CN111466413B - 一种栎属植物促根微生物微胶囊菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种栎属植物促根微生物微胶囊菌剂及其制备方法，其中微生物微胶囊菌剂活性成分为放射形根瘤菌、巨大芽孢杆菌、海水芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌，该微生物微胶囊菌剂常温储存时间长，菌体存活率较高，可以促进栎属植物的根长和根尖的生长；本发明采用喷雾干燥技术制备微生物微胶囊菌剂，生产过程设计合理保证了菌剂的洁净度和无菌性。

Description

一种栎属植物促根微生物微胶囊菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物有机肥技术领域，具体涉及一种栎属植物促根微生物微胶囊菌剂及其制备方法。

背景技术

广义的栎属(Quercus Fagaceae)包括青冈亚属(subgenus Cyclobalanopsis)和栎亚属(subg Quercus)，广泛分布于亚、非、欧、美等北半球的热带、亚热带和温带森林，其中的许多种类还是北半球森林的主要建群种和优势种，约有600种，中国有127种，过去人们对栎属树种的研究主要集中在经济价值方面，如木材利用，果实利用等方面。近年来，随着城市绿化品质的提升，一些乡土树种和国外新引进树种开始逐步在城市绿地中出现，人们开始重视栎属植物的园林应用价值，使栎属植物在城市绿地中的应用越来越丰富。现阶段，在我国城市绿地中应用较多的栎属树种主要有北美红栎、麻栎、弗吉尼亚栎、小叶青冈和细叶青冈等。

栎类植物人工造林生产实践中通常采用播种育苗，但是有研究表明部分栎属植物属于顽拗性种子，其萌发时间很长，萌发率较低，且难以保存母本的优良性状。自然条件下，最先出苗和后出苗的相差可达数周，出苗整齐性很差，而栎属植物的促根生物制剂在国内还是空白，因此栎属植物的微生物促根技术研究可以为栎属植物的园林推广和规模化造林提供技术支持。

微生物菌剂的开发与应用在当今国际农业发展过程中起着重要的作用，微生物菌剂具有长效、无污染、节约能源、成本低等特点。目前，微生物菌剂有液态和固态，液态微生物菌剂随着保藏时间的延长，菌种易受污染、退化；并且发酵前需要经过活化和扩大培养；与液态微生物菌剂相比，固态微生物菌剂可以直接投入使用，使用前不需要扩大培养，在运输和贮藏、质量控制等方面有其独特的优势。特别是微生物菌剂微胶囊剂型的开发也是其中的一个热点方向，微胶囊型菌剂能够减少外界环境对有效成分的影响，提高制剂的稳定性和活性，缓释延长制剂有效期。

但是由于微生物生长繁殖快、变异快的特点，使得促生菌的促根性能可能退化，并且促生菌使用时也受到地域性、作物种类和环境条件等的限制，因此，具有固氮、解磷、解钾等为作物提供大量微量元素或对作物具有促生功能的菌株的筛选是目前的重要工作。同时微胶囊结构中载体和壁材料的选择则决定着菌剂的菌含量和储藏时间，生产工艺的选择则影响着产物回收率生产效率，这些也是开发和利用微生物微胶囊结构菌剂的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种栎属植物促根微生物微胶囊菌剂及其制备方法，有效菌存活率≥94％，含水率≤3.47％，100目细度通过率≥98％，pH为6.81～7.10，对栎属植物的根长和根尖具有明显的促进作用，不受地域、作物种类和环境条件的影响，常温储存菌体存活率高，可以释放土壤中无机盐，为栎属植物的后续生长提供营养；生产过程设计合理，保证菌剂的洁净度与无菌性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种栎属植物促根微生物微胶囊菌剂，其各组分按重量百分比计包括：放射形根瘤菌液10～15％、巨大芽孢杆菌液10～15％、海水芽孢杆菌液10～15％、胶冻样类芽孢杆菌液10～15％、载体20～25％、壁材25～35％、保护剂9～18％、植物生长调节剂0.1～0.2％。

