CN112314629A - 一种苏云金杆菌悬浮剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种苏云金杆菌悬浮剂及其制备方法,一种苏云金杆菌悬浮剂包含以下重量份的组分：囊心6‑13份；油液4‑8份；壁材混合液10‑21份；乳化剂0.04‑0.08份；囊心通过将白炭黑加入苏云金杆菌发酵液中，使白炭黑对苏云金杆菌发酵液进行吸附后将水分过滤，然后在35‑39℃环境下干燥制备而成；苏云金杆菌发酵液与白炭黑的重量份之比为（105‑116）：1.5。本申请采用囊壁对囊心中的苏云金杆菌杀虫活性物质进行包覆，使得苏云金杆菌杀虫活性物质不易受到紫外线影响而失活，以实现延长苏云金杆菌悬浮液药效持续期，提高杀虫效果的目的。本申请还提出了一种苏云金杆菌悬浮液的制备方法，该制备方法具有工艺简单的优点。

Description

一种苏云金杆菌悬浮剂及其制备方法
技术领域
本申请属于微生物技术领域，更具体地说，它涉及一种苏云金杆菌悬浮剂及其制备方法。
背景技术
苏云金杆菌制剂是全世界应用范围最广的生物农药，其具有高效低毒的特性，在绿色食品的生产和人类生存环境的保护等方面做出了巨大的贡献。
相关技术中，提出了一种苏云金杆菌悬浮液，包括100份苏云金杆菌发酵液、6份磷酸酯，3份壬基酚聚氧乙烯醚、0.2份黄原胶，3份乙二醇，0.1g有机硅消泡剂，100份去离子水。
采用上述技术方案中的苏云金杆菌悬浮液时，由于苏云金杆菌悬浮液杀虫的主要成分是杀虫晶体蛋白，杀虫晶体蛋白很容易受紫外线的影响而失活，使得苏云金杆菌悬浮液药效持续期缩短，从而导致杀虫效果降低。
发明内容
为了实现延长苏云金杆菌悬浮液药效持续期，提高杀虫效果的目的，本申请提供了一种苏云金杆菌悬浮剂及其制备方法。
第一方面，本申请提出了一种苏云金杆菌悬浮剂,采用如下技术方案，
一种苏云金杆菌悬浮剂,包含以下重量份的原料制成：
囊心6-13份；
油液4-8份；
壁材混合液10-21份；
乳化剂0.04-0.08份；
所述囊心通过将白炭黑加入苏云金杆菌发酵液中，使白炭黑对苏云金杆菌发酵液进行吸附后将水分过滤，然后在35-39℃环境下干燥制备而成；所述苏云金杆菌发酵液与白炭黑的重量份之比为(105-116)：1.5。
通过采用上述技术方案，采用囊壁对囊心中的苏云金杆菌杀虫活性物质进行包覆，施药后苏云金杆菌杀虫活性物质被缓慢释放，从而使得苏云金杆菌杀虫活性物质不易受到紫外线影响而失活，以实现延长苏云金杆菌悬浮液药效持续期，提高杀虫效果的目的；油液可以选用氢化植物油，乳化剂可以选用苯乙基苯酚聚氧乙烯醚。
可选的，所述苏云金杆菌发酵液通过以下方法制备而成：
(1)种子的制备
吸取0.1mL苏云金杆菌，滴加到第一培养基上，用接种针涂布均匀，后放入温度为30.0±1.0℃的环境中培养72-98小时，即可得到生产用种子；
(2)菌种悬液制备
将制备好的生产用种子和150ml的无菌生理盐水加入到培养瓶中，制成悬浮液；将培养瓶置入75～80℃水浴中加热15～20分钟；
(3)发酵罐培养
①发酵罐培养基配置：制备液体培养基，灭菌，降温待接种；
②接种：将每培养瓶的菌种分别接种到1.4-1.8吨液体培养基上；
③放罐标准：培养至芽孢形成率≥85％；40％以上孢晶分离。
通过采用上述技术方案，采用上述方法制备的苏云金杆菌发酵液具有发酵效价高的优点。
可选的，所述第一培养基由如下重量占比的组分制备而成：
牛肉膏：1.0％；
蛋白胨：1.0％；
琼脂：2.0％；
氯化钠：0.2％；
其余为水。
通过采用上述技术方案，通过上述物质制备的培养基原料易得，适于大规模生产。
可选的，所述液体培养基由如下重量占比的组分制成：
淀粉：3.0％
豆饼粉：3.0％
酵母粉：0.2％
