CN102648714A - 液体发酵制备生物农药的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液体发酵制备生物农药的方法，所用液体发酵培养液包括蚕豆粉、混合果蔬汁、葡萄糖和酵母提取物。采用本发明方法和培养液制备的产品为活性厚垣孢子粉，货架期长；而且本发明可以实现多菌种同时液体发酵，因此产品应用范围更为广泛。

Description

液体发酵制备生物农药的方法

技术领域

本发明涉及一种制备生物农药的方法，尤其涉及一种液体发酵制备木霉菌生物农药的方法。

背景技术

二十世纪八十年代以来，我国蔬菜种植业迅猛发展，种植面积由1980年的316万公顷增长到2008年的1787万公顷。蔬菜多为连年种植，从而导致某些病害的病原菌大量积累，加上大棚种植的推广，给蔬菜病害的发生、发展提供了适宜的条件。一些土传性病害，如黄瓜枯萎病、茄子黄萎病和青椒疫病等，会导致作物减产30%、甚至绝产。

长期以来，在蔬菜病害防治方面，化学农药由于其见效快，杀菌谱等特点，在病害防治中占据了主要位置。但是长期大量使用化学农药会导致土壤中有益微生物群落减少，破坏生物群落结构，造成环境污染，并导致病原菌产生耐药性和抗药性，从而化学农药用量逐年增加，带来更加严重的环境问题，以至于许多化学农药被禁用或即将被禁用。

利用生物防治的方法防治蔬菜病害不仅避免了化学农药带来的一系列问题，而且安全、有效和持久，不容易使病原菌产生抗药性，对人畜安全无毒，不污染环境，无残留。随着人们对生态环境和自身健康的日益关注，生物农药将逐步取代传统的化学农药，成为防治蔬菜病害的主要产品。如专利KR20090035368A公开的预防大白菜根肿病的芽孢杆菌组合物，专利KR100896041B1公开的预防番茄和马铃薯枯萎病的葡萄球菌组合物，专利KR100890013B1公开的能够杀灭南瓜疫病菌的枯草芽孢杆菌组合物，专利HU225133B1公开的Erwinia anylovora ATCC15580菌株用于预防植物病原菌和昆虫的危害。

木霉菌（Trichoderma spp.）是一种分布广泛的土壤习居菌，具有对植物病原菌真菌的拮抗作用，可利用各种简单或复杂的碳源和氮源，甚至具有转化和降解一些有害或持久存在的污染物的能力。木霉菌能够够产生多种拮抗作用，如竞争作用、重寄生作用、产生抗生物质和溶菌酶类、促进植物生长等，是一种广谱性生防菌，尤其适用于防治土传疾病，如专利CN101861879A公开的木霉菌分生孢子可湿性粉剂，另外国外已有商品化的木霉菌制剂，如美国TopShield（主要成分哈茨木霉T22），以色列Trichodex（主要成分为哈茨木霉T39）。目前国内木霉菌生产工艺主要以固体发酵为主，专利CN101024816B公开的木霉菌分生孢子粉尘剂的制备方法，采用麦麸、秸秆粉或玉米渣、稻壳等制成培养基；专利CN101485336A公开的防治作物土传病害的木霉菌制剂，采用谷壳、玉米粉和麦麸制成培养基；专利CN101565688A公开的木霉孢子菌剂，采用农副产品和磷肥等组成培养基；专利CN101195807A公开的木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法，也是采用固体发酵的方式；王英姿等在《绿色木霉菌固体发酵培养基优化组合正交筛选》（植物保护，2007年第33卷第2期，61~63页）一文中利用廉价农副产品为原料进行固体发酵，并进行正交试验筛选出最佳组合配方。但是固体发酵工艺繁琐，工作量大，不利于工业上大规模生产。

虽然目前也有关于单菌液体深层发酵的报道，但主要以生产分生孢子为主，如专利CN101671625A公开的液体深层发酵方法和装置。但是分生孢子保存期较短，导致产品货架期短；同时由于受到培养液等条件限制，使得通常的发酵罐液体深层培养发酵条件下，不具备产孢条件。

发明内容

本发明提供了一种液体发酵制备生物农药的方法，可以实现多个菌种或菌株同时发酵，生产厚垣孢子的活性孢子粉，相对于固体发酵，本发明工艺简单、设备投资小；相对于液体发酵的现有技术生产的分生孢子，本发明产品货架期长；而且多个菌种或菌株同时发酵制备的产品，应用范围更广。

