CN102827773B - 一种复合菌剂、生物有机肥及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有效防治土传病害的复合菌剂、生物有机肥及其制备方法和应用，所述复合菌剂能非常显著地拮抗灰霉病病原菌生长，所述生物有机肥对瓜果蔬菜灰霉病具有药肥两用的双效作用，同时实现了对有机废弃物的资源化处理。
Description
技术领域
本发明涉及生物有机肥技术领域，特别涉及一种防治土传病害的复合菌剂、生物有机肥及其制备方法和应用。
背景技术
土传病害是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。侵染病原包括真菌、细菌、放线菌、线虫等。其中真菌为主，分为非专性寄生与专性寄生两类。非专性寄生是外生的根侵染真菌，如腐霉菌（Pythium spp.）引起苗腐和猝倒病、丝核菌引起苗立枯病。专性寄生是植物微管束病原真菌，典型的象尖孢镰（Fusarium oxysporum）、黄萎轮枝孢（Verticilliumalboatum）等引起的萎蔫、枯死。根病的严重程度受根端分泌物成分和浓度的左右。因此，抑制根围系统病原物的活动就成为保护根系并进行土传病害防治的基础。
大量使用化学药剂来防治土传病害会造成环境污染，药物残留对人体身体健康有害。同时，化学农药的长期使用，病原菌易对其产生抗药性，因而导致防治效果下降甚至防治失败。鉴于此，土传病害的生态防治逐渐成为人们的研究方向。生态防治是近年来提出的一种新的植物病害防治理念，通过向土壤引入拮抗微生物、培肥土壤和提高土壤中生物多样性等措施，进而使土壤微生态达到平衡，最终通过土壤中不同生物之间的拮抗与竞争实现对土壤病害的防治。由于土壤有益生物的一般抗性不可能对所有病原菌有效，因此需要专门接种那些对己知病病害有抑制作用的微生物。但是，尽管人们己知很多微生物对土传病害有抑制作用，但由于微生物种类繁多和遗传多变性等原因，要筛选高效的菌株仍需要大量研究工作。同时，大量研究表明，如果将一种单一的有益微生物直接引入土壤一般很少能达到长期抑制病害的目的。因为，这种新接入的微生物将无法与己存在的微生物进行竞争或因土壤中食物来源不足而从土壤中消失。同样，这些菌也不易直接接入栽培基质或有机肥料中，因为这些菌的接种成功与否与栽培基质或有机肥中有机物的分解水平直接相关，新鲜的有机物质因含有高浓度的营养物质成分如葡萄糖、氨基酸等能抑制这些菌产生其寄生所需的一些酶而不能支持其生物防治功能。因此，要成功接种这些微生物就必须使有机肥稳定至足以使生物防治功能菌大量繁殖并可能为成为优势菌群的水平。但是过度腐殖化的有机肥又因缺乏活性有机物质也不能支持大量微生物的繁殖与生存。因此，只有处于这两个极端的有机物质分解水平才可以支持生物防治功能。
近年来，尽管生产优质有机肥方面的技术日益成熟，但要将筛选出的高效有益微生物引入有机肥生产过程中，并生产具有特种病害防治功能的有机肥生产技术方面尚很困难。首先，不同微生物生活所需的适宜条件很不相同，因此有机肥的生产工艺需要依不同的有益微生物进行调整。其次，在优质堆肥生产过程中何时接入有益微生物需要进一步研究。如果将接入过早，在堆肥过程中产生的高温将会杀死接入的微生物。如果接种过晚，则会因堆肥内其它微生物的大量存在和盐分浓度高等原因使接入的菌无法大量繁殖。如果让有机肥生产不经过高温阶段，又会因堆肥原料本身无害化程度低和腐熟度不高等影响堆肥的品质。
发明内容
鉴于现有技术存在问题，本发明的目的在于通过对大量试验筛和研究，提供一种有效防治土传病害的复合菌剂、生物有机肥及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是这样实现的：
一种复合菌剂，包含以下菌体：热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCCNo.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093。
所述复合菌剂中菌体由菌落形成单位数目比为（1-10）：（0.1-1）：（0.1-1）的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomycesmicroflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093组成。
本发明采用涂布平板法，通过测定大量有益微生物对灰霉病病原菌的抑制效果发现，将热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCCNo.M207093制成复合菌液，其具有非常显著地拮抗灰霉病病原菌生长的作用。因此，本发明的第二个目的是提供上述复合菌剂在制备拮抗瓜果蔬菜灰霉病病原菌的制品中的应用。
本发明第三个目的在于利用上述复合菌剂制备一种防治土传病害的生物有机肥，它是这样实现的：
