CN104560850B - 用于表达acc脱氨酶的工程菌及其应用 - Google Patents

用于表达acc脱氨酶的工程菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104560850B
CN104560850B CN201410828330.XA CN201410828330A CN104560850B CN 104560850 B CN104560850 B CN 104560850B CN 201410828330 A CN201410828330 A CN 201410828330A CN 104560850 B CN104560850 B CN 104560850B
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
engineering bacteria
ccnwsx0020
meliloti
prkacc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410828330.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104560850A (zh
Inventor
韦革宏
孔召玉
陈卫民
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest A&F University
Original Assignee
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest A&F University filed Critical Northwest A&F University
Priority to CN201410828330.XA priority Critical patent/CN104560850B/zh
Publication of CN104560850A publication Critical patent/CN104560850A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104560850B publication Critical patent/CN104560850B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B09C1/105—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes using fungi or plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/99—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in other compounds (3.5.99)
    • C12Y305/99007—1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (3.5.99.7)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于表达ACC脱氨酶的工程菌及其应用。所涉及的工程菌采用将表达ACC脱氨酶的外源基因acdS通过三亲本杂交的方法导入Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020中得到。所涉及为上述工程菌用于提高植物体内抗氧化酶系统对重金属的响应的应用。本发明所构建的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的ACC脱氨酶活性，与野生型菌株相比，可提高12.6倍。与接种野生型菌株的植物相比，接种工程菌的植物在过量重金属胁迫条件下，生物量、根长、重金属吸收量都有不同程度的促进作用，同时还显著降低了重金属离子转运系数及根部乙烯含量。

Description

用于表达ACC脱氨酶的工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术及土壤生物修复技术领域，具体涉及一株过量表达ACC脱氨酶基因的Sinorhizobium meliloti工程菌的构建，及其对宿主植物天蓝苜蓿生长及铜耐受性的提高，以及与其宿主植物所建立起的共生固氮体系在土壤重金属污染的生物修复中的应用潜力。
背景技术
铜是生物体生命活动必不可少的微量营养元素之一，同时也是一种土壤环境中重要的污染物。近年来，工业废物排放，污水灌溉，城市垃圾排放及其农用化学品应用的日趋广泛，土壤环境铜污染日益严重。土壤中过量的铜不仅直接毒害土壤植物和微生物，破坏土壤生态环境，还会通过食物链迁移转化，危及人类健康。土壤铜污染引起的土壤生态破坏和农产品安全等问题已引起国内外许多科研人员的广泛关注。
重金属的毒性和土壤的养分不足往往是重金属污染的土壤限制植物生长的主要原因，而其中氮素缺乏又是养分不足中的核心问题。豆科植物-根瘤菌共生固氮体系通过二者紧密的互利关系，成为固氮能力强，抗逆性高的生物固氮体系之一。将豆科植物作为重金属污染土壤修复的先锋作物，并选用具有重金属抗性的根瘤菌，利用二者建立起的固氮共生体系来加速污染土壤有机质和N素的积累，并通过菌株的促植物生长特性增强植物的耐受能力，已成为近年来重金属土壤污染修复研究和实践应用中的有效策略之一。