进一步，所述放射形根瘤菌液、巨大芽孢杆菌液、海水芽孢杆菌液和胶冻样类芽孢杆菌液中有效活菌数为1.0×10¹⁰～2.0×10¹¹cfu/g，杂菌数≤5％。

进一步，所述载体为白炭黑；所述壁材为玉米淀粉与阿拉伯树胶的混合物；所述保护剂为海藻糖、脱脂奶粉和甘油的混合物；所述植物生长调节剂为萘乙酸钠。

所述栎属植物促根微生物微胶囊菌剂的制备方法，其包括如下步骤：

1)种子液的制备：放射形根瘤菌、巨大芽孢杆菌、海水芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌分别接种于对应的种子培养基中，28～30℃、190～200r/min摇床培养12～14h，制备成种子液；

2)发酵：将步骤1)中制备得到的种子液，分别放入装有对应的发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，在发酵过程中，从发酵罐中取菌液，测量菌液中菌株类别及菌落数，当菌液中有效活菌数在1.0×10¹⁰～2.0×10¹¹cfu/g，杂菌数≤5％时，发酵完成；

3)制备曩芯：将步骤2)制备得到的各类菌液与载体均匀混合，使载体充分吸附菌体，将充分吸附菌体的载体作为囊芯；

4)糊化：向步骤3)中制备得到的曩芯中加入壁材、保护剂和植物生长调节剂，搅拌30～60min使其糊化；

5)成型：经过步骤4)糊化后的材料进行真空喷雾冷冻干燥，真空喷雾冷冻干燥结束后收集所得产物，即为栎属植物促根微生物微胶囊菌剂。

进一步，所述载体为白炭黑；所述壁材为玉米淀粉与阿拉伯树胶的混合物；所述保护剂为海藻糖、脱脂奶粉和甘油的混合物；所述植物生长调节剂为萘乙酸钠。

进一步，所述放射形根瘤菌的种子培养基为根瘤菌培养基、巨大芽孢杆菌的种子培养基为营养肉汁琼脂培养基、海水芽孢杆菌的种子培养基为LB培养基、胶冻样类芽孢杆菌的种子培养基为硅酸盐细菌培养基。

进一步，所述放射形根瘤菌的发酵培养基配方为：酵母提取物1～2g、甘露醇10～15g、KH₂PO₄ 0.5～1g、MgSO₄·7H₂0 0.2～0.4g、NaCl 0.1～0.2g、CaCl₂ 0.05～0.1g、蒸馏水1～1.1L、pH6.8～7.2；所述巨大芽孢杆菌的发酵培养基配方为：蛋白胨10～11g、牛肉浸出粉3～4g、NaCl 5～6g、KH₂PO₄ 0.5～1g、MnSO₄ 0.05～0.1g、蒸馏水1～1.1L、pH7.0～7.2；所述海水芽孢杆菌的发酵培养基配方为：蔗糖130～150g、蛋白胨2～3g、KH₂PO₄ 0.5～1g、Na₂HPO₄ 1.4～1.8g、NaCl 0.1～0.2g、蒸馏水1～1.1L、pH7.0～7.2；所述胶冻样类芽孢杆菌的发酵培养基配方为：蔗糖5～6g、Na₂HPO₄ 2～3g、MgSO₄·7H₂0 0.5～1g、(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.2g、CaCO₃ 0.1～0.2g、FeCl₃ 0.005～0.01g、土壤矿物1～2g、蒸馏水1～1.1L、pH7.0～7.2。

进一步，所述栎属植物促根微生物微胶囊菌剂直接施用于种植栎属植物的土壤中。

进一步，所述栎属植物促根微生物微胶囊菌剂直接应用于栎属植物的根和栎属植物的种子，具体应用方法为：将所述微生物微胶囊菌剂与水混合制成泥浆，将栎属植物种子或幼苗根系沾取泥浆，然后种植。

在本发明栎属植物促根微生物微胶囊菌剂中：

本发明所述微生物微胶囊菌剂中有效菌存活率≥94％，含水率≤3.47％，100目细度通过率≥98％，pH为6.81～7.10，对栎属植物的根长和根尖具有明显的促进作用，不受地域、作物种类和环境条件的影响，常温储存菌体存活率高，常温贮藏540d的菌体存活率≥86.13％，而现有的促根可湿性粉剂常温贮藏540d的菌体存活率只有20～65％。