本发明液体发酵制备生物农药的方法，步骤包括：

步骤1，菌种接种于培养基（如PDA固体培养基）中，恒温培养；

步骤2，将培养后的菌种转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液；

步骤3，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子；

步骤4，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。

本发明还提供了一种多菌种同时发酵制备生物农药的方法，步骤如下：

步骤1，测定各种菌种的生长速度和相容性，并选择相容性好和生长速度相同或相近的菌种；

步骤2，各种菌种分别接种于培养基（如PDA固体培养基）中，恒温培养；

步骤3，将选择的菌种分别转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液；

步骤4，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中混合均匀，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子；

步骤5，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。

其中，本发明所述“多菌种”指的是不同的多个菌种或同一菌种的多个不同菌株，所述“相容性好”和“生长速度相同或相近”的含义对本领域技术人员来讲是明确的。

本发明步骤1中所述“培养基”和步骤2、3中所述“培养液”，在没有特别说明的情况下，本领域技术人员可根据不同菌种采用现有技术进行选择和配制。优选地，本发明所述培养液组分包括蚕豆粉、葡萄糖、酵母提取物、混合果蔬汁；具体地，所述培养液优选为：

蚕豆粉       2wt%；

葡萄糖       0.2wt%；

酵母提取物   0.4wt%；

混合物果蔬汁 3wt%；

pH值        7.5。

其中，所述混合果蔬汁为市场采购水果和蔬菜采用现有技术在不加水的条件下进行榨汁得到。

根据本发明所述方法的一种优选实施方式，采用拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌作为菌种进行发酵制备生物农药，步骤如下：

步骤1，拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌分别接种于土豆汁培养基，所述土豆汁培养基组分包括：

土豆汁       20wt%；

葡萄糖       0.2wt%；

琼脂         1.8wt%。

25~30℃条件下恒温培养3~5天，观察三个菌种的相容性和生长速度，三个菌种相容性和生长速度符合生产要求，进行下一步骤；

步骤2，拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌按照步骤1所述方法进行培养；

步骤3，将三个菌种分别转移至装有本发明上述培养液的摇瓶中，25~30℃和180~185rpm转速条件下培养，获得分生孢子液；

步骤4，发酵罐中投入本发明上述培养液，高温高压灭菌；发酵罐保持正压降温至25~30℃，倒入步骤3获得的三个菌种的分生孢子液进行混合；25~30℃、0.4~0.5kg压力、1800~3500L/h空气流量和180~185rpm转速条件下发酵获得厚垣孢子；

步骤4，厚垣孢子粉与硅藻土混合均匀，过滤分离得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述硅藻土厚垣孢子混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。

步骤1中测定各种菌种的生长速度和相容性的方法优选为：哈茨木霉，绿色木霉菌和拟康氏木霉菌采用点接法均匀的接种到土豆汁培养基培养皿的四周，在25-28℃条件下培养3-5天以后观察三个不同菌种的相容性。

步骤2中所述培养方法具体优选为：将拟康氏木霉，哈茨木霉和绿色木霉在无菌条件下分别接种在所述土豆汁培养基茄形培养瓶内，塞上无菌棉花塞，然后将茄形培养瓶放入恒温培养箱中，在25-28℃条件下培养3-5天。

步骤3所述摇瓶培养方法优选为：将拟康氏木霉，哈茨木霉和绿色木霉在无菌条件下分别转移至装有300ml所述培养液的1L摇瓶中，将所述摇瓶放在摇床上，26~28℃、180rpm转速条件下培养3天。

根据本发明所述方法的一种更优选实施方式，步骤如下：

步骤1，测定各种菌种的生长速度和相容性，具体操作可参照上述方法；

步骤2，按照上述培养方法培养菌种；

步骤3，按照上述摇瓶培养方法进行摇瓶培养，得到分生孢子液（即一级种子）；

步骤4，配制所述培养液，并投入中级发酵罐中，高温高压灭菌；发酵罐保持正压，冷却至25~30℃，倒入步骤3得到的三个菌种的分生孢子液进行混合，25~30℃、0.4~0.5kg压力、1800~2100L/h空气流量和180~185rpm转速条件下发酵，得到二级种子；

步骤5，配制所述培养液，并投入大体积发酵罐中，高温高压灭菌，发酵罐保持正压，冷却至25~30℃，将步骤4中得到的二级种子转移至所述大体积发酵罐，25~30℃、0.4~0.5kg压力、36~42m³/h 空气流量和180~185rpm转速条件下发酵，获得厚垣孢子；

