CN110106126A - 一株胶质芽孢杆菌及其在制备盐碱土壤改良剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株胶质芽孢杆菌及其在制备盐碱土壤改良剂中的应用。一株胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs‑bh，2019年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.17376。本发明首次公开了通过紫外线诱变筛选培育出的抗高温耐盐碱的胶质芽孢杆菌，该胶质芽孢杆菌具有耐高温耐盐碱的抗逆性，可有效适应盐碱板结土壤。同时具有解硅解磷的作用，促进土壤中可溶性硅磷等元素的释放，增强作物的抗逆性，达到土壤修复剂的利用率，修复改良盐碱土壤，降低盐渍化。

Description

一株胶质芽孢杆菌及其在制备盐碱土壤改良剂中的应用

技术领域

本发明涉及一株胶质芽孢杆菌及其在制备盐碱土壤改良剂中的应用，属于农业微生物技术领域。

背景技术

土壤盐碱化和次生盐碱化问题，已经成为世界灌溉农业可持续发展的资源制约因素。土壤盐碱化问题在世界范围内广泛存在，特别是在干旱、半干旱地区问题更为严重。土壤盐碱化是自然因素和人为活动综合作用的结果。自然因素主要是指异常的气候条件,特别是严重的干旱条件，由此造成植被退化，风蚀加快，引起盐碱荒漠化。人为因素主要指过度放牧、乱砍滥伐、开垦草地并进行连续耕作等，近十几年来，不合理使用化肥及滥用农药也是造成土壤荒漠盐碱化的一个重要人为因素，并且其作用程度有不断上升的趋势。由于盐碱加重,土壤的营养功能净化功能、缓冲功能和有机体的支持功能正在丧失，迫切需要修复和治理。盐碱土壤修复的研究与应用直接关系到中国的生态安全。

影响农作物正常生长的盐碱地一般是指盐分含量大于0.3％、pH值大于8的土壤环境,这样的土壤环境几乎都具有有机质含量低、全氮量低下，有效硅、钾含量极低、有效水分含量低下、土壤团粒结构差、通透性差、微生物菌群的活动受到抑制等特性，不仅妨碍了农作物对水肥的吸收，降低了土壤对水、肥、气、热的供应和协调能力,而且限制了土壤肥力的进一步提高。

滨海盐碱土壤污染原因：滨海土壤母质的特点是在海相沉积物上覆盖河流沉积物，其土壤盐分主要来自海水。土壤盐碱化的原因是1、盐土脱盐过程中的脱盐碱化；2、苏打型地下水，地下水中含NaHCO₃和NaCO₃引起的土壤碱化；3、碱性水灌溉造成的土壤次生碱化。

目前，田间施用的硅肥主要是含硅酸盐的工业废渣，其中的有效硅含量不稳定，土壤中含有的大量的硅绝大部分处于结晶体状态，不能被植物吸收利用，所以长期施用这些肥料会对土质造成严重的伤害。

胶质芽孢杆菌为大荚膜芽孢杆菌，革兰氏染色阴性，荚膜多糖丰富，芽孢为椭圆形，能分解由铝硅酸盐和硅酸盐组成的岩石矿物，因此也称为硅酸盐细菌。

中国专利文献CN101781152A(申请号201110124488.5)公开了一种多效活性硅肥及其生产工艺，它主要以富含SiO2的固体废弃物或矿物为原料,经过理化处理后复配具有溶硅能力的硅酸盐细菌及其保护促进剂并选择性地添加作物生长所需营养元素。该肥料产品可直接使用或掺混其他化肥、复合肥或有机肥料使用,可获得显著的增产增收、抗病抗逆、改良品质的综合效果。

中国专利文献CN1504563A(申请号02152967.1)公开了一种高密度硅酸盐细菌菌剂及其生产方法。该种微生物为胶质芽孢杆菌。通过固体发酵方法生产出高密度的胶质芽孢杆菌菌剂，可作为生物肥料用于促进各种农作物及树木，草坪的生长。

