实现菌球体的更细与10倍的扩培，菌球体粒径均匀，呈正态分布，且密度约范围内，球体密度约104个/L。制得50L适于规模化反复发酵的米根霉无载体固定化细胞，见图1和图2。
Claims (1)
1、米根霉无载体固定化细胞培养方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)米根霉孢子的准备
将米根霉菌株(Rhizopus oryzae)AS 3.819划线接种于马铃薯葡萄糖PDA平板，第一天设置培养温度为32℃，相对培养湿度70％；第二天设置培养温度为34℃，相对培养湿度为30％，待黑色浓密孢子完全覆盖白色菌丝后即可准备收集，制得成熟米根霉孢子；
(2)米根霉孢子乳悬液的制备
将250mL三角瓶斜面上的所有米根霉孢子刮下接种于带有直板式搅拌桨的5L发酵罐中，利用血球计数板计数确保接种后的发酵罐中的孢子乳悬液浓度超过106个/mL，其中钠离子与钾离子比例为1∶1，制得米根霉孢子乳悬液；
罐内培养基由下列重量配比的原料组成：葡萄糖120g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸二氢钠0.3g/L，硫酸锌0.44g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.01g/L，罐内装液体总体积为3.75L，装液系数为0.75；
(3)米根霉无载体固定化细胞的培养调控
上述米根霉孢子乳悬液，在温度为32℃、通气流量2.0L/(L·min)、搅拌转速为400转/min、且培养基中的钠离子与钾离子比例为1∶1条件下培养，培养至12小时的时候，菌丝球浓度约为103个/L；此时增加转速为800转/min，控制约105个孢子形成一个菌球体，菌球体密度接近104个/L；在第20小时至第24小时的培养过程中，无菌添加4.0g的甲基硅油材料，使其浓度为1.0g/L，促使形成菌球体的形状规则、大小较均一，菌球体的平均粒径控制在0.5mm至3.0mm的范围内，球体密度104个/L，且颗粒直径呈正态分布，制得适于反复发酵的米根霉无载体固定化细胞；
(4)米根霉无载体固定化细胞的扩培
将形状规则、粒径均一，平均粒径在0.5mm至3.0mm范围内的米根霉无载体固定化细胞从5L罐中无菌转接入50L罐内，装液系数均为0.75，50L罐的培养基与5L罐的培养基成分相同，在温度为32℃、转速至1200转/min、通气流量为3.0L/(L·min)条件下培养，在第12小时实现菌球体10倍的扩培，菌球体粒径均匀，呈正态分布，且密度约范围内，球体密度104个/L，制得50L适于规模化反复发酵的米根霉无载体固定化细胞。
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