根瘤菌通过长期的进化与植物形成了稳定的互利共生关系，植物对其提供生长所需的营养和保护，同时根瘤菌也可以分泌植物生长所需的氮磷营养 元素和小分子物质(如有机酸、氨基酸、植物生长激素、铁载体、ACC脱氨酶等)，促进豆科植物生长和重金属富集，应用于重金属污染土壤的生态修复。ACC脱氨酶最早是从土壤细菌Pseudomonas sp.中分离得到的一种酶，该酶已从许多微生物中得到了分离和纯化。已有大量研究证实，具有ACC脱氨酶活性的植物促生菌(PGPR)可以通过将乙烯的前体物质ACC转化为α-丁酮酸和氨，从而降低因环境胁迫而造成的植物体内乙烯含量的增加，从而缓解植物受到的胁迫，提高植物的抗逆性。
乙烯，作为一种重要的植物激素，对植物的生长发育，衰老，器官脱落以及果实成熟都起到重要的调节作用，同时，当植物受到干旱，高盐，冻害，高温，重金属等非生物胁迫时，乙烯还充当着重要的信号分子角色。已有研究发现，Cu2+处理的植物体内发现乙烯含量明显升高，并伴随着细胞内膜的破坏。除此之外，在根瘤菌侵染豆科植物根系形成根瘤的过程中也会伴随有乙烯的生成，并对根瘤的形成及功能起到抑制作用。已有研究表明，具有ACC脱氨酶活性的根瘤菌可以缓解因乙烯含量的增加而对结瘤造成的抑制作用。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了一种用于表达ACC脱氨酶的工程菌，该工程菌采用以下方法构建：
将表达ACC脱氨酶的外源基因acdS通过三亲本杂交的方法导入Sinorhizobiummeliloti CCNWSX0020中得到工程菌。
本发明还提供了上述的用于表达ACC脱氨酶的工程菌用于提高植物体内抗氧化酶系统对重金属的响应的应用。
本发明同时还提供了上述的用于表达ACC脱氨酶的工程菌用于提高植 物对重金属耐受性的应用。
本发明又提供了上述的用于表达ACC脱氨酶的工程菌用于促进植物生长的应用。
本发明同时又提供了上述的用于表达ACC脱氨酶的工程菌与豆科植物共生在重金属污染土壤修复中的应用。
本发明所述植物可选择天蓝苜蓿、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、刺槐或草木樨。
本发明所述重金属为铜、铅、锌、镍、镉、钴或银。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明所构建的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的ACC脱氨酶活性，与野生型菌株相比，提高了12.6倍。与接种野生型菌株的植物相比，接种工程菌S.melilotiCCNWSX0020(pRKACC)的植物在过量重金属胁迫条件下，生物量、根长、重金属吸收量都有不同程度的促进作用，同时还显著降低了重金属离子转运系数及根部乙烯含量。另外，对重度重金属胁迫条件下的植物体内抗氧化酶系统的响应也有明显的促进作用。本发明所构建的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)能够顺利侵染天蓝苜蓿根系，形成结瘤，并且外源质粒pRKACC在重金属胁迫条件下成熟根瘤中的稳定性显著高于在对照条件下根瘤中的稳定性。本发明所提供的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)与其宿主植物所建立起来的共生固氮体系在土壤重金属污染的生物修复中具有一定的应用潜力。本发明的工程菌可用于天蓝苜蓿、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、刺槐、草木樨等豆科植物对重金属污染土壤的抗逆性，并且可促进上述植物的生长。
附图说明
图1为利用HindIII和KpnI对所构建的工程菌S.meliloti CCNWSX0020 (pRKACC)的质粒pRKACC进行双酶切验证(A)，并扩增根瘤菌特有固氮基因nifH验证S.meliloti的真实性(B)；(A)图中，M:1kb DNA ladder；1:E.coli(pRKACC)；2:S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)；(B)图中，M:100bp DNA ladder；1:WT S.meliloti CCNWSX0020；2:S.melilotiCCNWSX0020(pRKACC)；
图2为工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的ACC脱氨酶活性测定；
图3为在不同Cu浓度胁迫条件下，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对天蓝苜蓿地上部分与根部的鲜重(A)及干重(B)的影响；该图中不同字母表示在同样的Cu处理条件下，不同接菌处理之间的植物存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；*表示接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020的植物在Cu胁迫条件下与对照条件下相比存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；NIC＝不接菌对照；WTSM＝接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020；SMACC＝接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)；SM+UW4＝接种野生菌S.melilotiCCNWSX0020与植物促生菌P.putida UW4的混合菌；