海水芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌能够诱导栎属植物新根和不定根的生成，与放射形根瘤菌和胶冻样类芽孢杆菌协同起作用，促进植物种植土壤的稳定性，从而促进栎属植物根长和根尖生长；另外，该微生物微胶囊菌剂水分含量比较低，可以降低菌体的代谢，从而延长保存期，由于微胶囊结构囊芯被包覆而与外界环境隔离，从而增强了微生物微胶囊菌剂贮藏稳定性。

海水芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌产生的IAA吲哚乙酸和添加的萘乙酸钠诱导新根和不定根的形成，产生的ACC脱氨酶能裂解乙烯前体ACC，缓解由于植物高盐、干旱、水涝、重污染和病原菌等环境胁迫引起的乙烯局部增加，降低乙烯对根长、侧根的生长和根毛形成的抑制，促进了植物生长。

放射形根瘤菌和巨大芽孢杆菌代谢产生的多糖类物质是土壤重要的胶结剂，有利于土壤团聚体稳定性结构的形成，随着多糖含量的增加，黏粒含量相应减少而粒级的水稳性程度相应提高，使土壤力学稳定性、化学稳定性、水稳定性、酸碱稳定性和气体稳定性提高，从而为放射形根瘤菌、巨大芽孢杆菌、海水芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌的繁殖提供了稳定的环境，促进了菌种在土壤中快速建立稳定种群，发挥各自相应作用。

放射形根瘤菌可以固氮，巨大芽孢杆菌可以分解有机磷，胶冻样类芽孢杆菌则是一种解钾细菌，它们共同促进固定在土壤中不能被植物直接吸收的氮、磷、钾养分得到释放，从而为栎属植物的根系生长提供后续营养支持，促进栎属植物根系的生长。

壁材选用阿拉伯树胶与玉米的混合物，因为玉米淀粉在高固形物含量下粘度较低、乳化好，但是单一玉米淀粉成膜性较差，加入阿拉伯树胶可以使玉米淀粉更好成膜。

保护剂为海藻糖、脱脂奶粉和甘油的混合物，海藻糖和脱脂奶粉是非渗透型保护剂，主要是保护微生物细胞的表面免受伤害；甘油是渗透型保护剂可以进入细胞内，使细胞内溶质浓度升高，细胞内压力接近于细胞外压力，使得在细胞外，冻结或干燥引起的细胞脱水皱缩的程度和速度下降，从而减少了对细胞的损伤，这几种保护剂复合使用，能够使微生物细胞得到更好的保护。所选材料均无毒无害，壁材与保护剂在土壤中可自然降解，不会对环境造成污染，增加环境负担。

本发明采用喷雾干燥微胶囊技术制备微生物微胶囊菌剂，物料真空喷雾冷冻过程中冷媒与物料不接触，保证了最终微生物微胶囊菌剂的洁净度与无菌性，使制备得到的微生物微胶囊菌剂性能更加稳定，生产过程设计合理、工艺简单，适合大批量规模化生产。

本发明的有益效果：

1)本发明的微生物微胶囊菌剂对栎属植物的根长和根尖具有明显的促进作用，不受地域、作物种类和环境条件的影响，根长和根尖数增幅达到20～66％，并且，可以使固定在土壤中的氮、磷、钾得到释放，为栎属植物的根系生长提供后续的营养支持，减少无机氮、磷、钾肥料的施入，既节约成本，又解决了土壤中无机盐肥利用率不高，会随土壤流失而进入水体污染水源的问题。

2)本发明的微生物微胶囊菌剂含水率≤3.47％，水分含量比较低，可以降低菌体的代谢，从而延长微生物微胶囊菌剂的保存期，常温储存时间长，菌体存活率较高，常温贮藏540d的菌体存活率为86.13％，显著高于市面上可湿性粉剂的菌体存活率。

3)本发明采用喷雾干燥微胶囊技术制备微生物微胶囊菌剂，物料真空喷雾冷冻过程中冷媒与物料不接触，保证了最终微生物微胶囊菌剂的洁净度与无菌性，使制备得到的微生物微胶囊菌剂性能更加稳定，生产过程设计合理、工艺简单，适合大批量规模化生产。

4)本发明的微生物微胶囊菌剂施用方便，使用前无需经过活化和扩大培养，可直接施加到种植栎属植物的土壤中，且该微生物菌剂接近中性，不会改变土壤PH，维持了植物根系的土壤环境的恒定。