蛋白胨：1.0％
花生饼粉：2.5％
磷酸二氢钾：0.2％
硫酸镁：0.1％
轻质碳酸钙：0.3％
消泡剂：0.16％，其余为水。
通过采用上述技术方案，通过采用上述原料制备的液体培养基具有适用于大规模生产的优点。
可选的，所述的豆饼粉和花生饼粉的细度均在90目以上。
通过采用上述技术方案，将豆饼粉细度和花生饼粉细度均提高至90目以上，增大了豆饼粉、花生饼粉与芽孢的接触面积，从而提高了豆饼粉与花生饼粉的利用程度，加快了发酵液制备时得到反应速度。
可选的，所述壁材混合液通过以下步骤制成：将壁材加入水中，搅拌均匀制得，所述壁材的重量分数为20～30％。
通过采用上述技术方案，通过采用上述步骤制成壁材混合液，提高了壁材混合液的混合的均匀性；壁材可选用β-环糊精等。
可选的，所述悬浮剂还包括5-6重量份的丁醚脲。
通过采用上述技术方案，丁醚脲的加入可以吸收紫外线并变为具有杀虫活性的物质，从而与苏云金杆菌的杀虫活性物质协同，以进一步提高杀虫效果。
第二方面，本申请提供了一种苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，采用如下技术方案：
一种苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，S1：取囊心加入到油液中混匀制备成油相，然后将油相加入到壁材混合液中，以使壁材对囊心包覆形成囊壁，得到预制液；
S2：向预制液中加入乳化剂乳化得到成品。
通过采用上述技术方案，该制备方法具有工艺简单的优点，且通过采用该方法制备的苏云金杆菌悬浮剂具有稳定且杀虫持效期长的优点。
第三方面，本申请提供了一种苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，采用如下技术方案：
一种苏云金杆菌悬浮液的制备方法，包括如下步骤：S1、取囊心加入到油液中混匀制备成油相，然后将油相加入到壁材混合液中，以使壁材对囊心包覆形成囊壁，得到预制液；S2、向预制液中加入丁醚脲搅拌均匀，再加入乳化剂乳化得到成品。
通过采用上述技术方案，通过该方法使得囊壁形成后丁醚脲吸附至囊壁外侧，丁醚脲可以吸收紫外线，以减少囊壁上紫外线的透过率，从而进一步减少紫外线与苏云金杆菌杀虫活性物质的接触，以进一步提高苏云金杆菌杀虫活性物质的稳定性；另外丁醚脲的硫脲基在光作用下形成具有杀虫活性的二亚酰胺从而加速害虫的死亡，提高苏云金杆菌悬浮剂的杀虫效果。
综上，本申请的有益效果如下：
1、本申请通过采用囊壁对苏云金杆菌杀虫活性物质进行包裹，从而使得苏云金杆菌在施药后被缓慢释放，从而使得苏云金杆菌杀虫活性物质不易因紫外线而失活，从而实现延长苏云金杆菌悬浮液药效持续期，提高杀虫效果的目的。
2、本申请的方法具有工艺简单的优点，另外通过本申请的方法制备的悬浮剂具药效持效期长、杀虫效果好的优点。
具体实施方式
以下结合实施例和对比例对本申请作进一步的详细说明。
本申请中所用物质均为市售，其中苏云金杆菌购自北纳生物，产品编号为BNCC117952。
制备例1
一种苏云金杆菌发酵液，包括如下步骤：
(1)种子的制备
用无菌吸管吸取0.1mL苏云金杆菌，滴加到第一培养基上，用接种针涂布均匀，后放入生化培养箱培养，温度30.0±1.0℃，培养72小时，即可得到生产用种子，其中第一培养基为斜面培养基；
(2)菌种悬液制备
将制备好的生产用种子和150mL无菌生理盐水一起加入到茄子瓶中，用接种针将斜面培养基上的斜面种子刮入250mL茄子瓶中，制成悬浮液；将茄子瓶置入80℃水浴锅中加热20分钟；
(3)发酵罐培养
①培养基配置：制备液体培养基，灭菌，降温待接种；
②接种：将每茄子瓶的菌种接种到1.4吨液体培养基；