图4为在不同Cu浓度胁迫条件下，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对天蓝苜蓿根长的影响；该图中不同字母表示在同样的Cu处理条件下，不同接菌处理之间的植物存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；*表示接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020的植物在Cu胁迫条件下与对照条件下相比存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；
图5为在不同Cu浓度胁迫条件下，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对天蓝苜蓿地上部分与根部的Cu浓度(A)、Cu总吸收量(B)及转 运系数(C)的影响；该图中不同字母表示在同样的Cu处理条件下，不同接菌处理之间的植物存在显著性差异(Duncantest,p<0.05)；*表示接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020的植物在Cu胁迫条件下与对照条件下相比存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；
图6为在不同Cu浓度胁迫条件下，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对天蓝苜蓿地上部分与根部的乙烯含量的影响；该图中不同字母表示在同样的Cu处理条件下，不同接菌处理之间的植物存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；*表示接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020的植物在Cu胁迫条件下与对照条件下相比存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；
图7为在重度Cu浓度胁迫条件下，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对天蓝苜蓿地上部分抗氧化酶基因表达量的影响；*表示在同样的Cu处理条件下，与接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020的植物相比存在显著性差异(Student’s t-test,p<0.05)；WTSM＝接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020；SMACC＝接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)；WTSM+Cu400＝在400mg/kg Cu2+胁迫条件下，接种野生菌S.melilotiCCNWSX0020；SMACC+Cu400＝在400mg/kg Cu2+胁迫条件下，接种工程菌S.melilotiCCNWSX0020(pRKACC)；
图8为在重度Cu浓度胁迫条件下，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对天蓝苜蓿根部抗氧化酶基因表达量的影响；*表示在同样的Cu处理条件下，与接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020的植物相比存在显著性差异(Student’s t-test,p<0.05)；
图9为在不同Cu浓度胁迫条件下，外源质粒pRKACC在天蓝苜蓿成熟根瘤里存在的稳定情况，不同字母表示Cu胁迫条件下的质粒稳定性与对照 条件下相比存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)，Exp1和Exp2分别代表第一、第二两次独立的生物学重复实验。
具体实施方式
本发明针对根瘤菌ACC脱氨酶活性较低这一不足之处，提供一株能够过量表达ACC脱氨酶基因的Sinorhizobium meliloti工程菌，该菌株能够促进植物生长并提高植物铜耐受性，从而提高豆科植物-根瘤菌共生固氮体系在重金属污染土壤修复中的应用潜力。
本发明将可以高效表达ACC脱氨酶活性的外源基因acdS通过三亲本杂交的方法导入Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020中，并得以表达，构建的工程菌命名为Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020(pRKACC)。
本发明所提供的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对过量Cu胁迫下宿主植物天蓝苜蓿的生物量具有提高作用。
本发明所提供的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对重度Cu胁迫下宿主植物天蓝苜蓿的根长具有一定的提高作用。
本发明所提供的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对过量Cu胁迫下宿主植物天蓝苜蓿的Cu总吸收量具有显著的提高作用，并能降低Cu2+转运系数。
本发明所提供的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对宿主植物天蓝苜蓿根部因过量Cu胁迫造成的乙烯含量的增加具有抑制作用。