步骤6，厚垣孢子粉与硅藻土混合均匀，过滤分离得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述硅藻土厚垣孢子混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。

其中，上述中级发酵罐指的是大于1L而小于1吨规格的发酵罐，大体积发酵罐指的是大于等于1吨规格的发酵罐，所述规格为本技术领域公知常识。

步骤4中所述中级发酵罐发酵方法优选为：65L所述培养液投入100L规格的发酵罐中，高温高压灭菌；发酵罐保持正压，冷却至28℃，倒入步骤3得到的三个菌种的分生孢子液进行混合，28±0.5℃、0.4~0.5kg压力、1800~2100L/h空气流量和185rpm转速条件下发酵，得到二级种子。

步骤5中所述大体积发酵罐发酵方法优选为：1200L所述培养液投入2吨规格的发酵罐中，高温高压灭菌；发酵罐保持正压，冷却至28℃，将步骤4中得到的二级种子转移至所述大体积发酵罐，28±0.5℃、0.4~0.5kg压力、36~42m³/h 空气流量和185rpm转速条件下发酵，获得厚垣孢子。

上述方法中所述高温高压灭菌优选为121℃温度、15磅压力下灭菌25分钟。

上述方法中，优选地，所述高温高压灭菌前，向所述发酵罐内投入消泡剂，所述100L规格发酵罐中消泡剂加入体积优选为100ml，所述2吨规格发酵罐中消泡剂加入体积优选为1000ml。

上述方法中所述硅藻土颗粒大小优选为700目，所述硅藻土与所述厚垣孢子体积比优选为1:1。

上述方法中所述过滤优选为采用板框压滤机过滤分离。

上述方法中所述硅藻土厚垣孢子混合物干燥温度优选为35℃。

本发明提供了一种液体发酵制备生物农药的方法，工艺简单、设备投资小；本发明还提供了一种多菌种同时液体发酵制备生物农药的方法，产品应用范围更为广泛。

本发明还提供了一种上述液体发酵制备生物农药的方法制备的生物农药，所述生物农药生物活性成分为厚垣孢子，如拟康氏木霉厚垣孢子、哈茨木霉厚垣孢子和绿色木霉厚垣孢子中的一种或任意几种的混合物。

同时本发明提供了一种新的液体发酵培养液，采用常见的蚕豆、水果和蔬菜为原料，成本低，制备简单，而且解决了传统液体深层发酵无法形成孢子的难题。

本发明上述制备生物农药的方法，产品为活性厚垣孢子粉，抵御外界不良环境能力强，寿命长，因此可长时间储存，货架期长。

具体实施方式

首先，本发明提供了一种液体发酵制备生物农药的方法，步骤如下

步骤1，菌种接种于培养基中，恒温培养；

步骤2，将培养后的菌种转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液；

步骤3，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子；

步骤4，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。

其次，本发明还提供了一种多菌种同时液体发酵制备生物农药的方法，步骤如下：

步骤1，测定各种菌种的生长速度和相容性，并选择相容性好和生长速度相同或相近的菌种；

步骤2，各种菌种分别接种于培养基中，恒温培养；

步骤2，将选择的菌种分别转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液；

步骤3，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中混合均匀，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子；

步骤4，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。

优选地，上述方法中所述培养液组分包括蚕豆粉、葡萄糖、酵母提取物、混合物果蔬汁。

下面通过具体实施例对本发明上述方法进行详细介绍和描述，以使更好的理解本发明，但是下述具体实施例并不限制本发明范围。

实施例1

哈茨木霉菌无菌条件下接种于装有土豆汁培养基的茄形培养瓶内，塞上无菌棉花塞，然后将茄形培养瓶放入恒温培养箱中，在25~28℃条件下培养3-5天。土豆汁培养基主要组分如下：

培养后的哈茨木霉菌在无菌操作条件下转移到装有300ml真菌培养液的1L摇瓶中，将摇瓶放在摇床上，26~28℃、180rpm转速条件下培养3天，培养结束后获得分生孢子液。所述培养液主要组分如下：

配制相同培养液，将培养液投入发酵罐中，并加入消泡剂，然后进行高温（121℃）高压（15磅）灭菌，灭菌时间25分钟。发酵罐保持正压，待冷却到28℃时降低空气流量，在火焰口倒入得到的分生孢子液。在28±0.5℃，罐压0.4~0.5kg，空气流量1800~2100L/h，转速185rpm的条件下发酵得到厚垣孢子发酵液。

