CN107227265A

CN107227265A - 一种胶质芽孢杆菌菌株及微生物菌剂

Info

Publication number: CN107227265A
Application number: CN201610975842.8A
Authority: CN
Inventors: 杨涛; 张明军; 熊峰; 徐维烈; 徐辉; 熊捷; 刘桂华
Original assignee: Wuhan Heyuan Green Organism Co ltd
Current assignee: Wuhan Heyuan Green Organism Co ltd
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2017-10-03
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: CN107227265B

Abstract

本发明提出了一种胶质芽孢杆菌菌株及微生物菌剂，一种胶质芽孢杆菌菌株，2016年8月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2016426，分类命名：胶质芽孢杆菌K5(Bacillus mucilaginosus K5)。功能菌上的胶质芽孢杆菌的微生物菌剂，菌株的活菌量至少为5.0×109CFU/g，微生物菌剂应用于田间土壤解磷解钾、提高作物产量和农作物抗旱性。

Description

一种胶质芽孢杆菌菌株及微生物菌剂

技术领域

本发明属于微生物工程领域，特别涉及一种胶质芽孢杆菌菌株及微生物菌剂及其应用。

背景技术

钾是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，植物对钾的需要量较大。钾被植物的根系吸收后通过木质部和韧皮部运输到需要部位发挥作用。近年来，随着大量化肥的投入和盲目性偏重于氮磷肥的施用，使土壤养分失去平衡，钾元素的亏缺已经成为农作物生长和产量的限制因子之一。但同时有资料证明土壤中蕴藏着丰富的不能为作物直接吸收利用的含钾硅酸盐矿物，每公顷含量达到约26100kg。因此，如何利用土壤中含钾的硅酸盐矿物，释放出钾元素，提高土壤含钾量，成为农业科技研究的重要课题。

胶质芽孢杆菌Bacillus mucilaginosus是硅酸盐细菌(Silicate bacteria)中的一种，是土壤中一种重要功能菌，它能分解长石、云母等铝硅酸盐类的原生态矿物，使土壤中难溶性K、P、Si等转变为可溶性，供植物生长利用，同时还具有固氮的作用。

另外植物虽然各自有自身的多种抗旱机制，但是每种机制都要求使植物体内生理过程保持充足的水分供应，否则植物依然会缺水死亡。利用微生物来改善宿主的水分条件，增强宿主植株的抗旱性越来越受到重视。胶质芽孢杆菌可以产生大荚膜，荚膜的主要成分为多糖。荚膜多糖作为一种含水量很高的大分子，其大量极性基团可保护菌体免受干旱损伤，在一定程度上可以增加植物的抗旱性，另外荚膜多糖也可以吸附储存游离养分，供给植物生长使用。

发明内容

本发明提出了一种胶质芽孢杆菌菌株及微生物菌剂，本发明在从沙化地的土壤中分离筛选出一株芽孢杆菌，经鉴定为胶质芽孢杆菌，经试验表明此菌株具有解钾，提高作物产量的作用；另外还能增加作物的抗旱性。

本发明具体是通过以下技术方案来实现的：

一种胶质芽孢杆菌菌株，2016年8月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2016426，分类命名：胶质芽孢杆菌K5(Bacillus mucilaginosus K5)。

一种功能菌为上述的的胶质芽孢杆菌的微生物菌剂。

优选地，微生物菌剂中菌株的活菌量至少为5.0×109CFU/g。

一种微生物菌剂应用于田间土壤解磷解钾、提高作物产量和农作物抗旱性。

本发明丰富了微生物肥料菌种资源，拓宽微生物肥料在促进植物生长，改善农业农作物环境，抗旱保水等多方面的功能化发展。本技术将对提高作物产量和品质，促进农业可持续发展、减少环境污染以及保障人类健康都有重要的理论和实践意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1菌株K5平板菌落形态。

图2菌株K5显微镜下形态。

图3菌株K5的PCR凝胶电泳图。

图4为菌株K5的16rDNA序列在核糖体数据库上的比对结果。

图5为不同处理组中油菜根系形态变化图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：一株胶质芽孢杆菌，其筛选过程如下：

1)菌株的分离纯化

土壤样品来自武汉合缘生物股份有限公司合作项目沙化地的土壤。

除去地表植物残体和表层土2cm-10cm，分别用多点采集方案在每个采样点从沙化地土壤中采集5g-10g样品，放入样品袋中。经阴干后，采用四分法将土壤样品缩分至约50g左右；然后置于含有250ml灭菌PB缓冲液的500ml三角瓶中；30℃、180rpm震荡30min，静置沉淀(或1500rpm-5000rpm离心5min)，取上清液；取100ml上清液，经15-25℃、8000rpm-20000rpm离心10min，取沉淀；将沉淀悬浮于50ml灭菌PB缓冲液中再次15-25℃、8000rpm-20000rpm离心10min；重复两次以后，将沉淀悬浮于10ml的无菌水中，制得土壤悬浮液。将此悬浮液稀释至合适梯度后涂布于无氮培养基平板上，28℃—35℃倒置培养；挑取菌落大、生长快、透明且凸起高、粘着力强而有弹性的菌落分别进行分离纯化，将纯化后的菌株编号并保存。此次共分离纯化出31株不同的菌株,分别编号为K1-K31。然后将此31株菌分别接种于钾矿石摇瓶中，进行进一步进行解钾能力的筛选，最终得到解钾能力较高的5株菌，其中菌株K5的解钾能力最强。