一种生物有机肥，按如下方法制备而成：将猪粪与秸秆颗粒按1.8-2.5：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1-1.5米，当堆温升至75-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为28-35%，翻堆2-5次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为45-50%，堆高0.6-0.9米，堆温达到48℃时翻堆，发酵3-5天，得生物有机肥；所述复合菌剂由包含菌落形成单位数目比为（1-10）：（0.1-1）：（0.1-1）的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomycesmicroflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093组成。
所述生物有机肥优选按如下方法制备而成：将猪粪与秸秆颗粒按2.0-2.2：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1.2米，当堆温升至78-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为30-33%，翻堆2-3次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为47-48%，堆高0.75米，堆温达到48℃时翻堆，发酵4天，得生物有机肥；所述复合菌剂由菌落形成单位数目比为10：0.5：0.5的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093组成。
进一步优选地，所述秸秆颗粒为麦杆、稻秆、玉米杆、谷秆和油菜秆的一种或两种以上经粉碎后的颗粒。
本发明通过田间试验发现，以猪粪与秸秆颗粒为主要发酵原料，以热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093组成的复合菌剂为有益微生物进行发酵，并调整堆肥发酵工艺参数，生产获得了生态防治瓜果蔬菜灰霉病的生物有机肥。因此，本发明的第四个目的是提供上述生物有机肥在制备防治瓜果蔬菜灰霉病的肥料中的应用。
本发明的第五个目的在于以有机废弃物为主体发酵原料，开发以堆肥为有益菌生物载体的功能性有机肥生产工艺，实现有机废弃物资源化处理及农作物土传病害有效防治的双重目的。具体的，它是这样实现的：
一种生物有机肥的制备方法，包括如下步骤：将猪粪与秸秆颗粒按1.8-2.5：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1-1.5米，当堆温升至75-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为28-35%，翻堆2-5次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为45-50%，堆高0.6-0.9米，堆温达到48℃时翻堆，发酵3-5天，得生物有机肥；所述复合菌剂由包含菌落形成单位数目比为（1-10）：（0.1-1）：（0.1-1）的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomycesmicroflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093组成。
所述生物有机肥的制备方法优选为如下步骤：将猪粪与秸秆颗粒按2.0-2.2：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1.2米，当堆温升至78-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为30-33%，翻堆2-3次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为47-48%，堆高0.75米，堆温达到48℃时翻堆，发酵4天，得生物有机肥；所述复合菌剂由菌落形成单位数目比为10：0.5：0.5的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093组成。
进一步优选地，所述秸秆颗粒为麦杆、稻秆、玉米杆、谷秆和油菜秆的一种或两种以上经粉碎后的颗粒。
与现有技术相比，本发明筛选出了具有协同抑制灰霉病病原菌生长的复合菌剂，该复合菌剂能非常显著地拮抗灰霉病病原菌生长。利用该复合菌剂制备的生物有机肥对瓜果蔬菜灰霉病具有药肥两用的双效作用，同时实现了对有机废弃物的资源化处理，具有显著的进步性。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1复合菌剂的制备
菌体培养基：米糠0.6g/L、麸皮0.2g/L、秸秆粉0.8g/L、豆粕0.4g/L,pH值7.0。
热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045在上述菌株培养基中34℃，200r/min摇床振荡培养3-5d，收集所有的发酵液，低温负压干燥后作为菌剂A。
乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626在上述菌株培养基中37℃，200r/min摇床振荡培养3-5d，收集所有的发酵液，低温负压干燥后作为菌剂B。
