CN104844284A

CN104844284A - 一种根际促生型水溶性微生物菌肥

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Publication number: CN104844284A
Application number: CN201510148448.2A
Authority: CN
Inventors: 单宝龙; 陈雷; 谷巍; 侯红燕; 张建梅; 王红; 韩广泉; 谢全喜; 黄启亮; 乔蓬蕾; 张文; 于佳民; 王艳敏; 侯楠楠; 孙波; 王珂; 王春凤
Original assignee: SHANDONG BAOLAI-LEELAI BIO-ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: Shandong Baolai-leelai Bio-engineering Co., Ltd.; SHANDONG BILAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2035-03-31
Also published as: CN104844284B

Abstract

本发明公开了一种根际促生型水溶性微生物菌肥，是由蜡样芽孢杆菌GF-1、嗜热链球菌BLST、胶冻样芽胞杆菌G3、枯草芽孢杆菌B7348、枯草芽孢杆菌N9-1-35、植物乳杆菌LP和产朊假丝酵母CUM，在通用培养基上经有氧混合发酵得到的培养物制成；微生物菌肥中生物活菌总数大于或等于2×10¹⁰CFU/g。本发明还公开了该根际促生型水溶性微生物菌肥的制备方法。本发明的微生物菌肥利用外源添加植物促生菌和伴生菌来改善根系土壤的微环境，并且制成微生物菌肥施入土壤中，能有效改善土壤环境、促进植株生长、增加植株抗性。

Description

一种根际促生型水溶性微生物菌肥

技术领域

本发明涉及一种根际促生型水溶性微生物菌肥，属于微生物复合菌肥技术领域。

背景技术

土壤中的动植物残体、腐烂物以及在微生物参与下与土壤胶体颗粒复合形成的腐殖质，这些物质在分解和风化过程中释放出各种营养成分，直接影响着土壤养分的含量和多样性。土壤中的养分流失主要是通过作物吸收、地下渗水流失以及地表气体挥发三种途径，土壤天然养分的释放远远达不到作物正常发育的需求，需要外源施肥。这不但造成了大量不可再生资源的浪费，而且土壤的肥力降低、土质变坏，农作物的产量和品质也大幅降低。目前我国土壤中大多面临缺乏氮、磷元素。据统计，我国74％的耕地处于缺磷状态，且其中95％以上的为无效磷，不能被植物利用，施入土壤中的磷肥大多与土壤中Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Al³⁺结合形成难溶性的磷酸盐，加速土壤板结。此外，偏施氮肥，不但会影响作物的质量和产量，减弱作物的抗胁迫能力，还能导致土壤酸化加剧，诱发根腐病和蚧、螨等吸汁类害虫的病害，造成水体和土壤环境的污染。在合理利用生物资源的前提下，土壤可以更新农业自然资源、净化环境、自动调节生态平衡，因此，微生物菌肥应运而生，微生物菌肥是一种在有机物中加入合理配比的有益微生物，如各类有益的霉菌、固氮菌、磷细菌和钾细菌等制备而成的新型绿色肥料，是目前国内外肥料发展方向之一。

90年代初，我国投入对生物菌肥的研究和工厂化规模生产，并向商品化和标准化方向发展。目前市场上出现的一些生物菌肥对作物的增产和提高产品质量上起到了明显的效果。

目前我国微生物菌肥的研究尚且存在很多不足之处，如有些产品的有效成分含量相对还比较低，微生物种群不稳定，品种容易退化、繁衍系数不高，颗粒强度较低等，在长期的保存和运输过程中容易出现破碎和变质等问题。目前有关微生物菌肥的研究资料大多是关于肥效验证的，而作为提高微生物菌肥质量和产量化生产的关键步骤，即微生物菌肥的研制工艺流程方面的报道非常少，而且很笼统，没有生产价值，难以实现工厂化规模生产和产业化应用。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种根际促生型水溶性微生物菌肥，利用外源添加植物促生菌和伴生菌来改善根系土壤的微环境，并且制成微生物菌肥施入土壤中，能有效改善土壤环境、促进植株生长、增加植株抗性。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种根际促生型水溶性微生物菌肥，是由蜡样芽孢杆菌GF-1、嗜热链球菌BLST、胶冻样芽胞杆菌G3、枯草芽孢杆菌B7348、枯草芽孢杆菌N9-1-35、植物乳杆菌LP和产朊假丝酵母CUM，在通用培养基上经有氧混合发酵得到的培养物制成；微生物菌肥中生物活菌总数大于或等于2×10¹⁰CFU/g。

所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GF-1，为解磷功能菌株，已于2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011352；记载在申请人的另一项专利“一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用”(CN 102517238B)中。

所述嗜热链球菌BLST(Streptococcus thermophilus BLST)，为氨化功能菌株，已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2012282；记载在申请人的另一项专利“一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用”(CN 102899276B)中。

所述胶冻样芽胞杆菌G3(Bacillus mucilaginosus G3)，为解硅酸盐功能菌株，保藏编号为：CICC 21699，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

所述枯草芽孢杆菌B7348(Bacillus subtilis B7348)，为光合功能菌株，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260；记载在申请人的另一项专利“一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用”(CN 102120975B)中。

所述枯草芽孢杆菌N9-1-35(Bacillus subtilis N9-1-35)，为联合固氮性能菌株，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011301；记载在申请人的另一项专利“一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌及其应用”(CN 102329749B)中。

所述植物乳杆菌LP(Lactobacillus plantarum)，为根际促生菌，能够产3-吲哚乙酸(IAA)和嗜铁素，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCM 2010150；记载在申请人的另一项专利“一株可用于生物防腐保鲜的乳酸菌及其应用”(CN101914475B)中。

所述产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM，为根际促生菌，能够产3-吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和嗜铁素，已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010090；记载在申请人的另一项专利“一株具有较强有机硒耐受、富集和转化能力的酵母菌及其应用”(CN 101864369B)中。

所述通用培养基的组成为：按质量百分数计，马铃薯粉10％、硫酸铵0.4％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、蛋白胨0.1％、酵母粉0.3％、硫酸亚铁0.003％。

该根际促生型水溶性微生物菌肥的制备方法，步骤如下：

(1)种子液的制备：

将蜡样芽孢杆菌GF-1、嗜热链球菌BLST、胶冻样芽胞杆菌G3、枯草芽孢杆菌B7348、枯草芽孢杆菌N9-1-35、植物乳杆菌LP和产朊假丝酵母CUM的斜面菌株，利用接种环在无菌操作下挑取一环，分别接入到灭菌后的通用培养基中，恒温摇床培养，分别制备得到上述7株菌的种子液；

(2)二级扩大培养液的制备：

将步骤(1)制备的7株菌的种子液分别按体积比为1％的接种量共同接入到灭菌后的通用培养基中，恒温摇床培养，制备得到二级扩大培养液；

(3)发酵培养：

将步骤(2)制备的二级扩大培养液按体积比为2％的接种量接入到装有通用培养基的发酵罐中，发酵培养，发酵完全后按质量比为10％加入脱脂奶粉作为保护剂，制备成冻干粉，即得。

步骤(1)、(2)和(3)中，所述的通用培养基，其组成为：马铃薯粉10％、硫酸铵0.4％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、蛋白胨0.1％、酵母粉0.3％、硫酸亚铁0.003％，均为质量比；

步骤(1)和(2)中，通用培养基的灭菌方法为：121℃灭菌20分钟；

步骤(1)和(2)中，恒温摇床培养的条件为：30℃恒温摇床120转/分钟培养24h。

步骤(3)中，发酵培养的条件为：37℃，120转/分钟，恒温培养24小时。

本发明采用如下原理实现：本发明运用了微生物生态学、土壤学以及土壤养分与植物互作原理，以培养基为介质，通过菌种活化、上罐发酵、冷冻干燥的过程制备的，是物理和化学手段的经典组合。土壤肥料学的经典理论表明：土壤微生物菌肥不仅仅是高级的肥料，又是土壤的改良剂，一旦施入土壤中，微生物就利用土壤中的有机质、腐殖质等物质进行吸附、定殖，使这些物质转化为可被植物利用的氨基酸和蛋白质等养分，不仅可以减少化肥的使用量，还能大大提高土壤已施化肥的利用率。

本发明是申请人从菌种库保存的大量菌株中，利用菌株的特异性和产酶特性，筛选出具有特殊功能的菌株：解磷功能菌株、氨化功能菌株、解硅酸盐功能菌株、光合功能菌株、联合固氮性能菌株、辅助解有机质功能的酵母菌株、调节pH功能的乳酸菌菌株，以及产根际促生素3-吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、嗜铁素性能的根际促生菌菌株和伴生菌菌株共7株。将这7株菌进行复配，以通用培养基为介质进行扩大培养，并以2％的接种量进行发酵罐的通氧混合发酵，后制备成菌粉，灌根施入土壤中，能改善土壤环境、促进植株生长、增加植株抗性，使作物增产增收。这种菌粉型的微生物复合菌肥的生物活菌总数≥2×10¹⁰CFU/g，可以在密封的环境中，±20℃环境温度中保持12个月不变质，是一种极好的作物水溶性的微生物菌肥，具有廉价环保的特性。

本发明研究得到植物生长的根际环境中的微生物菌群，对植物的生长发育、致病、抗逆和有效成分的生成均起着重要的作用，从而利用外源添加植物促生菌和伴生菌来改善根系土壤的微环境，并且制成微生物菌肥施入土壤中，检测各类菌群对土壤肥力的影响，以及对作物生长发育和有效成分的影响。本发明通过从实验室内保藏的菌种中筛选得到促进植物生长和伴植物生长的有益菌株及其他的优势菌株，并将筛选出的菌株进行复合，成功分析出复合之后的发酵菌株对土壤肥力的改良和对植物生长各个阶段以及有效成分积累的影响。从而将获得的具有特异性能的菌株进行复配，研制出具有改善土壤环境、促进植株生长、增加植株抗性的微生物菌肥。需要说明的是，制备本发明的微生物菌肥所选用的各株菌，并非是简单的选择和组合，因为不同的菌株分别具有各自的特异性和产酶特性，将不同的菌株进行复配，菌株之间是否会存在拮抗作用，不同菌株的特性在复配之后能否得到保持，等等，这些都属于不可预知的，也远非能通过有限次的实验所能得到的。

本发明的有益效果：

(1)本发明的根际促生型水溶性微生物菌肥能够改良土壤的理化性质，提高土壤中有效菌的含量、提高土壤有机质的分解、提高土壤有效养分的释放，最终实现逐年减少化肥、农药的使用量。

(2)本发明的根际促生型水溶性微生物菌肥能够提高植物的代谢能力，促进植物的根系生长，使其发达，提高植株可溶性糖和叶绿素的含量，增强植物的抗逆性能，提高植物的光合作用。

(3)本发明的根际促生型水溶性微生物菌肥投入低，回报高，能够确保土壤的可持续发展。

(4)本发明的根际促生型水溶性微生物菌肥能够改善植物的品质，特别是叶菜类作物，植物的叶片嫩绿、无化学污染，且可以提高产量18％，全面提高叶菜类产品的市场竞争力。

(5)本发明的根际促生型水溶性微生物菌肥制备工艺简单，各复配菌在同一培养基上混合发酵培养即得，各菌株间无拮抗作用，无需使用多种培养基分别培养，简化了生产工艺，降低了生产成本，便于实现工业化生产。

附图说明

图1为解磷功能菌株解磷能力测定结果；

图2为解硅酸盐功能菌解硅酸盐能力测定结果；

图3为联合固氮功能菌固氮能力测定结果；

图4为氨化功能菌的氨化能力测定结果；

图5a-图5d为施用菌肥和未施用菌肥白菜长势对比图；

图6为微生物菌肥对株高的影响结果；

图7a为微生物菌肥对根长的影响；

图7b为微生物菌肥对根径粗的影响；

图8a为微生物菌肥对植物地上部分鲜重增重的影响；

图8b为微生物菌肥对植物地下部分鲜重增重的影响；

图9a为微生物菌肥对植物中可溶性糖含量的影响；

图9b为微生物菌肥对植物中叶绿素含量的影响。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：功能菌株的筛选

1试验材料

1.1菌种

山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏室提供的80株菌，包含细菌、酵母菌、乳酸菌及丝状菌。

1.2培养基

具有解磷功能菌株的筛选培养基(蒙金娜培养基)：葡萄糖1％、(NH₄)₂SO₄0.05％、MgSO₄0.03％、NaCl 0.03％、KCl 0.03％、FeSO₄0.0036％、MnSO₄0.003％、CaCO₃0.5％、卵磷脂0.02％、琼脂1.5％，pH7.2。均为质量百分比。

具有光合功能菌株的筛选培养基：

(培养基Ⅰ)：KH₂PO₄0.5g/L、K₂HPO₄0.6g/L、(NH₄)₂SO₄1.0g/L、MgSO₄0.2g/L、NaCl0.2g/L、CaCl₂0.05g/L、酵母膏0.1g/L、微量元素1mL/L、生长因子1mL/L、pH 6.7；

(培养基Ⅱ)：KH₂PO₄1.0g/L、NH₄Cl 1.0g/L、MgCl₂0.2g/L、CaCl₂0.05g/L、微量元素1mL/L、生长因子1mL/L、pH 7；

微量元素：Na₂EDTA 2g/L、FeSO₄2g/L、H₃BO₃0.1g/L、CoCl₂0.1g/L、ZnCl₂0.1g/L、MnCl₂0.1g/L、Na₂MoO₄0.2g/L、NiCl₂0.02g/L、CuCl₂0.01g/L、Na₂SeO₃0.001g/L；

生长因子：VB10.5g/L、VB20.05g/L、VPP(烟酸)0.5g/L、VB6(吡哆酸)0.1g/L、对氨基苯甲酸0.3g/L、生物素0.05g/L(4℃保存)。

具有解硅酸盐功能菌株的筛选培养基：蔗糖0.5％、质量浓度为1％的FeCl₃数滴、Na₂HPO₄0.2％、MgSO₄0.05％、硅酸钾0.15％、琼脂1.5％，pH7.2。均为质量百分比。

具有联合固氮功能菌株的筛选培养基(Ashby培养基)：葡萄糖1％、NaCl 0.02％、K₂HPO₄0.02％、CaCO₃0.5％、MgSO₄0.02％、CaSO₄0.02％、琼脂1.5％、pH7.2。均为质量百分比。

具有氨化功能菌株的筛选培养基：K₂HPO₄0.05％、MgSO₄0.05％、NaCl 0.025％、FeSO₄0.001％、蛋白胨0.5％、琼脂1.5％、pH7.2。均为质量百分比。

King氏培养基：蛋白胨2％、K₂HPO₄0.115％、MgSO₄0.15％、甘油15mL/L、L-色氨酸0.01％。均为质量百分比。

上述所用试剂均为分析纯。

1.3试剂及配方

1.3.1解磷能力测定试剂及配方

磷标准液：KH₂PO₄在干燥杯中105℃烘2h，少量水溶解，加入5mL浓H₂SO₄/100mL，配置成0.1mg/mL的储备液，用时稀释成50μg/mL的磷标准液。

5％H₂SO₄(98％浓硫酸：水＝5：95，体积比)、10％(质量比)NaOH溶液、0.2％(质量比)的2,4-二硝基酚指示剂。

钒钼酸试剂：配置6.25％(质量比)的钼酸铵溶液为A液400mL；用300mL沸水将1.25g的偏钼酸铵充分溶解，冷却后加入HNO₃溶液250mL为B液；将A液缓慢加入B溶液中，定容至1L，棕色瓶贮存。

1.3.2解硅酸盐活性测定试剂及配方

钾标准液：将KCl在干燥杯中110℃烘干2h至恒重，取0.1907g，少量水稀释后定容至1L，带盖塑料瓶贮存。

四苯基硼酸钠溶液：称取15g四苯基硼酸钠溶于960mL水中，加入400g/L的NaOH 4mL和100g/L的MgCl₂20mL，混匀静止15min后过滤入棕色瓶中保存。

40g/L EDTA、30％或37％(体积比)的甲醛溶液、酚酞指示剂。

1.3.3氨化能力测定试剂及配方

无氨水的制备：将浓硫酸按照0.1mL/1000mL，在蒸馏装置中蒸馏，弃去初始蒸馏液约50mL，收集继续的蒸馏液棕色瓶保存。

硝态氮标准液：将KNO₃在干燥杯中105℃烘约6h至恒重，配置100μg/mL的KNO₃储备液，试验中利用10倍的稀释液作为硝态氮标准液。

氨态氮标准液：将(NH₄)₂S0₄在干燥杯中105℃烘约6h至恒重，配置100μg/mL的KNO₃储备液，试验中利用10倍的稀释液作为硝态氮标准液。

0.02mol/L的EDTA标准溶液、NaOH使用液(0.3mol/L)、1％(质量比)的苯酚溶液。

1.3.4联合固氮菌固氮能力测定试剂及配方

定氮混合指示剂：0.5g溴甲酚绿加入0.1g甲基红和100mL 95％乙醇混匀。

30％过氧化氢、40％(质量比)NaOH、2％(质量比)硼酸、0.05M硫酸标准液。

1.3.5生长素IAA测定试剂及配方

比色液Ⅰ：将FeCl₃配置成0.5M的水溶液，取1mL该溶液加入到50mL水中，再缓慢加入浓硫酸3mL，配置成比色液Ⅰ；

比色液Ⅱ：准确称取4.5g的FeCl₃加入到1L的10.8M浓硫酸中，混匀后配置成比色液Ⅱ。

1.3.6赤霉素GA的测定试剂及配方

70％乙醇、98％浓硫酸，均为分析纯。

1.3.7产嗜铁素含量测定试剂及配方

CAS检测液配制：A液：0.079g CAS(Chromeazuorls.铬天青)溶于50mL去离子水中，再加入10mL的1mM FeCl₃水溶液；

B液：0.069g HDTMA(十六烷基三甲基溴化铵，又名CTAB)溶于40mL去离子水中。

将A夜缓慢加入B液中，轻晃摇匀既得CAS检测液，121℃灭菌15min。

生物缓冲液pips(2-乙烷磺酸)：称取1.5g pips溶于400mL去离子水中，利用固体NaOH调节pH至6.7，再用液体NaOH调pH至6.9，去离子水定容至500mL，4℃保存。

1mM CaCl₂、1mM MgSO₄、10％(质量比)酸水解酪蛋白；

CAS培养基配制：量取0.2mL CaCl₂溶液、0.2mL MgSO₄溶液以及6mL 10％酸水解酪蛋白溶液，利用pips缓冲液调pH至6.8-7.0，去离子水定容至100mL，加入2g琼脂，121℃灭菌15min，温度降至60℃时加5mL CAS检测液混匀。

2试验方法

2.1解磷功能菌株的筛选

(1)检测备选菌株牛津杯培养的菌落水解圈直径：将80株菌分别制备菌悬液，利用牛津杯法在蒙金娜培养基上，30℃培养3-5d进行菌株的解磷能力的测定，即解磷水解圈的测定，选出酶促反应指数EI最大的菌株，EI＝水解圈直径/菌株直径。将能够产生水解圈的按照Pc进行命名。

(2)解磷能力测定：

采用钼锑钪比色法进行解磷能力的测定，磷标准液各取0、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3mL于25mL具塞刻度管中，各加入0.5mL的空白消煮液，加少量的水，加入二硝基酚指示剂2滴，利用NaOH或者H₂SO₄溶液调至微黄色，再加入钒钼酸5mL，混匀后定容至刻度，每管的磷含量为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/mL，利用751-CW分光光度计测定吸光度A，制定硝态氮标准曲线。

取0.5mL发酵上清液定容至25mL，测定吸光度，计算磷含量：

2.2光合功能菌株的筛选

(1)菌种的初步筛选：将80株菌在光合菌富集培养基Ⅰ、Ⅱ上进行划线培养，暗室放置数小时或1昼夜后移至光照条件下培养5-7天，能够生长的菌株可以初步断定具有光合能力。

(2)通过菌落的形态以及镜检菌体形状来判断光合菌。

将具有光合功能的菌株以Ⅰ、Ⅱ命名。

2.3解硅酸盐功能菌株的筛选

将具有解硅酸盐能力的菌株以K命名。

解硅酸盐活性测定：经筛选到的单菌株接入解硅酸盐菌株培养基中，180r/min震荡培养48h，5倍稀释上清液25mL于200mL烧杯中，加入20mL的EDTA溶液，滴入2-3滴酚酞指示剂，用NaOH调至出现红色再过量1mL，加入0.5mL甲醛，通风处煮15min，冷却，搅拌下加入四苯基硼酸溶液7.5mL，静置15min以上，倾去上清，将沉淀转移至玻璃埚内洗5-7次，120℃烘1.5h称重。利用以下公式计算解硅酸盐活性：

X＝131.4×[(M2-M1)-(M4-M3)]/MO

M0：试样质量，g

M1：玻璃埚质量，g

M2：加入沉淀是玻璃埚质量，g

M3：空白玻璃埚质量，g

M4：空白试验过滤后玻璃埚质量，g

131.4：四苯基硼酸钾，换算为K₂O的系数。

2.4联合固氮功能菌株的筛选

将具有联合固氮功能的菌株以L命名

固氮能力测定：挑取单菌落接入Ashby液体培养基中进行摇床培养，将发酵液3000rpm，10min离心得到上清，取2g于锥形瓶中加入5mL浓硫酸、1.5mL过氧化氢，瓶口放上弯颈漏斗过夜，电炉上加上至冒烟，取下冷却后滴加过氧化氢，加热至溶液无色或淡黄色，加热除尽过氧化氢，冷却加水20-30mL煮沸，冷却定容至100mL。空白除不加样品外，其他做同样操作。

吸取消煮液50mL，加入200mL水、15mLNaOH混匀，取100mL加入含有10M硼酸和5滴混合指示剂的三角瓶，用硫酸标准液标定至液体由蓝色刚变至紫色为终点，记录消耗酸体积。

利用以下公式计算固氮能力：

N含量＝(V-V₀)×C×0.014×D×1000/m

V：耗酸体积，mL

V₀：空白液耗酸体积，mL

C：酸标准液浓度，0.05

0.014：与1mL0.5M硫酸相当的以g计的N质量

D：分取倍数，定容体积/分取体积＝100/50

m：称量样品质量

1000：换算成Kg的含量

2.5氨化功能菌株的筛选

将具有氨化功能的菌株以A命名

氨化能力测定：NO₃-N在220nm的波长下有特征吸收峰，利用分光光度法测定。将硝态氮标准液各取0、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3mL于25mL具塞刻度管中，各加入0.5mL的空白消煮液，稀释至刻度线，每管的NO₃-N含量为0、5、10、15、20、25、30μg，利用751-CW分光光度计测定吸光度A，制定硝态氮标准曲线。将0.5mL的样品消煮液用无氨水稀释至10mL，测定吸光度，计算NO₃-N含量：

1g样品中硝态氮含量＝m₂×50/m₁×V，其中m₂表示样品消煮液中NO₃-N的含量，单位是μg；m₁表示样品的质量，单位是g；V表示分取液体积，单位为mL；50表示样品稀释体积，单位为mL。

2.6产根际促生素、促生物质菌株的筛选

2.6.1产生长素(IAA)菌株的筛选

(1)将单菌株接入到King氏培养基上进行发酵培养；

(2)定性测定：取50μL发酵液于白色瓷板上，加入50μL比色液Ⅰ，对照只加50μL比色液Ⅰ，立即将白瓷板放于暗室，30min内变红色表示能够分泌IAA，颜色越深表示菌株的分泌能力越强，不变色表示不能分泌；

定量测定：培养液于4℃，10000rpm离心10min，取上清1mL，加入1mL比色液Ⅱ，暗室放置30min，530nm下测定吸光度A。

2.6.2产赤霉素(GA)菌株的筛选

(1)将单菌株发酵培养；

(2)GA的测定方法：取5mL发酵液溶于适量的70％(体积分数)乙醇中，取0.5mL加入4.5mL98％(体积分数)浓硫酸混匀后定容至25mL，在412nm下测定吸光度A；对照空白不加发酵液，其他做相同处理。

2.6.3产嗜铁素的测定

将菌株接入到CAS培养基中进行单菌落晕圈的观测，如果菌株能够有黄绿色晕圈产生则说明该菌具有产嗜铁素的能力。

3试验结果与分析

3.1解磷功能菌株(Pc菌株)的筛选

经过单菌株的牛津杯水解效果实验，得到了8株能够解磷的菌株，其菌落水解圈直径以及酶促反应指数EI的结果如表1所示；结果表明Pc-2菌的EI值最大，高达4。

表1解磷菌株水解圈比较结果

钼锑钪比色法测定解磷能力的结果如图1所示，结果表明Pc-2菌的解磷能力最强为3.9mg/L，与表1的水解圈结果相同。经过菌种库保藏号比对为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GF-1，已于2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2011352。

3.2光合功能菌株的筛选

根据菌株的单菌落形态的色泽以及革兰氏染色结果，筛选得到了5株能利用培养基Ⅰ和3株能利用培养基Ⅱ的菌株，经过菌株的活性和生长速度试验，最终选择具有光合功能的菌株I-1。经过菌种库保藏号比对为枯草芽孢杆菌B7348，Bacillus subtilis B7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260。

3.3解硅酸盐功能菌株的筛选

根据单菌株在特异性解硅酸盐培养基上的生长测定实验，选择了8株解硅酸盐菌株，其解硅酸盐能力的测定结果如图2所示，结果表明K-5的解硅酸盐能力最强。经过菌种库保藏号比对为胶冻样芽胞杆菌G3(Bacillus mucilaginosus G3)，其保藏编号为：CICC 21699，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

3.4联合固氮功能菌株的筛选

经过具有联合固氮功能菌株的固氮效果验证实验，得到了9株能够解氮的菌株，其菌落水解圈直径结果如表2所示。

表2联合固氮功能菌固氮圈的测定结果

L-2菌的菌落固氮圈最大，其固氮能力测定结果如图3所示。结果表明L-2菌的固氮能力最佳，这与固氮圈的测定结果相同。经过菌种库保藏号比对为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2011301。

3.5氨化功能菌株的筛选

根据单菌株在特异性氨化培养基上的生长测定实验，选择了11株菌，其氨化能力测定结果如图4所示，结果表明A-7菌的解氨能力最强。经过菌种库保藏号比对为嗜热链球菌BLST(Streptococcus thermophilus BLST)，已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2012282。

3.6产根际促生素、促生物质菌株的筛选

3.6.1产根际生长素(IAA)的菌株的筛选

将3.1-3.5所述的具有相应功能的菌株接种到King氏培养基进行发酵，利用Salkowski比色法测定发酵液中IAA的含量，从而选定高产IAA的菌株，最终从中选择了高产IAA的菌8株分别为：L-2、A-7、I-1、X-2、K-5、Pc-2、JM(产朊假丝酵母)、LP(植物乳杆菌LP)，其测定结果如表3所示。

表3菌株产IAA的定量测定结果

3.6.2产赤霉素(GA)的菌株的筛选

将3.1-3.5所述的具有相应功能的菌株接种到每株菌相应的培养基中进行发酵试验，利用醇提和分光光度法测定发酵液中GA的含量，从而选定高产GA的菌株，最终选择了高产GA的菌株为：L-9、A-7、I-3、X-2、JM(产朊假丝酵母)、K-10、Pc-3。其GA含量测定结果如表4所示。

表4菌株产GA的定量测定结果

3.6.3产嗜铁素菌株的筛选

将分离得到的菌株接种到CAS培养基中，铬天青染色液染色，能够产生黄色晕圈的菌株则具有产嗜铁素的能力，筛选的菌株为L-2、L-9、A-7、I-1、X-2、JM(产朊假丝酵母)、K-5、Pc-2、LP(植物乳杆菌LP)。

4总结

利用特异性培养基对功能菌株进行筛选，又经过产IAA、GA、嗜铁素根际促生物质的筛选，最终选择了7株菌为配方菌株，根据公司菌种保藏号的查询，这7株菌分别为：

具有解磷功能菌Pc-2，为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GF-1，已于2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011352；记载在申请人的另一项专利“一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用”(CN 102517238B)中。

具有氨化功能菌A-7，为嗜热链球菌BLST(Streptococcus thermophilus BLST)，已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2012282；记载在申请人的另一项专利“一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用”(CN 102899276B)中。

具有解硅酸盐性能菌K-5，为胶冻样芽胞杆菌G3(Bacillus mucilaginosus G3)，为解硅酸盐功能菌株，保藏编号为：CICC 21699；购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

具有产生长素(IAA)、赤霉素(GA)和嗜铁素的功能性菌株，产朊假丝酵母(Candidautilis)CUM，已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCM 2010090；记载在申请人的另一项专利“一株具有较强有机硒耐受、富集和转化能力的酵母菌及其应用”(CN 101864369B)中。

具有光合能力菌I-1，为枯草芽孢杆菌B7348(Bacillus subtilis B7348)，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260；记载在申请人的另一项专利“一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用”(CN 102120975B)中。

具有联合固氮性能菌L-2，为枯草芽孢杆菌N9-1-35(Bacillus subtilis N9-1-35)，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011301；记载在申请人的另一项专利“一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌及其应用”(CN 102329749B)中。

具有产生长素(IAA)和嗜铁素功能的菌株，植物乳杆菌LP(Lactobacillus plantarum)，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2010150；记载在申请人的另一项专利“一株可用于生物防腐保鲜的乳酸菌及其应用”(CN 101914475B)中。

实施例2菌剂的制备

1试验材料

培养基制备的各种营养元素；

2试验方法

2.1通用培养基的筛选

在利用糖类代替LB培养基中的蛋白质配制培养基的基础上，添加微生物生长所需的中微量元素进行通用培养基的筛选，将初筛得到的菌株接种到液体培养基中，以OD值和有效活菌数为测定指标进行筛选。

2.2菌株的拮抗试验

配制通用培养基，利用生长对峙法将备选菌株进行拮抗实验，观察所选的菌株的拮抗状况。

2.3菌剂制备

(1)配方设计：按照目前微生物菌剂的剂型和组成设计配方；

(2)菌剂制备：将培养好的备选菌株接种在通用培养基中，30℃，120r/min培养24小时；将扩大培养基的菌株按照配方设置接种到500mL发酵瓶中，接种量为1mL/瓶，120r/min培养48小时。

(3)检测菌剂的活菌数：将发酵完全的菌种发酵液进行菌种计数，计数浓度为10^-5到10^-7。

3试验结果与分析

3.1通用培养基的筛选结果

最终确定的通用培养基为：马铃薯粉10％、硫酸铵0.4％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、蛋白胨0.1％、酵母粉0.3％、硫酸亚铁0.003％。(上述均为质量百分比)

3.2菌株拮抗试验结果

配制通用培养基，利用生长对峙法将备选菌株进行拮抗实验，观察所选的菌株的拮抗状况，测定结果如表5所示。

表5菌株拮抗实验结果

由表5可知，各个菌株之间均属于阴性，表明各菌株之间没有拮抗作用，可以进行混合发酵。

3.3根际促生型水溶性微生物菌肥的制备

3.3.1根际促生型水溶性微生物菌肥的制备工艺

将7株菌在发酵罐进行有氧混合发酵。具体为：三角瓶洗净，按照1/3的量加入通用培养基(马铃薯粉10％、硫酸铵0.4％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、蛋白胨0.1％、酵母粉0.3％、硫酸亚铁0.003％，均为质量比)，121℃灭菌20分钟；将蜡样芽孢杆菌GF-1、嗜热链球菌BLST、胶冻样芽胞杆菌G3、枯草芽孢杆菌B7348、枯草芽孢杆菌N9-1-35、植物乳杆菌LP和产朊假丝酵母CUM 7株菌的斜面菌株，利用接种环在无菌操作下挑取一环，分别接入到灭菌后的通用培养基中，30℃恒温摇床120转/分钟培养24h，分别制备得到上述7株菌的种子液；将制备的7株菌的种子液分别按体积比为1％的接种量共同接入到灭菌后的通用培养基中，30℃恒温摇床120转/分钟培养24h制备二级扩大培养液；将二级扩大培养液按体积比为2％的接种量接入到装有通用培养基的发酵罐中，37℃，120转/分钟，恒温培养24小时，发酵完全后按质量比为10％加入脱脂奶粉作为保护剂，制备成冻干粉，即得根际促生型微生物菌肥。

3.3.2微生物菌肥的菌含量

将制备的微生物菌肥进行活菌含量的测定，每批次的计数结果中，微生物菌剂的活菌总数均≥2×10¹⁰CFU/g。根据微生物肥料的国家标准NY227-1994的规定，固体微生物肥料的活菌总数≥2.0×10⁹CFU/g。因此，本实施例制备的微生物菌肥的活菌总数均达到了国家固体微生物肥料的活菌数标准。

实施例3根际促生型水溶性微生物菌肥的效果验证

1试验材料

实施例2中3.3制备的根际促生型水溶性微生物菌肥；

白菜品种：市售精棚-秋福九号；

2试验方法

2.1试验分组：A:空白Control组(不施化肥和肥料的空白组)；B:CK-Ⅱ(单施化肥碳酸氢铵组，2000倍水稀释180kg/hm²)；C:CAMP(根际促生型水溶性微生物菌肥，为本发明实施例2制备的微生物菌肥，2000倍水稀释180kg/hm²)。

2.2大田育苗试验：将白菜种子用30℃的水浸泡1h，用纱布包裹、油纸密封约32h；翻耕1m×4m的土地，耙平作为育苗床，将达到出芽80％的番茄种子均匀撒到育苗床上，用沙土过筛后撒到种子上，喷水，覆膜，进行大田栽培种子的培育。

2.3试验处理：每个处理组有3个重复，每个重复10株番茄，株间距10cm，行间距25cm，共3个小区，双排双灌。

2.4土壤和植株采集：在白菜植株生长至5-6cm时进行上述2.3的试验处理，在处理后的2周、中期4周、6周进行样本采集。

2.5土壤采集：四分法保留样品；采集土壤样品，进行菌种的计数，计数浓度为10^-5到10^-7。将采集的土壤自然风干后测定有效氮、磷含量。

2.6植株指标测定：测定叶片中叶绿素以及可溶性糖含量；在第6周采集样本时测定植株的总重、株高、地下根长、根茎粗、干鲜重、可溶性糖及叶绿素含量。

3试验结果和分析

3.1植株总体长势

在试验施肥6周后进行样本采集，比较植株的总体长势，其比较结果如图5a-图5d所示。结果表明，菌肥CAMP组的白菜叶片嫩绿，无化学污染(图5a)，而对照组的叶片发黄(图5b)；从株体总体长势上看，菌肥CAMP组的白菜明显比对照组的个体大(图5c)；从植株的根系外观比较上看，菌肥CAMP组的根系不仅直径粗，而且须根发达，根长也较长(图5d)。这表明了施用本发明制备的菌肥可以显著的改善植物的品质，提高植物的市场竞争力。

3.2微生物菌肥对株高的影响

植株的株高比较结果如图6所示，与空白Control组和单施化肥组CK-Ⅱ相比，菌肥CAMP组的增长趋势最显著，菌肥CAMP组的株高最高达到了52cm，其次是单施化肥的CK-Ⅱ的株高为49cm左右，因此菌肥CAMP组的株高比Control组高11％，比CK-Ⅱ组高6％。

3.3微生物菌肥对根指标的影响

根构成了植物的地下部分，主要起到吸收作用，植物可以通过根吸收到土壤里的水分、无机盐类以及某些小分子化合物，根系越长，植物越能适应外界环境从更深或者更远的土层吸收养分，增加植物对外界环境的适应能力。生物菌肥对白菜植株根系指标的影响结果如图7所示，其中图7a为根长的比较图，图7b为根直径的比较图；菌肥CAMP组的根长和径粗均不同程度的高于其他组，菌肥CAMP组根长比空白Control组长51％，比单施化肥CK-Ⅱ组长10％(图7a)；菌肥CAMP组径粗比空白Control组的粗8.8％，比单施化肥CK-Ⅱ组的粗2.7％(图7b)。这说明该微生物菌肥能增强植株的生根能力，可以使植物具有较强的耐受干旱、低肥等胁迫能力。

3.4微生物菌肥对植物增重的影响

植物的鲜重与有机物的积累呈正相关，相同时间内积累量越多，代表植株的呼吸速度越快，同时也能表明植株的光合作用比较强。地上部分鲜重，菌肥CAMP组的鲜重高达2.45Kg，比空白Control组高25％，比单施化肥CK-Ⅱ组高9％(图8a)；菌肥CAMP组的鲜重结果最高为16g，比空白Control组的高28％，比单施化肥CK-Ⅱ组的高6.7％(图8b)。这表明该微生物菌肥的增产效果明显。

3.5微生物菌肥对抗性指标和生长指标的影响

植株中的可溶性糖含量植株耐受干旱能力、抗病虫害胁迫能力呈正相关，植株叶片中可溶性糖含量越高表明植株耐受外界环境胁迫的能力越强。菌肥CAMP组的可溶性糖含量均显著高于其他组(图9a)，比空白Control组和单施化肥CK-Ⅱ组的高出约2倍，这表明该微生物菌肥可以显著增加植株的抗逆性。

植株叶绿素的含量与植株的生长速率成正比，叶绿素含量越高表明植株的生长速度以及代谢速度越快。菌肥CAMP组叶绿素含量最高(图9b)，这表明使用该微生物菌肥可以增加植株的代谢速度。

3.6微生物菌肥有效菌在根际的定殖

将采集到的土壤样本进行活菌总数的测定，结果见表6。

表6微生物菌肥有效菌在土壤中的定殖

注：*表示与空白组Control比较差异显著(P﹤0.05)；**表示与空白组Control比较差异极显著(P﹤0.01)；△表示与单施化肥组CK-Ⅱ的比较差异显著(P﹤0.05)。

由表6可知，空白对照组的菌含量没有显著的差异，其余各组的菌含量均有明显的变化，从第二周开始施用菌肥CAMP组均比其他两个对照组中的菌含量高出一个数量级，这表明了施用该微生物菌肥可以提高土壤中的有效菌的含量。

同时有效菌含量增高可以显著增加土壤中各种酶的活性，可以提高土壤的呼吸度以及土质的营养水平。

3.7微生物菌肥对土壤矿化速度的影响

土壤氮含量的变化可以有效的表明土壤的矿化速度，有效菌将土壤中固定的氮释放程度增加时表明土壤的矿化速度增加，各处理组中有效氮的比较结果如表7所示。

表7微生物菌肥对土壤氮素的影响

表7的结果表明，菌肥CAMP组中的全氮含量比其他两组的高，说明施用菌肥CAMP后土壤中固定的氮释放量增加，土壤的矿化速度增加；并且施用菌肥CAMP组速效氮的利用率比其他两组高出15％。

4总结

该复合微生物菌肥不仅仅是高级的肥料，又是土壤的改良剂，一旦施入土壤中，微生物就利用土壤中的有机质、腐殖质等物质进行吸附、定殖，使这些物质转化为可被植物利用的小态的氨基酸和蛋白质等养分，不仅可以减少化肥的使用量，还能大大提高土壤已施化肥的利用率。

使用微生物菌肥可以达到以下效果：

(1)改良土壤的理化性质，提高土壤中有效菌的含量、提高土壤有机质的分解、提高土壤有效养分的释放，最终实现逐年减少化肥、农药的使用量。

(2)提高植物的代谢能力，促进植物的根系生长，使其发达，提高植株可溶性糖和叶绿素的含量，增强植物的抗逆性能，提高植物的光合作用。

(3)投入低，回报高，能够确保土壤的可持续发展。

(4)改善植物的品质，特别是叶菜类作物，植物的叶片嫩绿、无化学污染，且可以提高产量18％，全面提高叶菜类产品的市场竞争力。

(5)制备工艺简单，各复配菌在同一培养基上混合发酵培养即得，各菌株间无拮抗作用，无需使用多种培养基分别培养，简化了生产工艺，降低了生产成本。

Claims

1.一种根际促生型水溶性微生物菌肥，其特征在于，是由蜡样芽孢杆菌GF-1、嗜热链球菌BLST、胶冻样芽胞杆菌G3、枯草芽孢杆菌B7348、枯草芽孢杆菌N9-1-35、植物乳杆菌LP和产朊假丝酵母CUM，在通用培养基上经有氧混合发酵得到的培养物制成；微生物菌肥中生物活菌总数大于或等于2×10¹⁰CFU/g。

2.如权利要求1所述的一种根际促生型水溶性微生物菌肥，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌GF-1的保藏编号为CCTCC M 2011352，为解磷功能菌株；

所述嗜热链球菌BLST的保藏编号为CCTCC NO:M 2012282，为氨化功能菌株；

所述胶冻样芽胞杆菌G3的保藏编号为CICC 21699，为解硅酸盐功能菌株；

所述枯草芽孢杆菌B7348的保藏编号为CCTCC M 2010260，为光合功能菌株；

所述枯草芽孢杆菌N9-1-35的保藏编号为CCTCC M 2011301，为联合固氮性能菌株；

所述植物乳杆菌LP的保藏编号为CCTCC M 2010150，为根际促生菌，能产生3-吲哚乙酸和嗜铁素；

所述产朊假丝酵母CUM的保藏编号为CCTCC M 2010090，为根际促生菌，能产生3-吲哚乙酸、赤霉素和嗜铁素。

3.如权利要求1所述的一种根际促生型水溶性微生物菌肥，其特征在于，所述通用培养基的组成为：按质量百分数计，马铃薯粉10％、硫酸铵0.4％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、蛋白胨0.1％、酵母粉0.3％、硫酸亚铁0.003％。

4.一种根际促生型水溶性微生物菌肥的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)种子液的制备：

将蜡样芽孢杆菌GF-1、嗜热链球菌BLST、胶冻样芽胞杆菌G3、枯草芽孢杆菌B7348、枯草芽孢杆菌N9-1-35、植物乳杆菌LP和产朊假丝酵母CUM的斜面菌株，分别接入到灭菌后的通用培养基中，恒温摇床培养，分别制备得到上述7株菌的种子液；

(2)二级扩大培养液的制备：

(3)发酵培养：

5.如权利要求4所述的根际促生型水溶性微生物菌肥的制备方法，其特征在于，步骤(1)、(2)和(3)中，所述的通用培养基，其组成为：马铃薯粉10％、硫酸铵0.4％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、蛋白胨0.1％、酵母粉0.3％、硫酸亚铁0.003％，均为质量比。

6.如权利要求4所述的根际促生型水溶性微生物菌肥的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，通用培养基的灭菌方法为：121℃灭菌20分钟。

7.如权利要求4所述的根际促生型水溶性微生物菌肥的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，恒温摇床培养的条件为：30℃恒温摇床120转/分钟培养24h。

8.如权利要求4所述的根际促生型水溶性微生物菌肥的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，发酵培养的条件为：37℃，120转/分钟，恒温培养24小时。