③罐内工艺控制：罐内温度：31.0℃；空气流量：200m3/h；搅拌转速20转/秒；培养过程罐压0.040MPa；
④放罐标准：培养至芽孢形成率≥85％；40％以上孢晶分离。
第一培养基的制备方法如下：称取牛肉膏10g、蛋白胨10g、琼脂20g，氯化钠2g,先取牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，加入100g水，加热搅拌均匀，再加入琼脂融化，用剩余水分补足至总量为1000g，混匀，然后分装，灭菌，倾斜冷却后得到。
液体培养基为：先取豆饼粉和花生饼粉，破碎机破碎至50目,称取淀粉3.0kg，豆饼粉3kg，酵母粉0.2kg，蛋白胨1kg，花生饼粉2.5kg,磷酸二氢钾0.2kg，硫酸镁0.1kg，轻质碳酸钙0.3kg，消泡剂0.16kg，加水补足至100kg，混匀即得。
制备例2-4
制备例2-4与制备例1的区别在于：各步骤的工艺参数不同，具体数据见表1。
表1
Figure BDA0002802247450000051
制备例5
本制备例与制备例4的区别在于：豆饼粉与花生饼粉均破碎至90目。
制备例6
本制备例与制备例4的区别在于：豆饼粉与花生饼粉均破碎至120目。
实施例
实施例1
一种苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，包括如下步骤，S1：取6g囊心加入到4g氢化植物油中混匀制备成油相，然后将油相加入到10g壁材混合液中，以使壁材对囊心包覆形成囊壁，得到预制液；
S2：加入0.08g苯乙基苯酚聚氧乙烯醚乳化得到成品。
其中，囊心通过将白炭黑加入制备例1制成的苏云金杆菌发酵液，使白炭黑对苏云金杆菌发酵液进行吸附后将水分过滤，然后在39℃环境下干燥制备而成；苏云金杆菌发酵液与白炭黑的重量份之比为105：1.5；
壁材混合液通过将β-环糊精加入水中，搅拌均匀制得，且壁材的质量分数为20％。
实施例2
一种苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，包括如下步骤，S1：取13g囊心加入到8g氢化植物油中混匀制备成油相，然后将油相加入到15g壁材混合液中，以使壁材对囊心包覆形成囊壁，得到预制液；
S2：加入0.06g苯乙基苯酚聚氧乙烯醚乳化得到成品。
其中，囊心通过将白炭黑加入制备例2制成的苏云金杆菌发酵液，使白炭黑对苏云金杆菌发酵液进行吸附后将水分过滤，然后在35℃环境下干燥制备而成；苏云金杆菌发酵液与白炭黑的重量份之比为110：1.5；
壁材混合液通过将β-环糊精加入水中，搅拌均匀制得，且壁材的质量分数为25％。
实施例3
一种苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，包括如下步骤，S1：取10g囊心加入到6g氢化植物油中混匀制备成油相，然后将油相加入到21g壁材混合液中，以使壁材对囊心包覆形成囊壁，得到预制液；
S2：加入0.04g苯乙基苯酚聚氧乙烯醚乳化得到成品。
其中，囊心通过将白炭黑加入制备例3制成的苏云金杆菌发酵液，使白炭黑对苏云金杆菌发酵液进行吸附后将水分过滤，然后在37℃环境下干燥制备而成；苏云金杆菌发酵液与白炭黑的重量份之比为116：1.5；
壁材混合液通过将β-环糊精加入水中，搅拌均匀制得，且壁材的质量分数为30％。
实施例4
一种苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，包括如下步骤，S1：取10g囊心加入到6g氢化植物油中混匀制备成油相，然后将油相加入到15g壁材混合液中，以使壁材对囊心包覆形成囊壁，得到预制液；
S2：加入0.06g苯乙基苯酚聚氧乙烯醚乳化得到成品。
