CN101869119A

CN101869119A - 一种生防菌微胶囊菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101869119A
Application number: CN 201010199846
Authority: CN
Inventors: 李华兴; 区伟佳; 冯宏; 赵兰凤; 张志红; 王荣
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2010-10-27

Abstract

本发明公开了一种生防菌微胶囊菌剂及其制备方法和应用。本发明所述生防菌是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。以解淀粉芽孢杆菌为主要有效成分制备得到的微胶囊菌剂生防菌总含量高达80～200亿CFU/g，水分含量在3～5质量％，杂菌率小于1‰，可以用于预防或治疗根腐病，特别对大豆根腐病有显著疗效。本发明采用微胶囊化技术将生防菌包裹在囊壁物质中制成微球体，可以降低施药量，节省了劳动且有掩盖忌避的作用。本发明微胶囊具有密度大、存活率高、稳定性佳，制备工艺先进，成本低廉等优点，实现了生产的低碳高效。

Description

一种生防菌微胶囊菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农用微生物领域，具体涉及一种生防菌微胶囊菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

根腐病在国内外大豆产区时有发生，是一种分布广、危害重、防治困难的世界性病害。此病的主要特点是分布广泛，国内主要分布在东北大豆产区、黄淮地区和部分华南大豆产区，传播方式为土传，危害较重，该病对大豆产量影响严重，给国家造成巨额经济损失。华南地区高温多雨的气候环境，多数大豆种植田土壤紧实粘重、偏酸等条件均有利于根腐病的发生，对于解决华南产区大豆根腐病的研究越来越受科研工作者的关注。

利用微生物及其代谢产物控制病原菌的生物防治方法，在国内外发展迅速。利用细菌防治植物病害主要优势在于：细菌的种类繁多数量巨大，对植物的生态比较适宜；细菌对病原菌的作用机制以通过竞争、拮抗和寄生、诱导植物产生抗性等方式产生影响；细菌具有惊人的繁殖速度；可以人工培养，便于控制，易于操作；其遗传和生化分析简单、容易产生大量的次生代谢物；有些细菌不仅能防病而且具有促生作用。目前研究最多的生防细菌是芽孢杆菌属(Bacillus spp.)和假单胞杆菌属(Pseudomonas spp.)。芽孢杆菌可以产生芽孢，抗恶劣环境能力强，繁殖速度快，营养要求简单，定殖性能好，具有以上特性的芽孢杆菌对于生防菌剂生产、储存都是十分有利的。生物防治是植物病害防治的必然趋势，比起化学防治方法来，其不污染环境、更安全。

微生物肥料具有较高技术含量，属于农业生物技术产业范畴。由于微生物肥料发展潜力巨大，微生物肥料生产企业不断涌现，但多数企业生产规模小，设备简陋，生产工艺落后，许多微生物肥料产品存在质量问题。微生物肥料的生产，目前较普遍采用的工艺有静态曝气、条形堆和发酵仓式。这类工艺的优点是所需设备简单，投资成本较低，操作工艺简单。缺点是占地面积大，人工、运费和维修费高，短期堆腐不足以达到腐熟，后熟期长；堆肥质量易受气候条件影响，需要频繁的监测，产品性能有潜在的不稳定性。翻堆造成氮的损失和臭味散失污染环境。微生物肥料质量和利润的提升，需要采用现代发酵工程和自动化技术。主要以提高产品中功能微生物浓度为目的，使用保护剂和保存性能好的包装材料，延长菌剂货架期。微生物菌剂企业生产需准确确定的运行参数量化指标，使生产走向自动化，工艺流程合理化，同时降低生产成本。重点以芽孢杆菌菌株为代表，研究其菌体高浓度的形成条件和障碍因子，通过代谢调控等手段，实现菌体数量提高。

目前农用微生物制剂仍存在活菌数含量相对偏低、后处理和加工工艺落后所制约。采用微胶囊化技术把生防菌包裹在囊壁物质中，制成几微米至几百微米的微球体，具有调节有效成分释放、降低施药量、防治漂移、节省人工、扩大防治幅度、使原来不能混用的药剂可以混用和掩盖忌避作用。通过调节芯材浓度更能使农用微生物产品的有效活菌数和保存时长达到采用一般的深层发酵无法达到的程度。采用微胶囊技术所制备的菌剂除了具有密度大，存活率高的特性外，储存和稳定性能同样优秀。