中国专利文献CN1379083A(申请号01110311.6)公开了一种硅酸盐细菌及含有硅酸盐细菌的肥料，该菌是土壤芽胞杆菌。菌体为长杆状(1.0-1.5×3-5μm)，两端钝圆，幼龄时周生鞭毛，革兰氏反应阴性，菌体外有肥厚的荚膜，菌体内往往有1-2个颗粒体。具有高效分解释放矿物和土壤中钾、磷，固定空气中的氮素，产生多种生理活性物质的能力。以该细菌为有效成分的生物钾肥，可改善作物钾素营养，提高作物产量和品质，改良土壤。

上述技术方案虽然作用与盐碱地后，对土壤均具有一定修复功能，但受限于菌种本身的耐盐碱性与耐高温性，导致修复速度和适用范围无法满足实际需求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一株胶质芽孢杆菌及其在制备盐碱土壤改良剂中的应用。

本发明技术方案如下：

一株胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh，2019年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.17376。

所述的胶质芽孢杆菌JDzhs-bh CGMCC No.17376的具体特征如下:

菌体形态特征：菌体粗，稍弯曲长杆状，两端钝圆，荚膜大而厚；菌体大小为(1.0-1.2)×(3.0-7.5)μm；

菌落形态特征：在硅酸盐筛选培养基平板上菌落大致为圆形；无色透明，培养3-5天后菌落中部有淡黄色的浑浊点，边缘完整较透明；表面黏稠，较光滑，弹性大，可拉成丝状；好氧或兼性厌氧生长。

芽孢形态特征：孢囊微膨大；椭圆形且孢内不着色。

生理生化特性：革兰氏染色阴性，作用于植物根部，具有解硅、解钾等矿物及固氮的作用。

微生物学特征：好氧或兼性厌氧生长，氧化酶及脲酶反应阴性，接触酶及吲哚试验反应阳性，在无氮培养基上生长良好，能很好地利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇等作为碳源，在酵母膏的简单培养基中生长较弱，只能形成很薄的荚膜且能水解淀粉；最适生长温度为25～28℃，最适生长pH7.0～8.5。

上述胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh的培养方法，包括如下步骤：

(1)取胶质芽孢杆菌接种至斜面培养基，在温度25～32℃下活化培养45～50h，制得活化菌株；

(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于种子培养基中，在28～32℃、150～200r/min的条件下培养18～24h，制得种子液；

(3)将步骤(2)制得的种子液接种于发酵培养基中，接种量5～10％(体积百分比)，在28～32℃、150～200r/min的条件下培养8～12h，即得。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，斜面培养基组份如下:

蔗糖12～18g/L、K₂HPO₃ 1.5～5g/L、NaCl 0.2～5g/L、SiO2 2～12g/L、MgSO₄ 0.5～5.5g/L、CaCO₃ 2～9g/L、酵母膏0.4～5g/L、琼脂10～20g/L，pH7.2～7.4；

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，种子培养基组份如下:

淀粉6～20g/L、K₂HPO₃ 4～12g/L、硫酸铵2～5.5g/L、酵母膏0.5～5g/L、蔗糖4～10g/L、MgSO₄ 2～5g/L、CaCO₃ 2～5g/L、SiO2 2～10g/L、FeCl₃ 0.02～1g/L，pH 7.2～7.4；

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，发酵培养基组份如下:

蔗糖2～5g/L、K₂HPO₃ 2～5g/L、酵母膏1.2～5g/L、硫酸铵0.2～5g/L、大豆蛋白胨1.5～5g/L、MgSO₄ 0.4～5g/L，pH7.2～7.4。

上述胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh在制备盐碱土壤改良剂中的应用。

根据本发明优选的，所述盐碱土壤改良剂中胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)JDzhs-bh的有效活菌数≥2.0×10⁸cfu/g。