其中，囊心通过将白炭黑加入制备例4制成的苏云金杆菌发酵液，使白炭黑对苏云金杆菌发酵液进行吸附后将水分过滤，然后在37℃环境下干燥制备而成；苏云金杆菌发酵液与白炭黑的重量份之比为110：1.5；
壁材混合液通过将β-环糊精加入水中，搅拌均匀制得，且壁材的质量分数为25％。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于：苏云金杆菌发酵液通过制备例5制得。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于：苏云金杆菌发酵液通过制备例6制得。
实施例7
一种苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，包括如下步骤，S1：取10g囊心加入到6g氢化植物油中混匀制备成油相，然后将油相加入到15g壁材混合液中，以使壁材对囊心包覆形成囊壁，得到预制液；
S2：向预制液中加入5g丁醚脲搅拌均匀，加入0.06g苯乙基苯酚聚氧乙烯醚乳化得到成品。
其中，囊心通过将白炭黑加入制备例6制成的苏云金杆菌发酵液，使白炭黑对苏云金杆菌发酵液进行吸附后将水分过滤，然后在37℃环境下干燥制备而成；苏云金杆菌发酵液与白炭黑的重量份之比为110：1.5；
壁材混合液通过将β-环糊精加入水中，搅拌均匀制得，且壁材的质量分数为25％。
实施例8
本实施例与实施例7的区别在于：S2中，丁醚脲5.5g。
实施例9
本实施例与实施例7的区别在于：S2中，丁醚脲6g。
对比例1
取制备例6制得的100g苏云金杆菌发酵液、磷酸酯6g，壬基酚聚氧乙烯醚3g、黄原胶0.2g，乙二醇3g，有机硅消泡剂0.1g，去离子水100g混合均匀后，经砂磨机砂磨后经剪切均质釜均质，得到苏云金杆菌悬浮剂。
对比例2
将5g丁醚脲加入36g水中混合搅拌均匀，加入0.06g苯乙基苯酚聚氧乙烯醚乳化得到成品。
性能试验检测：
悬浮剂药效持效期试验试验地点：室内；实验对象：玉米螟3龄幼虫；试验作物：玉米；施药次数：1次；药剂用量：175mL/亩，1mL药液用水量为0.5kg。
试验方式：将玉米在室内分12个区域培养并模拟光照环境，且每个区域的玉米株数和成长状况相同，实施例1-9和对比例1-2制得的悬浮剂根据上述配比分别对其中11个区域进行施药作为试验组，对剩余的第12个区域喷洒同量的清水作为对照组。在施药前在每一区域放入100只玉米螟作为第一批，在放入第一批玉米螟的第三天记录每一区域的玉米螟存活量，根据公式一计算活虫率(n)，并将存活的玉米螟移除；施药7天后，重新在每一区域放入100只玉米螟，作为第二批，在放入第二批玉米螟后的第三天记录每一区域的玉米螟存活量，根据公式一计算活虫率(n)，并将存活的玉米螟移除；施药17天后，重新在每一区域放入100只玉米螟，作为第三批，在放入第三批玉米螟后的第三天记录每一区域的玉米螟活虫量，根据公式一计算活虫率(n)，具体数据见表2。
公式一：活虫率(％)＝(试验组活虫量/对照组活虫量)*100/100
表2
Figure BDA0002802247450000081
结合实施例4、5、6以及表2对比可知，从实施例4-6，豆饼粉与花生饼粉的粒径逐渐减小，使得活虫数逐渐减小，其原因可能在于，当豆饼粉与花生饼粉粒径逐渐减小时，苏云金杆菌发酵时芽孢与豆饼粉、花生饼粉的接触面积增大，从而提高了二者的利用率，使得发酵液的发酵效价有效提高，使得悬浮剂中苏云金杆菌的杀虫有效成分浓度升高，从而使得实施例4、实施例5、实施例6的杀虫效果依次增大，即活虫率依次减小。