发明内容

本发明的目的在于根据现有农业生产中存在的根腐病分布广泛，对作物产量影响严重且防治困难的问题，提供一种用于治疗根腐病的生防菌微胶囊菌剂。

本发明另一目的在于提供上述生防菌微胶囊菌剂的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述生防菌微胶囊菌剂的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种生防菌，采用组织分离法从大豆植株根系内分离获得，经鉴定，该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

本发明生防菌菌株由常规液体培养基发酵制备。液体培养基配方按重量百分比计为：酵母浸出液0.1～0.3％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.2～0.5％，可溶性淀粉0.5～1.5％，pH 7.2～7.5，余量为水。

一种微胶囊菌剂，其主要有效成分为上述生防菌，其中，生防菌总含量达80～200亿CFU/g，水分含量在3～5质量％，杂菌率小于1‰。

上述微胶囊菌剂的制备方法是将生防菌离心得到细胞沉淀，配制工作液后进行喷雾干燥微胶囊化得到。

作为一种优选方案，所述工作液的配方按重量百分比计为：生防菌沉淀2～5％，麦芽糊精15～25％，阿拉伯胶0.5～1.5％，氯化钙0.05～0.1％，吐温-800.05～0.1％，余量为无菌水；将该体系混合乳化均匀。

作为一种优选方案，所述喷雾干燥微胶囊化的进风温度140～170℃，出风温度65～85℃，喷头压力0.1～0.15MPa，通针频率每30s/次，进料速度根据设备蒸发功率弹性调节，控制出风温度在规定范围。

本发明生防菌微胶囊菌剂可以用于预防或治疗根腐病，特别是大豆根腐病；还可将生防菌作为主要有效成分制备成微胶囊菌剂或粉剂来预防或治疗根腐病；所述粉剂的施用方法是按比例混合于腐熟有机肥，或溶解稀释后采用拌种、种子包衣、灌根及土壤处理。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明是国家自然科学基金“功能微生物和有机肥联合防治香蕉枯萎病机理研究”和广东省教育部产学研结合项目“隐性连作障碍研究及其专用生物肥研究”的主要内容。本发明提供了一种可用于预防或治疗根腐病的生防菌微胶囊菌剂，对大豆根腐病的防治效果尤为显著；本发明采用微胶囊化技术将生防菌包裹在囊壁物质中制成微球体，可以降低施药量，节省了劳动且有掩盖忌避的作用。本发明微胶囊菌剂具有密度大、存活率高、稳定性佳，制备工艺先进，成本低廉等优点，实现了生产的低碳高效。

附图说明

图1是制备微胶囊菌剂的喷雾干燥工艺流程；

图2是微胶囊菌剂显微图像(1000倍)；

图3是微胶囊菌剂对尖孢镰刀菌菌丝发育影响，其中左图为正常的菌丝体和孢子，右图为畸变的菌丝体。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1根内芽孢杆菌的分离

选取健康强壮大豆植株根系，表面消毒后，无菌状态置于灭菌研钵，加入适量LB培养基和灭菌石英砂，充分研磨后转入LB液体培养基中。150rpm培养30min，富集培养。取出，置于80℃恒温水浴10min。处理后培养液稀释成10倍，吸取0.1mL涂布LB平板，37℃培养48h后挑取形态不同、长势较好的菌落，划线纯化，保存备用。

实施例2生防细菌AF67(Bacillus amyloliquefaciens)的培养

菌种活化：保藏菌种转接斜面活化，37℃培养24h。

液体种子培养：斜面活化菌种转接一级种子瓶，37℃振荡(180rpm)培养24h。

发酵培养：按5％接种量接种，37℃振荡(180rpm)培养48～72h，菌浓度不低于10⁹CFU/g。

液体培养基配方如下：以重量百分比计，含有酵母浸出液0.3％，蛋白胨1.5％，葡萄糖0.5％，可溶性淀粉1.5％，pH 7.5，余量为水。

实施例3喷雾干燥微胶囊化工艺

培养好的发酵液经4000rpm离心15min，得到细胞沉淀，配制工作液后经喷雾干燥工艺制备微胶囊菌剂。工作液及喷雾干燥微胶囊化关键工艺参数如下：

工作母液配方如下：以重量百分比计，生防菌沉淀4％，麦芽糊精20％，阿拉伯胶0.5％，氯化钙0.1％，吐温-80 0.1％，pH7.2，余量为无菌水。体系混合乳化均匀。