注：

无氮培养基配方：蔗糖5g/L，云母矿粉(脱钾)10g/L，Na₂HPO₄ 2.0g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeCl₃ 0.005g/L，CaCO₃ 0.1g/L，琼脂15—20g/L，pH7.2。

钾矿石培养基配方：蔗糖5g/L，云母矿粉(脱钾)10g/L，Na₂HPO₄ 2.0g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeCl₃ 0.005g/L，CaCO₃ 0.1g/L，pH7.2。

2)解钾菌株的筛选

表1 不同菌株解钾能力比较

对所筛选的31株菌进行解钾能力复筛的结果如表1所示，初筛的31株菌都具有不同程度的解钾能力。综合考虑发酵后的钾浓度和增加倍数，有5株菌的解钾能力较强，依次是K5、K12、K31、K09、K18。其中K5释放的钾离子浓度达到了24.50mg/L，为最高。

3)菌株的形态、生理生化及16SrDNA分子学鉴定

如图1所示菌株K5在培养基平板上菌落为圆形，如半粒玻璃球；突起，凸起度大于45度；无色透明，5-6天后中部有浑浊点，边缘透明；表面光滑，粘稠，弹性大，可拉成丝状。显微镜下菌体粗长杆状，有厚荚膜(见图2)，芽孢大，椭圆形中生；孢囊壁厚(复红着色，深红色)，芽孢内也着色，浅红色；成熟孢囊不膨大。

菌株K5能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇产酸不产气；接触酶阳性，溶菌酶抗性阳性，V.P反应阴性，吲哚阴性；能水解明胶、酪素、淀粉；不能水解卵磷脂、酪氨酸，不能使苯丙氨酸脱氨；5％的盐液中不能生长，也不能生长于pH5.7Sabouraud的葡萄糖培养基中，菌株K5与Bacillus mucilaginosus的生理生化特征比较如表2。

表2 菌株K5与胶质芽孢杆菌的生理生化特征比较

注：+：阳性；一：阴性；nd：没有资料；+一：产酸不产气

进一步进行基因组DNA电泳和16SrDNA基因序列测序，如图3将测定所得序列与NCBI数据库BLAST同源性比对分析，选取同源性较高的模式菌株与菌株序列用ClustalX1.81软件进行多序列比对分析，用软件MegAlign5.2中的邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树。根据16SrDNA的系统发育树分析菌株K5与胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)的1412bp长度的匹配度达0.991，NCBI登录号为DQ898309。在DNAMAN软件进行相似性对比如图4，结果显示相似性为99.9％，可以认定菌株K5为胶质芽孢杆菌Bacillus mucilaginosus。

实施例2：微生物菌剂的制作

本项研究选取了葡萄糖、蔗糖和淀粉作为碳源备选；选取硫酸铵、硝酸钠和豆饼粉作为氮源备选，通过单因子优化和正交试验证实，此胶质芽孢杆菌最佳发酵配方为：蔗糖25g/L，豆饼粉9g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁(七水)2g/L，磷酸二氢钾4g/L，氯化铁0.01g/L，pH7.2。在32℃，190rpm的培养条件下， 100ml/250ml的装量下，活菌属可达8.0×10⁸cfu/ml。

在5L的发酵罐上使用相同的发酵配方，6％的接种量，最终培养液中活菌数为6.9×10⁹cfu/ml。

实施例3：微生物菌剂应用效果

1)K5菌剂对油菜生长发育的影响

按实施例2中的K5菌剂产品的最终形态，分别以不同的添加量设置4个处理：常规施肥(CK)、添加量0.01g/(kg土)(T1)、添加量0.1g/(kg土)(T2)、添加量1g/(kg土)(T3)。试验以土壤盆栽方式进行，所用盆钵均为聚乙酯塑料盆，直径30cm，高20cm，每盆装土10kg，定植4棵幼苗。自定植后，按照大田管理的措施只进行水分管理，生长期为33d。

供试大棚的土壤采用NY/T 1121土壤检测系列标准中所规定的方法进行检测，供试土壤指标如下表3：

表3 供试土壤基本性状

在植株带根收获后称量地上部及根部鲜重，算出冠根比。结果如表4：

表4 不同处理组中油菜生长状况

由表4可知，不同处理组均能不同程度的提高油菜产量与冠根比。与CK相比，T1、T2、T3油菜地上部单株鲜重分别增加60.19％、86.66％、14.23％；冠根比分别增加14.60％、20.98％、11.72％(P＜0.05)。同时可以看出T2油菜单株鲜重最高，分别比T1、T3高16.52％和63.40％。