本发明所提供的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)对宿主植物天蓝苜蓿抗氧化酶系统响应具有促进作用。
本发明所提供的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)能够顺利侵染宿主植物天蓝苜蓿根系，形成根瘤，并且外源质粒pRKACC在Cu胁迫条 件下成熟根瘤中的稳定性显著高于在对照条件下根瘤中的稳定性。
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不限于该实施例。
实施例：
工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的构建
(1)菌株培养：
供体菌E.coli MT616(pRKACC)：LB培养基+四环素(Tc)20μg/ml，37℃震荡培养过夜；
辅助菌E.coli pRK600：LB培养基+氯霉素30μg/ml，37℃震荡培养过夜；
受体菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020:TY培养基+氨苄青霉素(Amp)100μg/ml，28℃培养24-30h。
(2)分别吸取培养好的供体菌E.coli MT616(pRKACC)和辅助菌E.colipRK600各0.4ml，受体菌S.meliloti CCNWSX00200.6ml，混合加入无菌的1.5ml离心管中，离心收集菌体后，用灭菌的0.85％NaCl溶液清洗菌体两次，去除残留抗生素。
(3)用镊子取灭菌的滤纸片平贴于已准备好的TY培养基平板上，3片/平板。用移液枪抽吸离心管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将其吸取打到滤纸片中央(始终保持平板水平，以免菌液流到滤纸片之外)。平板静置5-10min，待滤纸上的液体被平板吸收后，倒置于培养箱中，28℃培养4h。
(4)用镊子取下平板上的滤纸片，加入无菌0.85％NaCl溶液，充分打散菌体。将打散的菌液浓度记为100，并依次稀释菌液浓度梯度为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5。将各浓度的菌液分别涂布于已准备好的TY+Amp100+Tc20平板上，每浓度梯度重复3个平板。
(5)将涂布好的平板放置28℃培养箱中，培养约2-3d后，挑取6-8个单菌落分别接种到准备好的TY+Amp100+Tc20的液体培养基中，置于28℃震荡培养。之后培养好的菌液用于质粒提取验证，同时保存菌种。
ACC脱氨酶活性的测定：
1)将菌株S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)在TY+Amp100+Tc20的液体培养基中30℃下过夜培养，4℃离心收集菌体；
2)菌体细胞用M9液体培养基洗涤两次，重新悬浮于1ml M9液体培养基中，之后将悬浮液加入到含有9ml M9的50ml锥形瓶中，加入100μl 0.5M ACC使最终浓度达到5mM；
3)将锥形瓶置于室温下，150rpm-1震荡培养12-18h之后，4℃离心收集菌体，于1.5ml离心管中，用0.1M Tris-HCl,pH 7.6洗涤两次；
4)弃掉上清，将收集的菌体重悬浮于400μl 0.1M Tris-HCl,pH 8缓冲液中，加入20μl甲苯并迅速剧烈旋涡震荡30s以破碎细胞；
5)取50μl含甲苯的细胞提取物于1.5ml离心管中，旋涡震荡5sec。
A.2管为50μl含甲苯的细胞提取物+5μl 0.5M ACC；
B.1管为50μl含甲苯的细胞提取物，不加ACC作为阴性对照；
C.1管为50μl 0.1M Tris-HCl,pH 8缓冲液+5μl 0.5M ACC作为阴性对照。
6)置于30℃培养30min，加入500μl 0.56M HCl，旋涡震荡5sec，4℃下14000rpm-1离心5min；
7)标准曲线的制备：
用0.1M Tris-HCl,pH 8的缓冲液稀释浓度为100mM的α-丁酮酸贮备液，制作0.05-0.5μmols范围的α-丁酮酸标准曲线。重复3次。
8)取500ul悬浮液或标准溶液于13×100mm大小的玻璃试管中，加入400μl0.56mol/L HCl和150μl 2，4-二硝基苯肼，旋涡混匀5sec；
9)置于30℃培养30min，加入1mL 2M NaOH，旋涡震荡混匀5sec后，用紫外分光光度仪在540nm波长下测定吸光度。
Bradford比色法测定总蛋白含量
1)样品准备：
于1.5ml离心管中稀释上述步骤中所得到的含甲苯的细胞提取物(26.5μl+173.5μl 0.1M Tris-HCl,pH 8)，加入200μl 0.1M NaOH旋涡震荡5sec，用封口膜封口，在沸水中煮沸10min，冷却。
2)BSA标准曲线的制作：
用10mg/ml BSA制作200-1000μg/ml范围的标准曲线。重复3次。
3)总蛋白含量的测定：
8μl待测样品或标准液加入加入792μl H2O和200μl BioRad蛋白染液，旋涡震荡5sec，静置5min，用紫外分光光度仪在595nm波长下测定吸光度。
ACC脱氨酶活单位为μmolα-丁酮酸*(mg Protein*h)-1。酶活性测定均扣除样品对照空白后计算，重复3次。
M9液体培养基配方：
将以上试剂分别灭菌后，按顺序依次溶解，最后用无菌ddH2O定容至500ml。
20×M9 Stock：
Na2HPO4 58g
KH2PO4 30g
NaCl 5g
分别溶解于ddH2O定容至500ml，于121℃灭菌15min。