喷雾干燥微胶囊化关键工艺参数如下：进风温度140℃，喷头压力0.15MPa，出风温度75℃，每30s通针1次(图1)。

实施例4微胶囊菌剂指标测定

按照GB 20287-2006农用微生物菌剂要求测定相关技术指标。测定结果如表1、图2。

表1大豆根腐微胶囊菌剂技术指标

实施例5生防菌AF67(Bacillus amyloliquefaciens)微胶囊颗粒对尖孢镰刀菌菌丝发育影响

将尖孢镰刀菌(F5)菌块(直径5mm)与AF67微胶囊菌剂0.1g加入50mL KB培养液中。28℃，150rpm培养3d。吸取少量培养液，显微镜下观察真菌菌丝的生长情况。对照为KB培养液接病原菌块。

KB培养液配方如下：以重量百分比计，蛋白胨2％，K₂HPO₄ 0.25％，MgSO₄0.15％，甘油0.1％，pH7.0，余量为水。

微胶囊生防菌剂与镰刀菌共培养后发现，能明显抑制病菌菌丝的生长(图3)。菌丝体局部明显膨大、肿胀，菌丝不发育，同时有畸形、断裂现象，菌丝体分隔数显著增多。细胞内含物大量凝聚，部分形成大且透明的空泡。与对照相比，经共培养的镰刀菌产孢量明显减少。

实施例6生防菌AF67(Bacillus amyloliquefaciens)微胶囊颗粒抑菌效果

称取1g微胶囊产品，采用稀释平板法，依次按10倍稀释率稀释，得到10^-6，10^-7的稀释液。分别吸取各稀释度的菌悬液0.1mL，加至制备好的PDA固体培养基平板上，用玻璃刮刀把菌悬液均匀地涂于平板表面。每一稀释度重复3次，并以无菌水作空白对照。

上述步骤操作完毕的平板中央接种经过活化的2种大豆根腐病原菌菌块(直径5mm)，28℃黑暗倒置培养12d后，测定抑菌效果。

结果显示：微胶囊生防菌剂稀释至10^-6，10^-7，培养12d后，PDA平板中央点接的病原菌生长明显受抑制，病原菌菌丝体相互扭结、凋谢，无法延伸。培养12d后，AF67对大豆根腐病原菌抑菌效果见表2。微胶囊菌剂在高稀释率下抑菌效果仍达70％以上。

表2微胶囊菌剂对大豆根腐病原菌的抑菌效果

Claims

1.一种生防菌微胶囊菌剂，其特征在于所述生防菌是采用组织分离法从大豆植株根系内分离获得的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

2.根据权利要求1所述的生防菌微胶囊菌剂，其特征在于所述微胶囊菌剂中，生防菌总含量达80～200亿CFU/g，水分含量在3～5质量％，杂菌率小于1‰。

3.权利要求1或2所述的生防菌微胶囊菌剂的制备方法，其特征在于所述生防菌经液体培养基发酵制备而得；将生防菌离心得到细胞沉淀，配制工作液后进行喷雾干燥微胶囊化得到用于治疗根腐病的生防菌微胶囊菌剂。

4.根据权利要求3所述的生防菌微胶囊菌剂的制备方法，其特征在于所述液体培养基的配方按重量百分比计为：酵母浸出液0.1～0.3％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.2～0.5％，可溶性淀粉0.5～1.5％，pH 7.2～7.5，余量为水。

5.根据权利要求3所述的生防菌微胶囊菌剂的制备方法，其特征在于所述工作液的配方按重量百分比计为：生防菌沉淀2～5％，麦芽糊精15～25％，阿拉伯胶0.5～1.5％，氯化钙0.05～0.1％，吐温-800.05～0.1％，余量为无菌水；将该体系混合乳化均匀。

6.根据权利要求3所述微胶囊菌剂的制备方法，其特征在于所述喷雾干燥微胶囊化的进风温度140～170℃，出风温度65～85℃，喷头压力0.1～0.15MPa，通针频率每30s/次。

7.权利要求1或2所述微胶囊菌剂在预防或治疗根腐病中的应用。

8.根据权利要求7所述微胶囊菌剂的应用，其特征在于所述根腐病是大豆根腐病。