根据本发明优选的，所述盐碱土壤改良剂的原料组份如下，均为重量份：

草木灰5～12份、沸石24～32份、腐殖酸10～18份、淡紫拟青霉菌菌液2～6份、凹凸棒土12～42份、黄原胶12～20份、胶质芽孢杆菌菌液4～8份；

所述盐碱土壤改良剂的有效活菌数≥4.0×10⁸cfu/g，淡紫拟青霉菌与胶质芽孢杆菌菌体数之比为1：(1.5～2)。

根据本发明进一步优选的，所述盐碱土壤改良剂的原料组份如下，均为重量份：

草木灰7～10份、沸石25～30份、腐殖酸12～16份、淡紫拟青霉菌菌液3～5份、凹凸棒土18～30份、黄原胶14～18份、胶质芽孢杆菌菌液5～7份。

根据本发明更优选的，所述盐碱土壤改良剂的原料组份如下，均为重量份：

草木灰9份、沸石29份、腐殖酸15份、淡紫拟青霉菌菌液4份、凹凸棒土22份、黄原胶15份、胶质芽孢杆菌菌液6份。

草木灰：为植物生长提供大量的钾元素，促进土壤的团粒结构形成。

沸石:具有吸附性、离子交换性能，因此被广泛用作吸附剂、离子交换剂，其沸石中高含量的硅元素有效补充土壤尤其盐碱土壤对硅元素的需求，帮助解除盐碱硝及重金属对土地及农作物危害,提高作物品质及产量功能。

腐殖酸：具有肥料增效、改良土壤、刺激作物生长、改善农产品质量等功能；降低盐碱地土壤的PH。

淡紫拟青霉菌:具有繁殖快速、生命力强、安全无毒等特点；淡紫拟青霉分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质等可促进难溶硅酸盐的溶解。实验室研究证实:拟青毒菌的增溶效果达到30％，其它线虫拮抗菌达到20％～-40％。

凹凸棒土：施入土壤后能提高土壤肥力增加作物产量，减少农田灌溉用水，其阳离子代换和吸附性能可以改良土壤的物化性状。

黄原胶：属于多糖物质，为植物和微生物的生长提供长期的营养物质，可以促进土壤的团粒结构的形成，并且被分解后不会造成土壤的二次污染。

有益效果

1、本发明首次公开了通过紫外线诱变筛选培育出的抗高温耐盐碱的胶质芽孢杆菌，该胶质芽孢杆菌具有耐高温耐盐碱的抗逆性，可有效适应盐碱板结土壤。同时具有解硅解磷的作用，促进土壤中可溶性硅磷等元素的释放，增强作物的抗逆性，达到土壤修复剂的利用率，修复改良盐碱土壤，降低盐渍化。

2、本发明将胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh与淡紫拟青霉菌及其他组份复配制得盐碱土壤改良剂，其既可破坏硅铝酸盐的晶格结构、难溶性磷化合物等，又可分解释放出可溶的硅钾元素及钙、硫、镁、铁、锌、钼、锰等中微量元素，具有良好的矿解作用，并且可以在盐碱度为0.3％-0.5％的地块施用，快速降低盐碱度、改良土壤盐碱性；而且施用后可以显著提高土壤中各种微生物的活力，快速提升土壤的自修复能力；

3、本发明的胶质芽孢杆菌JDzhs-bh与淡紫拟青霉菌协同作用，提高了胶质芽孢杆菌JDzhs-bh的快速繁殖，增加了盐碱土壤中胶质芽孢杆菌的数量，并且促进了难溶性硅酸盐的溶解；与腐殖酸作用后，可有效降低土壤的pH,有利于胶质芽孢杆菌的耐盐碱耐高温作用机制；

4、本发明所述盐碱土壤改良剂可以吸附降解化肥、农药及重金属残留，每亩仅需15～25千克即可达到目的。如果针对解决盐碱硝问题使用，可根据其土壤所含盐碱硝程度，每亩用量在15～30千克，能够有效地解除盐碱硝对盐碱地作物的危害；可以对废弃地、盐碱地、化肥和农药及重金属污染土地进行修复，使其变为高产良田；

5、本发明所述盐碱土壤改良剂中添加了沸石为主的多种微量元素肥料,满足了土壤尤其盐碱土壤生产粮食在对微最元素肥料的特别需求，可广泛用于各种肥料的混配。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh，2019年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.17376。

淡紫拟青霉菌购自于北京中农富源集团有限公司，登记证号：微生物肥(2017)准字(2381)号，执行标准:GB20287-2006。

实施例1

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh的筛选过程如下：

(1)从滨州沾化盐碱地试验基地取回土样，按胶质芽孢杆菌的筛选培养基和条件，筛选胶质芽孢杆菌，并分离纯化，最终获得纯菌株；

筛选培养基为硅酸盐培养基，组份如下：

蔗糖5g，Na₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃ 0.005g，CaCO₃ 0.1g，铝土矿0.5g，琼脂15g，水1000ml；pH 7.5；