0.5M CaCl2：准确称取3.68g CaCl2·2H2O,溶解于50ml ddH2O，于121℃ 灭菌15min。
1M MgSO4：准确称取12.32g MgSO4·7H2O，溶解于50ml ddH2O，于121℃灭菌15min。
0.3mg/ml维生素H：准确称取0.015g维生素H，溶解于50ml ddH2O，于121℃灭菌15min。
1M葡萄糖：准确称取9.01g葡糖糖，溶解于50ml ddH2O，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
ACC脱氨酶活性如图2所示。结果表明，所构建的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的ACC脱氨酶活性，与野生型菌株相比，提高了12.6倍。
菌悬液的制备与植物的种植
(1)供试菌株接种于TY液体培养液中，28℃摇床150r.min-1振荡培养24-30h至OD600约至0.8，菌悬液于8000r.min-1离心5min收集菌体，菌体用无菌ddH2O2清洗两次，重新悬浮于无氮营养液中备用。
(2)将100g植物种植基质Sunshine4TM mix至于盆钵中(直径为10cm)，盆底平铺一层纱布，以防渗漏，之后封口，121℃下高压蒸汽灭菌1h。之后将不同体积的Cu2+贮备液稀释于等体积的无菌无氮营养液(成分及配方见附录1)中，浇入到灭菌后的盆钵中，浇透(每盆约180ml)，使盆钵中铜胁迫的最终浓度为0，200，400mg/kg。将处理后的盆钵再次封口，于室温下平衡7d，使加入的铜溶液充分均匀地分布于栽培基质中。选用均匀，饱满，大小一致的种子(所用的天蓝苜蓿种子由甘肃农业大学草业学院曹致中教授提供)，75％乙醇浸泡5min，之后用20％次氯酸钠溶液(有效氯为8％)浸 泡10min，无菌水反复冲洗10次，于超净工作台播种于处理平衡后的栽培基质中，每盆播种8株，将盆钵置于植物光照培养箱中，培养条件如下：25℃，200μmol m-2s-1光照培养16h，21℃暗反应8h。约7d后第一片真叶长出，将制备好的菌悬液(约109CFU ml-1，每植株1ml)接种于植株根部，接种同体积无菌无氮营养液的植株作为空白对照，每个处理3盆重复。接菌后用透明的保鲜膜覆于盆钵口，避免外界杂菌的侵入及处理之间的交叉污染(约7d后将保鲜膜去除)。将接菌的当天记为0dpi(即接菌后0天)。植物生长期间按需浇无氮营养液(每盆每隔5-6d约150ml)。
所用无氮营养液成分及配方如下(g/L)：
Gibson微量元素液(g/L)
植物生长指标的测定及抗氧酶基因表达量的分析
待植物生长至40dpi后收获。用自来水小心地将根部清洗干净，用吸水纸将植株表面多余水分吸干，将植株地上部和根部分开，分别测量记录其鲜重，干重，根长，铜吸收量和乙烯含量，并利用qRT-PCR技术对植物地上部分和根部抗氧化酶基因的表达量进行分析。
(1)结果表明，与接种野生型菌株S.meliloti CCNWSX0020的植物相比，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的植物在200mg/kg Cu2+和400mg/kg Cu2+胁迫条件下，根部鲜重分别提高了31.8％和35.9％(图3A)。地上部分干重分别提高了31.6％和54.4％，根部干重分别提高了34.6％和39.4％(图3B)。与接种野生型菌株的植物相比，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的植物在400mg/kg Cu2+胁迫条件下，根长提高了29.0％(图4)。
(2)与接种野生型菌株S.meliloti CCNWSX0020的植物相比，接种本发明所构建的工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的植物在过量Cu胁迫下，将更大量的Cu2+富集到根部(图5A)。在200mg/kg Cu2+胁迫条件下，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的植物地上部分与根部的Cu总吸收量分别显著提高了47.5％和70.7％，而在400mg/kg Cu2+胁迫下，植物地上部分和根部的Cu总吸收量分别提高了60.9％和52.8％(图5B)。另外，在400mg/kg Cu2+胁迫条件下，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的植物Cu2+转运系数下降了33.3％(图5C)。这说明接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)在提高植物Cu总吸收量的同时，还有助于将大量的Cu固定在植物根部，减少向植物地上部分的运输。这也体现了工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)在治理土壤重金属污染的植物固定技术中的应用价值，降低重金属因迁移而引起水土流失，进入食物链危害 人类健康的风险。
(3)与接种野生型菌株S.meliloti CCNWSX0020的植物相比，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的植物在200mg/kg Cu2+和400mg/kg Cu2+胁迫条件下，根部所产生的乙烯含量分别下降了48.9％和22.8％(图6)。
(4)在400mg/kg Cu2+胁迫条件下，根部acdS的表达量较对照条件下的根部表达量提高了4倍(4.02±0.27，n＝3)，进一步证实了外源基因acdS在过量Cu胁迫条件下对植物生长的促进作用。