结合实施例6、实施例7、对比例2以及表2可知，实施例7的悬浮剂加入了丁醚脲之后，药效持效期以及杀虫效果均比实施例6、对比例2好，其原因可能在于：丁醚脲中含有硫脲基，因此当丁醚脲吸附在囊壁外侧，丁醚脲硫脲基吸收紫外线，从而进一步减少紫外线对苏云金杆菌有效成分的影响；另外硫脲基吸收紫外线变成具有杀虫活性的二亚酰胺，从而提高了悬浮剂的杀虫效果，进一步使得实施例7较实施例6的活虫率、对比例2的活虫率低。
结合实施例6、对比例1以及表2可知，随着时间延长，实施例6与对比例1相比杀虫效果降低的少，其原因可能在于：实施例6中采用囊壁对苏云金杆菌杀虫活性物质进行包覆，施药后苏云金杆菌杀虫活性物质被缓慢释放，从而使得苏云金杆菌杀虫活性物质不易受到紫外线影响而失活，因此导致实施例6较对比例1更长的药效持效期。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种苏云金杆菌悬浮剂,其特征在于，包含以下重量份的组分：
囊心6-13份；
油液4-8份；
壁材混合液10-21份；
乳化剂0.04-0.08份；
所述囊心通过将白炭黑加入苏云金杆菌发酵液中，使白炭黑对苏云金杆菌发酵液进行吸附后将水分过滤，然后在35-39℃环境下干燥制备而成；所述苏云金杆菌发酵液与白炭黑的重量份之比为（105-116）：1.5。
2.根据权利要求1所述的一种苏云金杆菌悬浮剂，其特征在于，所述苏云金杆菌发酵液通过以下方法制备而成：
（1）种子的制备
吸取0.1mL苏云金杆菌，滴加到第一培养基上，用接种针涂布均匀，后放入温度为30.0±1.0℃的环境中培养72-98小时，即可得到生产用种子；
（2）菌种悬液制备
将制备好的生产用种子和150ml的无菌生理盐水加入到培养瓶中，制成悬浮液；将培养瓶置入75~80℃水浴中加热15~20分钟；
（3）发酵罐培养
①发酵罐培养基配置：制备液体培养基，灭菌，降温待接种；
②接种：将每培养瓶的菌种分别接种到1.4-1.8吨液体培养基上；
③放罐标准：培养至芽孢形成率≥85%；40%以上孢晶分离。
3.根据权利要求2所述的一种苏云金杆菌悬浮剂，其特征在于，所述第一培养基由如下重量占比的组分制备而成：
牛肉膏：1.0%；
蛋白胨：1.0%；
琼脂：2.0%；
氯化钠：0.2%；
其余为水。
4.根据权利要求2所述的一种苏云金杆菌悬浮剂，其特征在于，所述液体培养基由如下重量占比的组分制成：
淀粉：3.0%
豆饼粉：3.0%
酵母粉：0.2%
蛋白胨：1.0%
花生饼粉：2.5%
磷酸二氢钾：0.2%
硫酸镁：0.1%
轻质碳酸钙：0.3%
消泡剂：0.16%，其余为水。
5.根据权利要求4所述的一种苏云金杆菌悬浮剂，其特征在于，所述的豆饼粉和花生饼粉的细度均在90目以上。
6.根据权利要求5所述的一种苏云金杆菌悬浮剂，其特征在于，所述壁材混合液通过以下步骤制成：将壁材加入水中，搅拌均匀制得，所述壁材的重量分数为20~30%。
7.根据权利要求6所述的一种苏云金杆菌悬浮剂，其特征在于，所述悬浮剂还包括5-6重量份的丁醚脲。
8.一种权利要求1-6任一项所述的苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：取囊心加入到油液中混匀制备成油相，然后将油相加入到壁材混合液中，以使壁材对囊心包覆形成囊壁，得到预制液；
S2：向预制液中加入乳化剂乳化得到成品。
9.一种权利要求7所述的苏云金杆菌悬浮剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取囊心加入到油液中混匀制备成油相，然后将油相加入到壁材混合液中，以使壁材对囊心包覆形成囊壁，得到预制液；
S2、向预制液中加入丁醚脲搅拌均匀，再加入乳化剂乳化得到成品。
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