筛选条件：25℃下培养4天；

通过显微镜观察判断是否为纯菌株，采用平板划线法获得纯种；

(2)制备胶质芽孢杆菌菌株的菌悬液

挑取该菌株的单菌落接入简单培养基，组份如下：

酵母浸膏粉5g/L、蛋白胨10g/L与NaCl 5g/L,Ph 7.4；

培养条件：32℃与180r/min的条件下恒温摇床上培养24h；

取5ml培养菌液加到装有玻璃珠和45ml无菌水三角瓶，180r/min震荡培养25min，制成菌悬液；

用无菌水稀释至10^-4后备用。

(3)紫外线诱变及强解硅钾性能菌株的选育

将步骤(2)制备的菌悬液加入到平板中，菌液厚度为0.2cm；

20W紫外灯30cm处照射3min；

诱变结束后，立即将该菌液涂布在含有SiO₂的固体培养基上，培养基组份如下：

蔗糖15g/L、K₂HPO₃ 3.5g/L、NaCl 2.6g/L、SiO₂ 7g/L、MgSO₄ 3g/L、CaCO₃ 5.5g/L、酵母膏2.7g/L、琼脂粉15g/L,pH 7.4；

培养条件：28℃恒温培养箱中避光培养6d；

选择经紫外线诱变后的菌株，经解硅钾活性测定、遗传稳定性检测等，选出一株具有耐盐碱、耐高温且解硅钾效率高的菌株，命名为胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)JDzhs-bh，2019年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.17376。

(4)解硅钾活性的测定

解硅活性的测定

将步骤(3)所得菌株接种到含1.0g/L石英砂的发酵培养液中，在180r/min摇床发酵48h，得到发酵液，做3个平行实验组。精确吸取适量过滤除菌的发酵液于小烧杯中,以硅钼蓝分光光度法测定发酵液中水溶性硅的含量。

所述发酵培养液组份如下：

酵母膏0.7g/l,蔗糖1g/l，硫酸铵0.3g/l，磷酸氢二钾1g/l，大豆蛋白胨1g/l，硫酸镁0.3g/l，pH 7.4。

以滨州市沾化盐碱地试验基地筛选的原始菌种:“硅酸盐细菌M-7”作为对照菌株进行发酵及解硅活性测定。

解钾活性的测定

在无钾发酵培养液中加入浓度为1.0g/L的钾铝酸盐溶液，接种步骤(3)所得菌株，180r/min摇床发酵48h，得到发酵液，做3个平行实验组。取适量发酵液过滤除去菌体和残渣,稀释5倍,利用原子吸收分光光度法测定稀释液中的水溶性钾含量,在30min内比浊完毕，同时作空白试验对照。

所述无钾发酵培养液组份如下：

蔗糖1g/l，酵母膏0.7g/l，硫酸铵0.3g/l，大豆蛋白胨1g/l，硫酸镁0.3g/l，FeCl₃0.05g/l,pH7.0-7.4。

以滨州市沾化盐碱地试验基地筛选的硅酸盐细菌菌株M-7作为对照菌株同时进行发酵及解钾活性测定。

在不同溶氧发酵条件下菌株的解钾及解硅活性按如下操作：

以透光度为纵坐标,钾标准使用液浓度为横坐标,绘制标准曲线,得到回归方程:Y＝0.110 6X-0.1354,R²＝0.989 6。

以透光度为纵坐标,硅标准使用液浓度为横坐标,进行标准曲线的绘制,得到回归方程:Y＝0.7853X+0.0074,R²＝0.999 8。

将试验测得的OD值,代入回归方程分别计算得到相应的钾含量及硅含量，检测结果如表1所示：

表1胶质芽孢杆菌JDzhs-bh菌株的解钾解硅活性

菌株	OD值	硅含量μg/L	OD值	钾含量mg/L
					JDzhs-bh	0.310	0.385	0.710	7.644
M-7	0.046	0.049	0.413	4.958

由表1可知，相对于对照菌株M-7，所述的胶质芽孢杆菌JDzhs-bh具有较高的解硅和解钾活性。在摇瓶发酵条件下，可以使发酵液中水溶性钾含量和硅含量分别达到7.644mg/L和0.385μg/ml，其解硅解钾活性能力显著高于原始出发菌株M-7。

