CN101210226A

CN101210226A - 获取生物肥料中胶冻样芽孢杆菌工程菌株的生产工艺

Info

Publication number: CN101210226A
Application number: CNA2006101483349A
Authority: CN
Inventors: 闫龙翔; 贾小红; 李芳柏; 李香真
Original assignee: LULE BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI
Current assignee: LULE BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-07-02

Abstract

本发明提供了一种获取生物肥料中胶冻样芽孢杆菌工程菌株的生产工艺。本发明的技术方案是在出发菌株的基础上，对菌株通过硫酸二甲酯处理及紫外线诱变处理，筛选出高产的、具有抗高温和耐酸碱的胶冻样芽孢杆菌突变菌株，并进行纯培养。采取本发明工艺，可进一步提高发酵生产的活菌数量和分泌大量的植物活性物质，使所得的胶冻样芽孢杆菌菌株的解钾解磷和固氮能力、抗旱抗病能力以及促进作物生长的能力得到提高，从而增强了生物肥料的肥效。

Description

获取生物肥料中胶冻样芽孢杆菌工程菌株的生产工艺

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种获取生物肥料中胶冻样芽孢杆菌工程菌株的生产工艺。

背景技术

化肥的过量应用，虽然提高了作物产量，却造成了土壤环境和农产品的严重污染，直接影响着人们的身体健康。生物肥料属于无公害、无污染的绿色农业生产资料，具有改良土壤、减少污染、增产增收的显著特点，对农业生产和环境保护具有十分重要的意义，受到世界农业的广泛关注。钾是作物生长所需要的大量元素，土壤和施肥是作物钾营养的主要来源，每亩土壤含钾量约1740Kg，而其中只有2％的代换性钾和水溶性钾可被作物吸收利用，而其余矿物态钾无法被作物直接吸收。胶冻样芽孢杆菌对矿物态钾具有很强分解能力，同时还有固氮、解磷的作用，所以胶冻样芽孢杆菌在生物肥料的生产中得到广泛应用。

目前在生物肥料的生产中，胶冻样芽孢杆菌种子的选育、活化和生产工艺程序如下：

斜面菌种→孢子悬液→到平板→挑去有典型特征的菌落→斜面→复筛→一级扩大培养→二级扩大培养→种子培养→发酵培养→吸附→成品。

这种生产工艺技术的缺点：

1、单从菌落特征无法准确判定生长势、活性强的菌株；

2、多次传代会使种子的活性逐渐降低；

3、发酵液菌数3亿个/ML，有效活菌数低，很难提高产品质量；

4、发酵液中生理活性物质含量低，不能明显的促进作物生长；

5、产品中胶冻样芽孢杆菌的解钾、解磷和固氮能力低；

6、产品中胶冻样芽孢杆菌的抗逆性差，在干旱、高温和强酸碱条件下容易死亡。

为了提高胶冻样芽孢杆菌的活性，增加发酵生产中的活菌数量，使胶冻样芽孢杆菌的肥效更加明显，本发明者利用物理和化学手段对胶冻样芽孢杆菌进行复合诱变，筛选出高产的、具有抗高温和耐酸碱的胶冻样芽孢杆菌突变菌株，突变株在发酵生产中，发酵液中的活菌数从3亿个/ML提高到20亿个/ML，而且可分泌大量的植物激素、氨基酸、有机酸等生理活性物质，大大提高了固氮、解磷和解钾的能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获取生物肥料中胶冻样芽孢杆菌工程菌株的生产工艺。

本发明的目的通过以下措施来实现：

本发明的生产工艺包括以下工序：斜面菌种→孢子悬液→到平板→挑取有典型特征的菌落→斜面→复筛→传代实验→一级扩大培养→二级扩大培养→种子培养→发酵培养→吸附→成品，

其特征在于，所述孢子悬液经诱变处理。

其中所述诱变处理包括硫酸二甲酯处理和紫外线诱变处理。

所述硫酸二甲酯处理包括以下步骤：

(1)将硫酸二甲酯用无水乙醇配制成0.5～0.7％(V/V)的溶液；

(2)将孢子悬液和硫酸二甲酯溶液与磷酸盐缓冲液混合，震荡80～100分钟；

(3)移取菌液到NaS₂O₃溶液和磷酸盐缓冲液中，终止化学诱变作用。

其中，在步骤(2)中所述震荡采用32℃往复式恒温摇床。

在步骤(2)和(3)中所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为7.0。

在步骤(3)中所述NaS₂O₃溶液的浓度为20～30％。

所述紫外线诱变处理包括以下步骤：

(1)移取经硫酸二甲酯处理的菌液于培养皿中；

(2)在紫外灯下32～35cm处照射3～5分钟。

其中，在步骤(2)中所述紫外灯的功率为20～30W。

本发明的技术优点：

1、通过理化处理，生长势弱的菌株被灭活，高活性的胶冻样芽孢杆菌菌株被筛选出来；

2、提高了发酵生产水平，可使发酵液的活菌数达到16-20亿个/ml比以前提高了6-7倍；

3、生长素、赤霉素和细胞分裂素等植物生理活性物质提高1-2倍；

4、提高了解钾、解磷和固氮能力，解钾能力提高3-4倍，解磷能力提高2-3倍；

5、提高了胶冻样芽孢杆菌耐酸碱和高温能力，pH在3.5-10.5，温度在50℃的不良环境下，胶冻样芽孢杆菌工程菌株能够存活；

6、降低了生产成本，比原来降低5-6倍，使产品更具有竞争力。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作更详细的描述。这些实施例仅仅是对本发明最佳实施方式的描述，并不对本发明的范围有任何限制。