(5)在400mg/kg Cu2+胁迫条件下，接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的植物地上部分的CuZnSODc，FeSOD，CAT和APX表达量有明显提高(图7)，而在根部CuZnSODc，CuZnSODp，FeSOD，MnSOD，CAT，APX和GR的表达量提高的更为明显(约2.8-3.6倍)(图8)。
根瘤中S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)的还原与鉴定
从植物根部小心地摘下根瘤，用无菌水冲洗干净，用吸水纸吸干根瘤表面残留的水分，75％乙醇中浸泡2min，之后用20％次氯酸钠溶液(有效氯为8％)浸泡10min，无菌水反复冲洗10次。将表面消毒灭菌后的根瘤用灭过菌的镊子压碎，将压碎后从根瘤中挤出的汁液，划线接种到加有刚果红但不含任何抗生素的YMA培养基平板上，于28℃下培养2-3d，挑取100个单菌落在加有10μg mL-1四环素的YMA培养基上，如菌落能够正常生长则表明质粒pRKACC的存在。通过计数对四环素表现出抗性能够正常生长的单菌落个数，来得出质粒存在的稳定率。对于每一Cu浓度处理下所还原的质粒，其稳定性验证均重复3次，并在两次独立的生物学实验中进行(图9)。 实验结果表明，S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)能够顺利侵染植物根部形成根瘤，并且外源质粒pRKACC在Cu胁迫条件下成熟根瘤中的稳定性显著高于在对照条件下根瘤中的稳定性。
上述实施例中所提供的工程菌对植物生长及其铜耐受性的促进作用的研究是通过盆栽实验实现，采用根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020的宿主植物天蓝苜蓿，采用灭菌后的Sunshine4TM mix(Premier Horticulture，St.Catharines，Ontario，Canada)作为植物种植基质，分别选用浓度为200mg/kg和400mg/kg的Cu2+溶液处理作为中度铜与重度铜胁迫条件。植物生长过程所需要水分与营养通过无菌的无氮营养液适时适量补充。分别测定与分析不接菌对照、接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020、接种工程菌S.meliloti CCNWSX0020(pRKACC)，以及接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020与植物促生菌P.putida UW4的混合菌对不同程度铜胁迫下植物的生长，结瘤固氮，铜吸收量与转运系数，乙烯生成量，以及对植物抗氧化酶相关基因表达量的改变。

Claims (1)

1.用于表达ACC脱氨酶的工程菌用于提高苜蓿体内抗氧化酶系统对铜的响应的应用，所述用于表达ACC脱氨酶的工程菌的构建方法为：将表达ACC脱氨酶的外源基因acdS通过三亲本杂交的方法导入Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020中得到工程菌。
CN201410828330.XA 2014-12-26 2014-12-26 用于表达acc脱氨酶的工程菌及其应用 Active CN104560850B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410828330.XA CN104560850B (zh) 2014-12-26 2014-12-26 用于表达acc脱氨酶的工程菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410828330.XA CN104560850B (zh) 2014-12-26 2014-12-26 用于表达acc脱氨酶的工程菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104560850A CN104560850A (zh) 2015-04-29
CN104560850B true CN104560850B (zh) 2017-11-28

Family

ID=53077930

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410828330.XA Active CN104560850B (zh) 2014-12-26 2014-12-26 用于表达acc脱氨酶的工程菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104560850B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108277173A (zh) * 2018-01-12 2018-07-13 西北农林科技大学 一种提高重金属污染土壤中植物抗性的双接菌方法