(5)耐高温试验测定

①将步骤(3)所得胶质芽孢杆菌JDzhs-bh菌株进行培养，培养液配方如下：

酵母膏0.7g/l,蔗糖1g/l，硫酸铵0.3g/l，磷酸氢二钾1g/l，大豆蛋白胨1g/l，硫酸镁0.3g/l，pH 7.4；

②对发酵罐及发酵液进行灭菌，灭菌条件为：压力0.15MPa,温度121℃，时间45min；

③待灭菌完成，培养液温度下降至37℃时，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，无活菌生长，灭菌完成。将步骤(3)所得胶质芽孢杆菌JDzhs-bh菌株接种到发酵培养液中，接种比例(体积比)为菌种/培养液1：120；

④接种开始8h后，进行取样，利用划线培养和显微镜镜检，检测发酵有无污染；

⑤发酵过程需要控制转速120r/min，通气量1m³/h，发酵时间一致，设置4个发酵温度24℃、28℃、32℃、36℃，待发酵进行24h后，进行一次取样，检测发酵是否污染、芽孢率及发酵液菌量，此后每6h进行一次取样检测，采用稀释涂板法计算并记录芽孢率和发酵液菌量。

相同步骤于胶质芽孢杆菌M-7，比较芽孢率和发酵液菌量,如表2和表3所示：

表2

表3

从表中可看出，胶质芽孢杆菌JDzhs-bh在24-40℃下均能存活，但在36-40℃之间，随着温度的升高，芽孢存活率和发酵液中的菌量均有所下降，但其菌量大于2×10⁹cfu/ml，并且高于24℃和28℃的菌量，表明胶质芽孢杆菌JDzhs-bh菌株具有耐高温的特性。

胶质芽孢杆菌JDzhs-bh与M-7相比，芽孢存活率和发酵液的菌量都明显增加，特别在36-40℃之间，芽孢成活率和菌量都尤其高于M-7，表明胶质芽孢杆菌JDzhs-bh菌株的耐高温特性高于菌株M-7。

(6)耐盐碱试验测定

分别配制含有不同盐浓度(NaCl溶液浓度分别为1.0、5.0、10.0、20.0g/L)，碱性(pH 7-11)的培养基，用步骤(3)所得胶质芽孢杆菌JDzhs-bh菌株点样，培养4天后观察菌落的生长状况，与点样后培养的M-7菌株对照，每种菌株设置5个平行试验组，观察试验现象。

耐盐性试验：

试验结果表明，胶质芽孢杆菌JDzhs-bh在所述的NaCl溶液浓度中均能生长，其中在20.0g/L浓度的培养基上长势较好，菌落数量和形态优于菌株M-7，菌株M-7耐盐性稍差，在20.0g/L浓度的培养基上不生长。

耐碱性试验：

试验结果表明，两种胶质芽孢杆菌在pH 7-11的培养基上均能生长。但胶质芽孢杆菌JDzhs-bh的长势优于菌株M-7，菌落数量也多于M-7菌株，菌株M-7的耐盐性稍差，在pH＝11的培养基上基本不生长。

所述培养基组分如下：

蔗糖15g/L、K₂HPO₃ 3.5g/L、NaCl 2.6g/L、MgSO₄ 3g/L、CaCO₃ 5.5g/L、酵母膏2.7g/L、琼脂粉15g/L,pH 7.0

实施例2

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh的培养方法，包括如下步骤：

(1)取胶质芽孢杆菌接种至斜面培养基，在温度28℃下活化培养48h，制得活化菌株；

所述斜面培养基组份如下:

蔗糖15g/L、K₂HPO₃ 3.2g/L、NaCl 2.6g/L、SiO₂ 7g/L、MgSO₄ 3.0g/L、CaCO₃ 5.5g/L、酵母膏2.7g/L、琼脂15g/L，pH 7.4；

(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于种子培养基中，在30℃、180r/min的条件下培养20h，制得种子液；

所述种子培养基组份如下:

淀粉13g/L、K₂HPO₃ 8g/L、硫酸铵3.8g/L、酵母膏2.7g/L、蔗糖7g/L、MgSO₄ 3.5g/L、CaCO₃ 3.5g/L、SiO₂ 6g/L、FeCl₃ 0.5g/L，pH 7.4；