浓缩工艺：培养完成的厚垣孢子发酵液中按体积比1:1加入700目硅藻土，搅拌均匀，通过板框压滤机分离得到硅藻土厚垣孢子混匀物，混匀物经过35℃干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。

实施例2

参照实施例1所述方法，获得分生孢子液（即一级种子）。

配制相同培养液，将65L的培养液投入100L的发酵罐中，并加入100ml的消泡剂，然后进行高温（121℃）高压（15磅）灭菌，灭菌时间25分钟。发酵罐保持正压，待冷却到28℃时降低空气流量，在火焰口倒入得到的分生孢子液。在28±0.5℃，罐压0.4~0.5kg，空气流量1800~2100L/h，转速185rpm的条件下发酵3天得到二级种子。

配制相同的培养液，将1200L的培养液投入2吨的发酵罐中，并加入1000ml的消泡剂，然后进行在位高温（121℃）高压（15磅）灭菌，灭菌时间25分钟。发酵罐保持正压，待冷却到28℃时降低空气流量，无菌条件下保持2吨发酵罐中压力为0.2kg，将100L发酵罐中的二级种子通过移种管接种到2吨发酵罐中，在28±0.5℃，罐压0.4~0.5kg，空气流量36~42m³/h，转速185rpm的条件下发酵3天，培养结束。

参照实施例1所述的方法进行浓缩，得到活性厚垣孢子粉。

实施例3

参照实施例1所述方法，将拟康氏木霉菌（CGMCC3.3002）、哈茨木霉菌（CGMCC No.1780）和绿色木霉菌的纯菌种在无菌条件下分别接种在土豆汁培养基茄形培养瓶内，塞上无菌棉花塞，然后将茄形培养瓶放入恒温培养箱中，在25~28℃条件下培养3~5天。

同时，将哈茨木霉菌、绿色木霉菌和拟康氏木霉菌种采用点接法均匀的接种到土豆汁培养基培养皿的四周，在25~28℃条件下培养3~5天以后观察三个不同菌种的相容性。经检测，三个菌种相容性和生长速度接近程度能够满足生产需要。所述土豆汁培养基主要组分如下：

所述将茄形培养瓶制备的三个不同木霉菌种在无菌操作条件下转移到装有300ml真菌培养液的1L摇瓶中。将摇瓶放摇床上，在26~28℃，转速180rpm条件下培养3天，可获分生孢子液。培养结束后，孢子数可达2×10⁸~5×10⁸个/ml。所述培养液主要组分如下：

配制相同培养液，将培养液投入发酵罐中，并加入消泡剂，然后进行高温（121℃）高压（15磅）灭菌，灭菌时间25分钟。发酵罐保持正压，待冷却到28℃时降低空气流量，在火焰口倒入得到的三个菌种的分生孢子液进行混合。在28±0.5℃，罐压0.4~0.5kg，空气流量1800~2100L/h，转速185rpm的条件下发酵得到厚垣孢子发酵液。

培养完成的厚垣孢子发酵液中按体积比1:1加入700目硅藻土，搅拌均匀，通过板框压滤机分离得到硅藻土厚垣孢子混匀物，混匀物经过35℃干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。

实施例4

参照实施例3所述的方法分别制备哈茨木霉菌、绿色木霉菌和拟康氏木霉菌分生孢子液（即一级种子），培养结束后，孢子数可达3×10⁸~5×10⁸个/ml。

配制相同培养液，将65L的培养液投入100L的发酵罐中，并加入100ml的消泡剂，然后进行高温（121℃）高压（15磅）灭菌，灭菌时间25分钟。发酵罐保持正压，待冷却到28℃时降低空气流量，在火焰口倒入得到三个菌种的分生孢子液进行混合。在28±0.5℃，罐压0.4~0.5kg，空气流量1800~2100L/h，转速185rpm的条件下发酵3天得到二级种子。培养结束后，孢子数可达2×10⁸~5×10⁸个/ml。

配制相同的培养液，将1200L的培养液投入2吨的发酵罐中，并加入1000ml的消泡剂，然后进行在位高温（121℃）高压（15磅）灭菌，灭菌时间25分钟。发酵罐保持正压，待冷却到28℃时降低空气流量，无菌条件下保持2吨发酵罐中压力为0.2kg，将100L发酵罐中的二级种子通过移种管接种到2吨发酵罐中，在28±0.5℃，罐压0.4~0.5kg，空气流量36~42m³/h，转速185rpm的条件下发酵3天。培养结束后，孢子数可达3×10⁸~6×10⁸个/ml。