实施例：

本发明的胶冻样芽孢杆菌工程菌株的生产工艺按下述工序进行：

1、斜面菌种：将斜面菌种在32℃恒温箱培养活化25-30小时左右；

2、孢子悬液：将活化菌株用生理盐水洗后，接种到盛有玻璃球的三角瓶中，在32℃恒温振荡30分钟后，血球记数板记数调整菌数浓度10⁵个/克；

3、硫酸二甲酯处理：

a、将硫酸二甲酯用无水乙醇配成0.5％(V/V)的溶液；

b、将制备的孢子悬液加入盛有16ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)的无菌三角瓶中，并加入0.5ml硫酸二甲酯(0.5％V/V)使它们充分混合，在32℃往复式恒温摇床上震荡80分钟；

c、移出3ml菌液加入0.5ml 20％的NaS₂O₃溶液和80ml磷酸盐缓冲液中，终止化学诱变作用；

4、紫外线诱变处理：

a、移取经硫酸二甲酯处理的菌液10ml-12ml于直径9cm的培养皿底座中；

b、在20w的长管型紫外灯下32cm处照射3分钟；

5、到平板：将经理化诱变处理的菌悬液接种到盛有胶冻样芽孢杆菌培养基的9cm的培养皿中，用接种针涂抹均匀，在32℃恒温箱培养30小时左右；

6、挑取有典型特征的菌落：挑选单个菌落，大小2-3mm，表面光滑、润湿，边缘整齐，凸起，粘稠发亮，不易挑起并拉丝的菌落接种到斜面培养基上，在32℃恒温箱培养30小时左右；

7、摇瓶初筛：

a将斜面的培养基与菌苔一起搅碎接种到三角瓶的液体培养基中，在32℃、180转/分的摇床下培养20小时左右；

b、吸取10ml涂平板培养，挑取有典型特征的菌落，然后接种斜面培养，具体方法同5、6；

8、复筛：用新的斜面重复以上1～7的选种过程；

9、一级扩大培养：取复筛斜面种子一支，将培养基与菌苔一起搅碎接种到三角瓶的液体培养基中，在32℃、180转/分的摇床下培养20小时左右；

10、二级扩大培养：用无菌吸管吸取30～40ml一级扩大培养瓶中的菌液，接种于二级扩大培养瓶中，放在大摇床32℃、180转/分培养17小时；

11、种子培养：按1％的接种量将二级扩大培养液接种到种子罐，在通风比为1∶1，罐压1.0Mpa，温度为32±2℃的条件下培养10小时；

12、发酵培养：将发酵好的种子液的2％接入发酵罐，在通风比1∶1，罐压1.0Mpa，温度32±2℃的条件下发酵培养24小时，发酵结束发酵罐活菌平板计数为2～3亿个/ml；

13、吸附：用灭过菌的载体吸附；

14、成品：称量包装成品入库。

Claims

1.一种获取生物肥料中胶冻样芽孢杆菌工程菌株的生产工艺，包括以下工序：斜面菌种→孢子悬液→到平板→挑取有典型特征的菌落→斜面→复筛→传代实验→一级扩大培养→二级扩大培养→种子培养→发酵培养→吸附→成品，

其特征在于，所述孢子悬液经诱变处理。

2.根据权利要求1所述的生产工艺，其中所述诱变处理包括硫酸二甲酯处理和紫外线诱变处理。

3.根据权利要求2所述的生产工艺，其中所述硫酸二甲酯处理包括以下步骤：

(1)将硫酸二甲酯用无水乙醇配制成0.5～0.7％(V/V)的溶液；

(3)移取菌液到NaS2O3溶液和磷酸盐缓冲液中，终止化学诱变作用。

4.根据权利要求3所述的生产工艺，其中步骤(2)中所述震荡采用32℃往复式恒温摇床。

5.根据权利要求3所述的生产工艺，其中步骤(2)和(3)中所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为7.0。

6.根据权利要求3所述的生产工艺，其中步骤(3)中所述NaS₂O₃溶液的浓度为20～30％。

7.根据权利要求2所述的生产工艺，其中所述紫外线诱变处理包括以下步骤：

(1)移取经硫酸二甲酯处理的菌液于培养皿中；

(2)在紫外灯下32～35cm处照射3～5分钟。

8.根据权利要求7所述的生产工艺，其中步骤(2)中所述紫外灯的功率为20～30W。