(3)将步骤(2)制得的种子液接种于发酵培养基中，接种量5％(体积百分比)，在30℃、180r/min的条件下培养10h，即得胶质芽孢杆菌JDzhs-bh发酵液；

所述发酵培养基组份如下:

蔗糖3.5g/L、K₂HPO₃ 3.5g/L、酵母膏3.1g/L、硫酸铵2.7g/L、大豆蛋白胨3.5g/L、MgSO₄ 2.7g/L，pH 7.4。

将得到的发酵物按照草木灰5～12份、沸石24～32份、腐殖酸10～18份、淡紫拟青霉菌菌液2～6份、凹凸棒土12～42份、黄原胶12～20份、胶质芽孢杆菌发酵液4～8份的比例进行混合，混合后水分含量为30％。将产品进行干燥处理，干燥后产品水分在5％-10％之间。经检测，微生物盐碱土壤改良剂的有效活菌数≥4.0×10⁸cfu/g。

实施例3

一种盐碱土壤改良剂，按如下组份配制：

草木灰5～12份、沸石24～32份、腐殖酸10～18份、淡紫拟青霉菌菌液2～6份、凹凸棒土12～42份、黄原胶12～20份、胶质芽孢杆菌JDzhs-bh菌液4～8份；

将上述组份混合后，制成土壤改良剂。

实施例4

一种盐碱土壤改良剂，按如下组份配制：

草木灰7～10份、沸石25～30份、腐殖酸12～16份、淡紫拟青霉菌菌液3～5份、凹凸棒土18～30份、黄原胶14～18份、胶质芽孢杆菌菌液5～7份。

将上述组份混合后，制成土壤改良剂。

实施例5

一种盐碱土壤改良剂，按如下组份配制：

草木灰6～11份、沸石26～32份、腐殖酸8～14份、淡紫拟青霉菌菌液2～4份、凹凸棒土16～44份、黄原胶18～28份、胶质芽孢杆菌菌液5～7份。将上述组份混合后，制成土壤改良剂。

对比例1

如实施例3所述的盐碱土壤改良剂，不同之处在于，将胶质芽孢杆菌JDzhs-bh发酵液替换为等重量的胶质芽孢杆菌M-7发酵液。

对比例2

如实施例3所述的盐碱土壤改良剂，不同之处在于，将胶质芽孢杆菌JDzhs-bh发酵液分别替换为胶质芽孢杆菌M-7和JDzhs-bh按等体积混合的发酵液。

对比例3

如实施例3所述的盐碱土壤改良剂，不同之处在于，将淡紫拟青霉菌发酵液4份替换为淡紫拟青霉菌发酵液1份和3份水的混合液。

对照例

如实施例3所述的盐碱土壤改良剂，不同之处在于，将胶质芽孢杆菌JDzhs-bh发酵液替换为等质量的水。

实验例

取实施例3、对比例1-3及对照例所得的土壤改良剂应用于滨海盐碱地的修复改良。

供试品种为玉米。试验在滨州盐碱区试验基地，选取25亩条件完全相同的含有作物的盐碱土壤区域。

在其他外界条件相同的情况下，各5亩地分别喷施该土壤改良剂实施例3，对比例1-3，另5亩地作为对照，喷施不含有胶质芽孢杆菌JDzhs-bh的土壤改良剂，使用间隔不少于10天。

具体栽培步骤如下：

(1)整地

在3月中旬，用水漫灌所取的试验盐碱地1次，每亩灌溉量50-90m³，晾晒15天左右使地表干至能进入，每亩地施用上述对应的土壤改良剂60-65kg，然后旋耕1-2遍，使土肥混合，保持地面平整。

(2)种子处理

在玉米播种前，用种衣剂、杀菌剂、杀虫剂处理，进行混合拌种时先拌入杀虫剂，堆闷4-6小时再拌入杀菌剂，可防止土壤中病虫害的侵袭，有力地保护种子，拌种处理完毕后立即播种。

(3)播种

根据漫灌后土壤情况，初步选择5月上旬播种；起畦种植，畦宽115-135厘米，畦高25厘米左右，宽窄行种植，穴距为30-35厘米，每穴3株，采用一次性完成开沟、播种、覆土、镇压工序的播种方式；播后采用地膜进行覆盖。