参照实施例3所述的方法进行浓缩，得到活性厚垣孢子粉。

上述方法中使用的培养液主要组分如下：

在无特殊说明的情况下，本发明计量单位wt%均指的是质量百分含量。

采用本发明所述培养液进行液体发酵，解决了传统液体发酵技术中难以生成孢子的难题；而且本发明上述方法制备的产品均为活性厚垣孢子粉，厚垣孢子寿命长，抵御外界不良影响能力强，因此，本发明制备的产品质量稳定，储存时间长，货架期长。

本发明所述哈茨木霉菌、绿色木霉菌和拟康氏木霉菌均购自中国农业微生物保藏管理中心。

应当注意的是，本发明液体发酵制备生物农药的方法，所用菌种可根据需要进行选择其它常用菌种，并不局限于上述拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌；所述培养液组分质量百分含量也可以根据需要进行选择，而并不局限于上述含量。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种液体发酵制备生物农药的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，菌种接种于培养基中，恒温培养；

步骤2，将培养后的菌种转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液；

步骤3，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子；

步骤4，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉；

其中，步骤2和3中所述培养液pH值为7.5，且组分包括：

蚕豆粉       2wt%；

葡萄糖       0.2wt%；

酵母提取物   0.4wt%；

混合物果蔬汁 3wt%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种为拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌或绿色木霉菌。

3.一种多菌种同时发酵制备生物农药的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，测定各种菌种的生长速度和相容性，并选择相容性好和生长速度相同或相近的菌种；

步骤2，各种菌种分别接种于培养基中，恒温培养；

步骤3，将选择的菌种分别转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液；

步骤4，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中混合均匀，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子；

步骤5，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉；

其中，步骤3~4中所述培养液pH值为7.5，且组分包括：

蚕豆粉       2wt%；

葡萄糖       0.2wt%；

酵母提取物   0.4wt%；

混合物果蔬汁 3wt%。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌种为拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌的任意混合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌分别接种于土豆汁培养基，所述土豆汁培养基组分包括：

土豆汁       20wt%；

葡萄糖       0.2wt%；

琼脂         1.8wt%。

6.25~30℃条件下恒温培养3~5天，观察三个菌种的相容性和生长速度，进行下一步骤；

步骤2，拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌按照步骤1所述方法进行培养；

步骤3，将三个菌种分别转移至装有所述培养液的摇瓶中，25~30℃和180~ 185rpm转速条件下培养，获得分生孢子液；

步骤4，发酵罐中投入所述培养液，高温高压灭菌；发酵罐保持正压降温至25~30℃，倒入步骤3获得的三个菌种的分生孢子液进行混合；25~30℃、0.4~0.5kg压力、36~42m³/h空气流量和180~185rpm转速条件下发酵获得厚垣孢子；

步骤4，厚垣孢子粉与硅藻土混合均匀，过滤分离得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述硅藻土厚垣孢子混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉；

根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌分别接种于所述土豆汁培养基， 25~30℃条件下恒温培养3~5天，观察三个菌种的相容性和生长速度，进行下一步骤；

步骤2，拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌按照步骤1所述方法进行培养；

步骤3，将三个菌种分别转移至装有所述培养液的摇瓶中，25~30℃和180~ 185rpm转速条件下培养，获得分生孢子液；

步骤4，所述培养液投入中级发酵罐中，高温高压灭菌；发酵罐保持正压，冷却至25~30℃，倒入步骤3得到的三个菌种的分生孢子液进行混合，25~30℃、0.4~0.5kg压力、1800~2100L/h空气流量和180~185rpm转速条件下发酵，得到二级种子；

步骤5，所述培养液投入大体积发酵罐中，高温高压灭菌，发酵罐保持正压，冷却至25~30℃，将步骤4中得到的二级种子转移至所述大体积发酵罐，25~30℃、0.4~0.5kg压力、36~42m³/h空气流量和180~185rpm转速条件下发酵，获得厚垣孢子；

步骤6，厚垣孢子粉与硅藻土混合均匀，过滤分离得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述硅藻土厚垣孢子混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述硅藻土与所述厚垣孢子混合物体积比为1:1。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述硅藻土厚垣孢子混合物干燥温度为35℃。

9.一种如权利要求1或3所述方法制备的生物农药，其特征在于，所述生物农药活性成分为厚垣孢子。