选取4个主要参数即总根长(A)、根体积(B)、根表面积(C)、根尖数(D) 进行分析不同处理组中油菜根形态的变化。从图5可以看出与CK相比，根长依次增加30.34％、101.70％、76.64％(P＜0.05)，根体积依次增加104.78％、214.20％、 143.06％(P＜0.05)，根表面积依次增加4.89％、104.74％、7.26％，根尖数依次增加22.85％、47.89％、22.79％。各个处理组的根长和根体积都较CK有显著差异。处理组之间相比，除根尖数差异显著外，T2组根长较T1、T3组分别高出 54.74％、14.18％(P＜0.05)；T2组根体积较T1、T3组分别高出53.43％、29.27％； T2组根表面积较T1、T3组分别高出95.19％、90.89％。

将油菜地上部分干燥后粉碎，检测其中全氮、总磷、总钾的含量，结果如表5所示：

表5 不同处理组中油菜地上部氮磷钾含量(g/kg)

与CK相比，T1、T2、T3全氮含量依次增加32.21％、48.47％、22.31％(P ＜0.01)；总磷含量依次增加13.21％、26.06％、15.46％(P＜0.01)；总钾含量依次增加10.51％、47.11％、37.64％(P＜0.05)。

由以上数据可以看出，添加胶质芽孢杆菌K5菌剂能够促进油菜生长，提高油菜品质，增加油菜中氮磷钾的含量，但是随着使用量的增加，各项指标呈下降趋势。综合分析表明该试验以T2处理组，即0.10g/(kg土)的施用量最为合适。

2)K5菌剂对玉米苗抗旱性的影响

选用大田土壤，过筛除去石块和杂质。将土分装于高度和盆口上下直径为 12cm×33cm×22.5cm的塑料盆中，每盆装入干土3kg。以正常生长的盆栽玉米为对照(CK)，实验组分为：干旱胁迫的盆栽玉米(S1)、干旱胁迫的K5菌剂处理玉米(S2)、干旱胁迫的保水剂处理玉米(S3)。

干旱胁迫：以称重法浇水，浇水量为土壤最大持水量的50％左右(中度干旱)，正常组土壤含水量维持在最大持水量的80％—85％。

S2组：菌剂和种子比为1:15拌种后播种；S3组：按照保水剂说明使用。

自播种后开始，至拔节期进行各项生理指标的检测。

根据植株的萎蔫程度，评定干旱情况。干旱分级标准如下：

0级：植株正常生长，无萎蔫现象；1级：植株生长基本正常，叶片出现轻度萎蔫；2级：植株明显萎蔫，除生长点及周围幼叶尚保持伸展外，老叶片均萎蔫；3级：植株严重受害，生长点萎缩，恢复困难。

表6 各实验组的干旱系数

从表6可知，S2组的玉米表现出的受旱程度较弱，植株生长基本正常，只出现轻度萎蔫，而添加保水剂的玉米与干旱胁迫的S1组一样，受旱比较严重。

一般认为，经过相同干旱胁迫后，相对含水量下降幅度越大则抗旱性能越差。同时，在植物受到干旱胁迫后，会采取一定的应激措施来减缓胁迫带来的生理代谢不平衡。脯氨酸可以通过渗透调节来降低水势，维持较高的渗透压，保证植物细胞的正常生理功能；可溶性糖作为干旱胁迫诱导的小分子溶质之一，不仅参与渗透调节，还能在维持植物蛋白质稳定方面起到重要作用。本试验采用烘干法测定玉米苗的含水量(RWC)，采用茚三酮法测定玉米苗的游离脯氨酸，采用蒽酮法测定玉米苗中的可溶性糖，以观察受到干旱胁迫的玉米苗在不同实验组处理中的抗旱性差异。结果如表7：

表7 不同实验组玉米苗相对含水量、游离脯氨酸含量和可溶性糖含量

从表7可以看出K5菌剂处理的S2组玉米苗相对含水量较CK组下降的最少，保水剂处理的S3组次之，干旱胁迫的S1组相对含水量下降的最多。同时， S2组的游离脯氨酸和可溶性糖含量远远低于干旱胁迫的S1组和保水剂处理的 S3组，基本接近于对照组CK。

植物在干旱胁迫下进行复杂的生理生化响应，用单一的指标难以全面准确的反应除抗旱性的强弱。本试验通过外观以及测定相对含水量、游离脯氨酸含量和可溶性糖含量四个方面指标得出，在同等干旱胁迫下，胶质芽孢杆菌K5处理过的玉米苗和保水剂相比表现出不同的受旱程度，表明胶质芽孢杆菌K5在提高玉米的抗旱性方面具有一定的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种胶质芽孢杆菌菌株，其特征在于，2016年8月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2016426，分类命名：胶质芽孢杆菌K5(Bacillus mucilaginosusK5)。

2.一种功能菌为权利要求1所述的胶质芽孢杆菌的微生物菌剂。

3.如权利要求2所述微生物菌剂，其特征在于，微生物菌剂中菌株的活菌量至少为5.0×109CFU/g。

4.如权利要求2所述微生物菌剂的应用，其特征在于，微生物菌剂应用于田间土壤解磷解钾、提高作物产量和农作物抗旱性。