CN112694996A (zh) * 2021-01-13 2021-04-23 南昌大学 一种人工构建植物促生复合功能菌群的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102816721A (zh) * 2012-08-10 2012-12-12 哈尔滨师范大学 一种产acc脱氨酶的根癌农杆菌ljl-6及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102816721A (zh) * 2012-08-10 2012-12-12 哈尔滨师范大学 一种产acc脱氨酶的根癌农杆菌ljl-6及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ethylene perception inhibitor 1-MCP decreases oxidative damage of leaves through enhanced antioxidant defense mechanisms in soybean plants grown under high temperature stress;M. Djanaguiraman等;《Environmental and Experimental Botany》;20110630;第71卷(第2期);摘要，第215页右栏第2段，第216页左栏第1段 *
Expression of an Exogenous 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate Deaminase Gene in Sinorhizobium meliloti Increases Its Ability To Nodulate Alfalfa;Wenbo Ma等;《Applied and Environmental Microbiology》;20041031;第70卷(第10期);摘要，第5893页左栏第3段，第5896页右栏第2段 *
Genes Conferring Copper Resistance in Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020 Also Promote the Growth of Medicago lupulina in Copper-Contaminated Soil;Zhefei Li等;《Applied and Environmental Microbiology》;20140117;第80卷(第6期);摘要 *
根瘤菌-豆科植物共生体系在重金属污染环境修复中的地位、应用及潜力;韦革宏等;《微生物学报》;20101104;第50卷(第11期);第1423页左栏第2段，第1427页左栏第2段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104560850A (zh) 2015-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101760438B (zh) 一株广谱抗真菌植物内生枯草芽胞杆菌及其应用
CN105483065B (zh) 一种吡咯伯克霍尔德氏菌及其在促进连香树生长中的应用
CN101851597B (zh) 一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法
CN104130958B (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹根结线虫病上的应用
CN102382791A (zh) 一种木霉菌发酵工艺
CN104542714B (zh) 根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020的应用
CN105368720B (zh) 棉花内生真菌cef-082及其在棉花黄萎病防治中的应用
CN103160442A (zh) 一株对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉菌株
CN109769535B (zh) 内生真菌菌株r5-6-1在防治水稻白叶枯病中的应用
CN104726378B (zh) 采用强化耐盐微生物菌剂提高盐胁迫草坪草保护酶活性的方法
CN109554316A (zh) 一种促进植物生长发育及强化积累污染土壤重金属的生物修复试剂及修复方法
CN101845409A (zh) 一株坚强芽孢杆菌及其应用
CN103087960A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌fqs38及其应用
CN109136137A (zh) 一种抗重金属的植物促生菌株及其应用
CN101215543A (zh) 一种防治甜瓜细菌性斑点病的菌株及其在田间防病中的应用
CN110055303A (zh) 一种高通量筛选用于防治植物土传真菌病害微生物的方法
CN105238723B (zh) 一种防治作物黄萎病的解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂
CN114134070A (zh) 一株芽孢杆菌及其在植物防病促生长中的应用
CN116948829A (zh) 一株用于促进番茄生长与防控番茄青枯病的原生生物尾滴虫njau-zg8及其应用
CN103146609B (zh) 一株荧光假单胞菌及其对辣椒疫霉病的防治方法
CN105441331A (zh) 一株露湿漆斑菌及其应用
CN104560850B (zh) 用于表达acc脱氨酶的工程菌及其应用
CN107227265A (zh) 一种胶质芽孢杆菌菌株及微生物菌剂
CN106434490A (zh) 人参防病促生细菌ty15‑2及其应用
CN105132332B (zh) 一株葡糖醋杆菌及其作为植物促生菌的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant