CN102870816A - 活菌生物农药微胶囊剂的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及将活体微生物如假单胞杆菌、芽孢杆菌及类芽孢杆菌的菌体等为主要有效成分制备的微胶囊制剂，属于微生物和生物化学技术领域。活体微生物农药微胶囊制备的方法是通过吸附作用将微生物发酵培养液吸附制成囊心固化，然后加入壁材，制成微胶囊制剂。所获得的微胶囊制剂的活菌含量高，耐贮性和抗高温及紫外线能力强，对病虫害具有稳定良好的防治效果。
Description
技术领域
本发明属于生物农药和生物化学技术领域。
背景技术
微生物农药的致命缺点是在自然状况下对外界条件敏感，容易死亡，货架期短。现在很多微生物农药为了延长储存期，通过发酵优化，培养出芽孢、厚垣孢子等抗逆性强的生物体，然后制成可湿性粉剂、水分散粒剂等。这种方法在一定程度上增加了微生物农药自然条件下的抗性，但是货架期仍然不长。为了解决货架期的问题，现在的研究主要集中在微生物胶囊化，即将微生物作为囊心，通过化学法，物理化学法，物理机械法等包埋在囊壁内，制成微胶囊。
微胶囊技术的开发已历时60多年，在食品和医药行业得到广泛应用，利用微胶囊化技术，研制了很多微胶囊化产品。在农药行业，经过多年研究，也已经有少量的化学农药和肥料制成微胶囊剂的技术报告和专利申请，文献发表的《生物农药微胶囊制备研究》(云南大学学报，2005，27(1)：57～59)公开了生物农药微胶囊制备方法，该方法也仅是适用于非活体的生物化学成分的生物农药。因为发酵的微生物菌株是亲水性的，将亲水性的菌株直接包埋在囊壁内，由于含有水分，常温下长期存放时菌株仍然容易失活，因此，尚未见有关微胶囊化的微生物农药生产工艺技术报告。本发明相对于先前报道微胶囊技术的优势在于通过首先选用生物相容性优良的吸附载体通过物理途径吸附菌体制备成疏水性的囊芯，再通过壁材包埋制成的微胶囊解决了菌体长期存放，效果稳定的问题。
发明内容
选用的微生物菌株包括枯草芽孢杆菌，荧光假单孢菌，短小芽孢杆菌，苏云金杆菌，蜡样芽胞杆菌、多粘类芽孢杆菌，吸水链霉菌等放线菌，这些微生物菌株已经登记进入市场，均可以从市场买到。
将分离纯化的微生物菌株在50L发酵罐中培养2到3天，获得微生物发酵液，再通过离心或过滤获得高浓度的发酵浓缩液。
本发明的核心技术是将亲水性的微生物发酵培养液用吸附剂吸附形成疏水性的囊心，使载体和菌体结合成不溶于水的结合体，采用植物油作媒介，将载体和菌体均匀分散于油滴中，然后加入油水亲和乳化剂将可溶于水的壁材乳化形成水包油型乳化体系。
采用吸附剂吸附活菌制成囊芯再加工成的微胶囊，贮藏性能得到了提高，可以在常温下长时间贮藏。由于吸附剂在贮藏期间对菌体的保护作用，吸附剂吸附菌体包埋后，在贮藏过程中，菌体与外界相对隔绝，从而远离空气等环境对菌体的氧化分解作用，延长了贮藏时间。
本发明解决的技术问题是活菌生物农药的稳定性，使活菌生物农药可以长期贮藏，稳定发挥功效。
具体实施方案
本发明根据下述实例做进一步的描述，本领域技术人员知道，下述实施例对本发明仅仅起到说明的作用。在不背离本发明精神的前提下，对本发明所做的任意改进和替代均在本发明保护的范围内。
实施方案一
1、微生物菌种选用
选用枯草芽孢杆菌接种于50mL/250mL的SDAY种子培养基中，35℃，150r/min下培养18h左右(用紫外分光光度计测量OD600为6.0)，接种到优化后的50L发酵罐的发酵培养基中，在30℃培养48h得到发酵液液。
2、配制油水亲和乳化剂：
HLB值是衡量乳化剂亲油-亲水性大小的相对值，其值越大说明亲水性越强。每个乳化体系都需要适宜的亲油-亲水基比例(HLB值)。乳化剂的HLB值决定不同的乳化效果，油-水体系最终如何选择复合乳化剂的HLB值才能获得最佳的乳状液，这是乳化过程的关键。本发明取司盘80和吐温80按2∶8的比例配制成油水亲和乳化剂，其HLB值达到13，油-水体系乳化最佳，喷雾干燥获得了最高的菌含量。
3、吸附剂的选择
不同的吸附剂对对枯草芽孢杆菌的吸菌率实验结果如表1所示。
表1不同吸附剂对枯草芽孢杆菌的吸菌率比较
从表1中可以看出，将人工合成的大孔吸附树脂与麸皮按3∶2比例的混合吸附剂吸菌率达到了93.2％，是最佳的吸附剂。
4、壁材的选择
微胶囊所选用的壁材对微胶囊产品的质量具有决定性，因此选择适宜的壁材非常重要。理想的壁材必须具有较高的水溶性，优良的乳化性。本发明选用的壁材如表2。
表2壁材对粉剂微胶囊含菌量的影响
从结果中可以看出，壁材以壳聚糖，海藻糖和麦芽糊精更有助于粉剂菌含量的保持提高。
5、实施工艺方案
按每10L发酵液加100g大孔吸附树脂与麸皮按3∶2比例的混合吸附剂的比例加入到枯草芽孢杆菌发酵培养液中，搅动20min，然后静置10min。将混合液通过离心或过滤滤掉发酵液水分，置于37℃鼓风干燥机中干燥3小时。将吸附有菌体的吸附剂100克加入到500ml大豆油中，搅拌均匀，制备得菌、吸附剂和油三者混合液。将此混合液匀速加入到中速搅拌的500毫升含有20％的糊精壁材溶液中，然后按0.4％的比例加入配制好的油水亲和乳化剂溶液，从低到高调节转速至600rpm均质乳化10min，采用压力式喷雾干燥得到微胶囊粉剂。
6、效果评价：
由于目前没有商业化的芽孢杆菌微胶囊制剂，因此本发明对微胶囊产品进行较全方面的评价，为促进芽孢杆菌微胶囊制剂进入市场奠定基础，建立枯草芽孢杆菌微胶囊产品的测定方法和鉴定标准。
1)外观
枯草芽孢杆菌微胶囊制剂外观呈灰色粉状；颗粒细腻，均匀；干燥，无粘结；无异味；显微镜下呈近似圆球形，颗粒大小分布均匀。
2)微胶囊制剂的密度
微胶囊密度的测定结果如表3所示。
表3微胶囊制剂密度的测定
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 质量(g) | 11.75 | 25.88 | 37.23 | 49.22 |
| 体积(cm3) | 24.10 | 59.30 | 85.50 | 105.50 |
| 密度g/cm3 | 0.49 | 0.44 | 0.44 | 0.47 |
从表可以看出，微胶囊制剂的密度介于0.43g/cm3到0.49g/cm3之间。
3)微胶囊制剂粒径分布
光学显微镜和扫描电镜对微胶囊的颗粒观察，喷雾干燥形成的微胶囊颗粒较圆整，表面致密，有小的突起和凹陷的部分，无裂痕。微胶囊近似圆球形，因此流动性和分散性更好，产品使用时更容易形成稳定的体系。微胶囊粒径的大小是微胶囊质量的一个重要方面，它的大小一定程度上决定了它的溶解性。影响微胶囊粒径的因素众多，如壁材种类，壁材含量，喷嘴直径大小，喷嘴气流压力等。本发明所制备的枯草芽孢杆菌微胶囊制剂，粒径主要分布在40-100μm，平均粒径75μm，呈正态分布的态势。
4)微胶囊稳定性实验
将枯草芽孢杆菌微胶囊制剂与枯草芽孢杆菌可湿性粉剂制剂，置于烘箱中(54±1)℃下进行热贮实验，21天后测定其芽孢含量的变化。
表4微胶囊和可湿性粉剂热贮稳定性试验
从表中可以看出，枯草芽孢杆菌微胶囊制剂热贮21天后，存活率达到87％，而其可湿性粉剂热贮之后存活率仅为52％。
实施方案二
本方案首先采用载体吸附菌体作为微胶囊的囊心，然后通过乳化法得到海藻酸钠微胶囊。微胶囊制备工艺为：将海藻酸钠溶于水中，制备得到海藻酸钠溶液。将囊芯加入海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，然后在搅拌的条件下将海藻酸钠囊芯混合物加入到油中，搅拌分散后，加入氯化钙溶液，搅拌固化后，静止，过滤，洗涤，干燥。
1、菌种制备
选用荧光假单胞菌接种到优化后的50mL/250mL发酵培养基中，在37℃，150r/min的摇床上培养12h得到种子培养液。再通过50L发酵罐中培养，48小时，获得微生物发酵液。
2、囊芯制备
取发酵液10升，按照吸附载体和发酵液的比例为1∶10向发酵液中加入吸附载体白炭黑，搅匀，在37℃下干燥，得到微胶囊的囊芯。
3、裂解剂的配制
取碳酸氢钠与柠檬酸钠按1∶3比例混合制备。
4、实施工艺方案：
将囊芯按1∶5的比例加入到1.5％海藻酸钠水溶液中，然后以体积比为1∶3与大豆油混合，搅拌均匀，最后将3％的氯化钙溶液按照10％的体积比加入到油乳液中，充分混合，搅拌，静止，过滤，洗涤，干燥制成微胶囊颗粒制剂。
5、效果评价
1)微胶囊颗粒剂的密度：
表5微胶囊颗粒剂密度
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 质量(g) | 1.63 | 2.01 | 2.55 | 3.31 |
| 体积(cm3) | 5.20 | 7.10 | 8.80 | 10.15 |
| 密度g/cm3 | 0.31 | 0.28 | 0.29 | 0.33 |
从表可知，微胶囊制剂的密度为0.28g/cm3到0.33g/cm3，密度较小，产品溶于裂解液中后，可以吸水沉降在底部，从而与裂解液充分作用，裂解效果较好。如果防治叶部病害，建议先用裂解液裂解后再喷雾使用。
2)微胶囊颗粒剂的释菌速度
作为微生物活体农药，首选在数量上占有一定的优势，才能对其他有害微生物产生有效的抑制作用。本发明的微胶囊在裂解液中10min内就将包裹的菌体全部释放出来，具有快速释放的优点。
表6微胶囊颗粒剂的释菌速度
| 时间(分) | 5 | 8 | 10 | 12 |
| 含菌量(cfu/ml) | 1.4x108 | 1.8x108 | 1.2x109 | 1.4x109 |
3)微胶囊颗粒剂室温下的储存稳定性
表7微胶囊的室温稳定性
| 时间(月) | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 | 12 |
| 存活率(％) | 98.60 | 97.70 | 96.80 | 96.10 | 95.50 | 93.60 |
微胶囊在室温储存12个月后其存活率达到93.60％。充分发挥了微胶囊的保
护作用，延长了产品的货架期。假单胞菌用海藻酸钠为壁材包裹制成微胶囊，囊体可以防治外界不良环境(如高温，UV等)对菌体的伤害。现在微生物农药剂型主要是粉剂和可湿性粉剂，这些剂型施用到田间土壤中，活菌数量随着时间的延长，逐渐降低，从而失去对病原菌的生物防治作用。但是微胶囊施用到田间土壤，可以将菌体缓慢的释放到田间，维持菌体在一定的数量级较长时间，从而达到长期有效的防治土传病害。为了满足叶部病害需要活菌体大量释放的需求，采用将配制好的裂解剂按0.2摩尔的浓度加入到药液中，使微胶囊快速裂解，活菌体快速释放到田间，起到有效防治植物病害的作用。
实施方案三
1、选用枯草芽胞杆菌接种到优化后的50mL/250mL发酵培养基中，在35℃，150r/min的摇床上培养12h得到种子培养液。再通过50L发酵罐中培养，48小时，获得微生物发酵液。
2、采用实施案例二准备的吸附剂，油水亲和乳化剂，按每10L发酵液加300g吸附剂活性炭的比例加入到枯草芽胞杆菌发酵培养液中，搅拌20min，然后静置10min。将混合液通过过滤滤掉发酵液水分，将获得的活性炭，置于37℃鼓风干燥机中干燥5h。将吸附菌体的活性炭按500克加入到1L大豆油中的比例混合，搅拌均匀，制备得菌、吸附剂和油三者混合液。将此混合液匀速加入到中速搅拌的1升含有2％的壳聚糖壁材溶液中，然后按0.4％的比例加入配制好的油水亲和乳化剂溶液，从低到高调节转速至600rpm均质乳化10min，按0.2％的比例加入增稠剂羧甲基纤维素，中速搅拌30min，制成微胶囊悬浮剂。
实施方案四
取微胶囊悬浮剂和粉剂，以草莓丰香作供试品种。草莓苗种于大棚温室中，以受枯萎病原菌镰刀菌接种草莓幼苗按随机区组设计试验，接种后24小时按每棵苗100毫升药液灌根处理，每处理50株，重复4次。试验分为3个处理：处理1：微胶囊悬浮剂稀释500倍药液；处理2：微胶囊粉剂稀释500倍药液；处理3：清水对照；结果如表8，对照地块的幼苗被病菌侵染严重，微胶囊制剂显著减少了枯萎病的危害。
表8、微胶囊制剂防治草莓枯萎病的效果
| 处理 | 发病率％ |
| 微胶囊悬浮剂稀释500倍 | 15.50a1 |
| 微胶囊粉剂500倍 | 13.50a |
| 清水对照 | 53.50b |
注1：试验按随机取组设计，4次重复，每重复50株，表中各列数据跟随的不同字母表示处理间在5％水平上的显著差异。
Claims (8)
1.一种活菌生物农药微胶囊剂，其特征在于：所述微胶囊是将发酵生产的活体微生物菌剂以吸附材料吸附制成囊芯，在油浴中与壁材和油水亲和乳化剂互作，直接制成悬浮剂或经过干燥制成粉剂和颗粒剂的微胶囊活体生物农药。
2.根据权利要求1所述的微胶囊剂，其中所述的吸附剂，其特征在于：所述的吸附材料包括但不局限于活性炭，白炭黑，硅藻土，白炭黑，麦饭石，高岭土，麸皮，糠壳，淀粉，多孔淀粉，可溶性淀粉和大孔吸附剂等材料或这些材料的组合。
3.根据权利要求1所述的微胶囊剂，其中所述的油浴成分，其特征在于：所述的油浴成分包括但不局限于植物油如大豆油，菜籽油，蓖麻油，胚芽油，棕榈油和玉米油等及其衍生物或矿物油如白油及其衍生物。
4.根据权利要求1所述的微胶囊剂，其中所述油水亲和乳化剂，其特征在于：
所述的油水亲和乳化剂的HLB值为11-14，更为优选的HLB值为13。
5.根据权利要求1所述的微胶囊剂，其中所述的壁材，其特征在于：所述的壁材为生物相容性好的材料包括但不局限于β-环糊精，麦芽糊精，明胶，阿拉伯胶，糊精，淀粉，海藻酸钠，海藻酸钙等。
6.根据权利要求1所述的微胶囊剂，其中所述的粉剂微胶囊，其特征在于：产品组合为囊芯含量0.01-5％，壁材含量1-20％，油水亲和乳化剂0.1-10％，油浴含油量1-20％，经喷雾干燥制成粉剂，制剂菌含量达到109cfu/g以上，细腻，粒径主要分布在50-100微米，显微镜下呈近似圆球形，颗粒大小分布均匀。
7.根据权利要求1所述的微胶囊剂，其中所述的颗粒剂微胶囊，其特征在于：产品组合为囊芯含量0.1-10％，油水亲和乳化剂0.1-2％，壁材含量0.1-20％，油浴含油量1-50％，经干燥制成颗粒剂，制剂菌含量达到108cfu/g以上，细腻，粒径主要分布在100-500微米。
8.根据权利要求1所述的微胶囊剂，其中所述的悬浮剂微胶囊，其特征在于：产品组合为囊芯含量0.01-5％，壁材含量1-20％，油浴含油量0.1-5％，油水亲和乳化剂0.1-10％，增稠剂0.1-5％，制剂菌含量达到107cfu/ml以上，粒径主要分布在50-100微米。
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