(4)苗期田间管理

放苗：当苗长至2-3叶时开始放苗，即将地膜挑破露出小苗；封孔：根据膜下土壤情况用田间土壤适时封堵放苗孔；定苗补苗：甜高粱出苗后要及时间苗、定苗,去弱留壮；补苗时将苗带土移栽至缺苗处，补浇水追肥。

经检测，结果如表4所示：

表4土壤改良剂大田试验结果

由表1可知，与不实施土壤改良剂的试验田相比，实施例3、对比例1-3的增产率分别达到24.0％、25.4％、12.8％和17.5％，含有胶质芽孢杆菌JDzhs-bh的改良剂增产率最高；与对比例1与对比例2相比，虽然对比例2中含有一部分胶质芽孢杆菌JDzhs-bh和一部分胶质芽孢杆菌M-7，但由于二者可能存在竞争性抑制，因此，其菌数不仅低于实施例3，也显著低于对比例1，同时效果也是实验组中除对照例外最差的；与实施例3相比，对比例3的产量略有下降，表明淡紫拟青霉菌菌液的用量可直接影响到胶质芽孢杆菌JDzhs-bh菌株的数量，并且可以降低土壤中的含盐量和碱化度；施用本发明的含有胶质芽孢杆菌JDzhs-bh的土壤改良剂不仅能显著提高玉米产量，还能提高土壤中硅、钾的含量，降低了土壤的碱化度和含盐量。

以上试验结果表明，采用本发明配方的含有胶质芽孢杆菌JDzhs-bh的土壤改良剂成功实现对盐碱地的改良，改良效果显著。

Claims (10)

1.一株胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh，2019年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.17376。

2.权利要求1所述胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取胶质芽孢杆菌接种至斜面培养基，在温度25～32℃下活化培养45～50h，制得活化菌株；

(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于种子培养基中，在28～32℃、150～200r/min的条件下培养18～24h，制得种子液；

(3)将步骤(2)制得的种子液接种于发酵培养基中，接种量5～10％(体积百分比)，在28～32℃、150～200r/min的条件下培养8～12h，即得。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，斜面培养基组份如下:

蔗糖12～18g/L、K₂HPO₃ 1.5～5g/L、NaCl 0.2～5g/L、SiO2 2～12g/L、MgSO₄ 0.5～5.5g/L、CaCO₃ 2～9g/L、酵母膏0.4～5g/L、琼脂10～20g/L，pH7.2～7.4。

4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，种子培养基组份如下:

淀粉6～20g/L、K₂HPO₃ 4～12g/L、硫酸铵2～5.5g/L、酵母膏0.5～5g/L、蔗糖4～10g/L、MgSO₄ 2～5g/L、CaCO₃ 2～5g/L、SiO2 2～10g/L、FeCl₃ 0.02～1g/L，pH 7.2～7.4。

5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，发酵培养基组份如下:

蔗糖2～5g/L、K₂HPO₃ 2～5g/L、酵母膏1.2～5g/L、硫酸铵0.2～5g/L、大豆蛋白胨1.5～5g/L、MgSO₄ 0.4～5g/L，pH7.2～7.4。

6.权利要求1所述胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh在制备盐碱土壤改良剂中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述盐碱土壤改良剂中胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)JDzhs-bh的有效活菌数≥2.0×10⁸cfu/g。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述盐碱土壤改良剂的原料组份如下，均为重量份：

草木灰5～12份、沸石24～32份、腐殖酸10～18份、淡紫拟青霉菌菌液2～6份、凹凸棒土12～42份、黄原胶12～20份、胶质芽孢杆菌菌液4～8份；

进一步优选的，所述盐碱土壤改良剂的有效活菌数≥4.0×10⁸cfu/g，淡紫拟青霉菌与胶质芽孢杆菌菌体数之比为1：(1.5～2)。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述盐碱土壤改良剂的原料组份如下，均为重量份：

草木灰7～10份、沸石25～30份、腐殖酸12～16份、淡紫拟青霉菌菌液3～5份、凹凸棒土18～30份、黄原胶14～18份、胶质芽孢杆菌菌液5～7份。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述盐碱土壤改良剂的原料组份如下，均为重量份：

草木灰9份、沸石29份、腐殖酸15份、淡紫拟青霉菌菌液4份、凹凸棒土22份、黄原胶15份、胶质芽孢杆菌菌液6份。