附图说明

图1为本发明实施例1微生物微胶囊菌剂中菌体存活率随时间变化的示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

一种栎属植物促根微生物微胶囊菌剂，其各组分按重量百分比计包括：放射形根瘤菌液10％、巨大芽孢杆菌液10％、海水芽孢杆菌液10％、胶冻样类芽孢杆菌液10％、白炭黑20％、玉米淀粉20％、阿拉伯树胶8％、海藻糖4％、脱脂奶粉3.9％、甘油4％、萘乙酸钠0.1％；所述放射形根瘤菌液、巨大芽孢杆菌液、海水芽孢杆菌液和胶冻样类芽孢杆菌液中有效活菌数为1.38×10¹⁰cfu/g，杂菌数为3.28％。

通过如下制备方法得到：

1)种子液的制备：放射形根瘤菌、巨大芽孢杆菌、海水芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌分别接种于对应种子培养基中，30℃、200r/min摇床培养12h，制备成种子液；

2)发酵：将步骤1)中制备得到的种子液，分别放入装有对应发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，在发酵过程中，从发酵罐中取菌液，测量菌液中菌株类别及菌落数，当菌液中当有效活菌总数在1.38×10¹⁰cfu/g，杂菌数为3.28％时，发酵完成；

3)制备曩芯：向步骤2)制备得到的各类菌液与白炭黑均匀混合，使载体充分吸附菌体，将充分吸附菌体的载体作为囊芯；

4)糊化：向步骤3)中制备得到的曩芯中加入玉米淀粉、阿拉伯树胶、海藻糖、脱脂奶粉、甘油及萘乙酸钠，搅拌60min使其糊化；

5)成型：经过步骤4)糊化后的材料进行真空喷雾冷冻干燥，真空喷雾冷冻干燥结束后收集产物所得产物，即为栎属植物促根微生物微胶囊菌剂。

所得微生物微胶囊菌剂中有效菌存活率为96.3％，含水率3.07％，100目细度通过率为94.8％，pH为7.04，为合格产品。

将制备得到的栎属植物促根微生物微胶囊菌剂置于恒温箱，常温贮藏，每隔30d计数一次测定其菌体存活率，常温贮藏570d，该菌剂的菌体存活率变化如图1所示。

由图1可以看到，该微生物微胶囊菌剂常温贮藏前90d，菌剂中菌体存活率接近100％，常温贮藏540d后该微生物微胶囊菌剂中菌体存活率为86.13％，说明该微生物微胶囊菌剂贮藏稳定性高，可以使菌剂中菌体长期保存。

实施例2微生物微胶囊菌剂的大田应用实验：

在种植小叶青冈、细叶青冈、麻栎、白栎的种植田中分别选择1m²的样地12块，平均分为4组，每平米有60株当年生苗。其中三组分别施加启富EM种植菌种、TMF菌剂、实施例1制备的微生物微胶囊菌剂，剩余一组不施加任何菌剂作为对照，四组样地处理条件相同，生长六个月后每块样地随机选择10株实验苗对实验苗株高、干生物量进行测量，并对根系进行扫描，统计根长、表面积、直径、根尖数，计算平均数，结果如表1。

表1

由表1可以得出启富EM种植菌种只对细叶青冈的根长和根尖有促进作用，TMF菌剂只对白栎的根长和根尖有促进作用，对其余植物促进作用不明显；但是本发明实施例1制备得到的微生物微胶囊菌剂，可以使小叶青冈、细叶青冈、麻栎和白栎的根长和根尖都得到明显提高，并且增加栎属植物的株高和干生物量，因此，本发明所述微生物微胶囊菌剂与现有促根菌剂相比对栎属植物的根长和根尖促进作用更好，不受地域、作物种类和环境条件的影响。

Claims (6)

1.一种栎属植物促根微生物微胶囊菌剂，其特征在于，各组分按重量百分比计包括：放射形根瘤菌液10～15％、巨大芽孢杆菌液10～15％、海水芽孢杆菌液10～15％、胶冻样类芽孢杆菌液10～15％、载体20～25％、壁材25～35％、保护剂9～18％、植物生长调节剂0.1～0.2％；

所述载体为白炭黑；所述壁材为玉米淀粉与阿拉伯树胶的混合物；所述保护剂为海藻糖、脱脂奶粉和甘油的混合物；所述植物生长调节剂为萘乙酸钠；

所述放射形根瘤菌液、巨大芽孢杆菌液、海水芽孢杆菌液和胶冻样类芽孢杆菌液中有效活菌数分别为1.0×10¹⁰～2.0×10¹¹cfu/g，杂菌数≤5％。

2.如权利要求1所述栎属植物促根微生物微胶囊菌剂的制备方法，其包括如下步骤：

1)种子液的制备：放射形根瘤菌、巨大芽孢杆菌、海水芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌分别接种于对应的种子培养基中，28～30℃、190～200r/min摇床培养12～14h，制备成种子液；所述载体为白炭黑；所述壁材为玉米淀粉与阿拉伯树胶的混合物；所述保护剂为海藻糖、脱脂奶粉和甘油的混合物；所述植物生长调节剂为萘乙酸钠；

2)发酵：将步骤1)中制备得到的种子液，分别放入装有对应的发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，在发酵过程中，从发酵罐中取菌液，测量菌液中菌株类别及菌落数，当菌液中有效活菌数在1.0×10¹⁰～2.0×10¹¹cfu/g，杂菌数≤5％时，发酵完成；

3)制备囊芯：将步骤2)制备得到的各类菌液与载体均匀混合，使载体充分吸附菌体，将充分吸附菌体的载体作为囊芯；

4)糊化：向步骤3)中制备得到的囊芯中加入壁材、保护剂和植物生长调节剂，搅拌30～60min使其糊化；

5)成型：经过步骤4)糊化后的材料进行真空喷雾冷冻干燥，真空喷雾冷冻干燥结束后收集所得产物，即为栎属植物促根微生物微胶囊菌剂。

3.如权利要求2所述的栎属植物促根微生物微胶囊菌剂的制备方法，其特征在于，所述放射形根瘤菌的种子培养基为根瘤菌培养基；所述巨大芽孢杆菌的种子培养基为营养肉汁琼脂培养基；所述海水芽孢杆菌的种子培养基为LB培养基；所述胶冻样类芽孢杆菌的种子培养基为硅酸盐细菌培养基。

4.如权利要求2所述的栎属植物促根微生物微胶囊菌剂的制备方法，其特征在于，所述放射形根瘤菌的发酵培养基配方为：酵母提取物1～2g、甘露醇10～15g、KH₂PO₄ 0.5～1g、MgSO₄·7H₂0 0.2～0.4g、NaCl 0.1～0.2g、CaCl₂ 0.05～0.1g、蒸馏水1～1.1L、pH6.8～7.2；所述巨大芽孢杆菌的发酵培养基配方为：蛋白胨10～11g、牛肉浸出粉3～4g、NaCl 5～6g、KH₂PO₄ 0.5～1g、MnSO₄ 0.05～0.1g、蒸馏水1～1.1L、pH7.0～7.2；所述海水芽孢杆菌的发酵培养基配方为：蔗糖130～150g、蛋白胨2～3g、KH₂PO₄ 0.5～1g、Na₂HPO₄ 1.4～1.8g、NaCl 0.1～0.2g、蒸馏水1～1.1L、pH7.0～7.2；所述胶冻样类芽孢杆菌的发酵培养基配方为:蔗糖5～6g、Na₂HPO₄ 2～3g、MgSO₄·7H₂0 0.5～1g、(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.2g、CaCO₃ 0.1～0.2g、FeCl₃ 0.005～0.01g、土壤矿物1～2g、蒸馏水1～1.1L、pH7.0～7.2。

5.如权利要求1所述的栎属植物促根微生物微胶囊菌剂在种植栎属植物中的应用，其特征在于，所述栎属植物促根微生物微胶囊菌剂直接施用于种植栎属植物的土壤中。

6.如权利要求1所述的栎属植物促根微生物微胶囊菌剂在种植栎属植物中的应用，其特征在于，所述栎属植物促根微生物微胶囊菌剂直接应用于栎属植物的根和栎属植物的种子，具体应用方法为：将所述栎属植物促根微生物微胶囊菌剂与水混合制成泥浆，将栎属植物种子或幼苗根系沾取泥浆，然后种植。

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