地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093在上述菌株培养基中32℃，200r/min摇床振荡培养3-5d，收集所有的发酵液，低温负压干燥后作为菌剂C。
将上述方法制备的菌剂A、菌剂B和菌剂C按如下要求混合：菌剂A中热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、菌剂B中乳糖细黄链霉菌（streptomycesmicroflavus)CICC23626、菌剂C中地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCCNo.M207093的菌落形成单位（CFU）数目比为10：0.5：0.5。混合后的复合菌剂，其中每克菌剂有效活菌数（cfu）大于2.4亿个。
实施例2生物有机肥的制备
将玉米杆粉碎成颗粒，取鲜猪粪与玉米秆颗粒按2.0-2.2：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1.2米，当堆温升至78-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为30-33%，翻堆2-3次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为47-48%，堆高0.75米，堆温达到48℃时翻堆，发酵4天，得生物有机肥；其中，复合菌剂由菌落形成单位数目比为10：0.5：0.5的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093配制而成。本发明制成的生物有机肥，其中每克肥料中所含有效活菌数（cfu）大于108个，有机质含量（以干基计）大于25%，水分含量低于30%，其它指标符合生物有机肥国家行业标准。
实施例3生物有机肥的制作
将麦杆粉碎成颗粒，取鲜猪粪与玉米秆颗粒按2.3-2.5：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1.2米，当堆温升至78-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为30-33%，翻堆2-3次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为47-48%，堆高0.75米，堆温达到48℃时翻堆，发酵4天，得生物有机肥；其中，复合菌剂由菌落形成单位数目比为10：0.1：0.1的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093配制而成。本发明制成的生物有机肥，其中每克肥料中所含有效活菌数（cfu）大于108个，有机质含量（以干基计）大于25%，水分含量低于30%，其它指标符合生物有机肥国家行业标准。
实施例4生物有机肥的制作
将玉米杆粉碎成颗粒，取鲜猪粪与玉米秆颗粒按2.0-2.2：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1.2米，当堆温升至78-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为30-33%，翻堆2-3次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为47-48%，堆高0.75米，堆温达到48℃时翻堆，发酵4天，得生物有机肥；其中，复合菌剂由菌落形成单位数目比为1：1：1的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093配制而成。本发明制成的生物有机肥，其中每克肥料中所含有效活菌数（cfu）大于108个，有机质含量（以干基计）大于25%，水分含量低于30%，其它指标符合生物有机肥国家行业标准。
实施例5不同菌株对灰霉菌的抑制试验研究
NA培养基的配制：称取蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g和琼脂15g，将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min，即可。
PDA培养基的配制：称取去皮马铃薯200g，切块煮沸30min，然后用纱布过滤取汁，再加20.0g葡萄糖及20.0g琼脂，溶化后补足水到1000mL，分装到10个150mL的三角瓶，121℃灭菌30min，即可。
按本发明实施例1的工艺分别发酵热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCCNo.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093，收集发酵液。将各发酵液4000r／min离心30min，上清液经过0.22μL膜过滤，滤除菌体，得无菌发酵上清液。将各发酵液4000r／min离心30min，弃上清液，加入新鲜的NA培养基直至与原发酵液相同的体积，得菌悬液。
在无菌条件下，取20mL经灭菌后冷却至45℃左右的PDA培养基加入培养皿，制成PDA平板。放置24h后，在平板中央接种病原菌灰霉菌菌丝，22℃培养4d。在已长好的灰霉菌平皿中，用直径0.5cm打孔器在菌落边缘切取菌落圆块，备用。
用无菌水稀释发酵液至菌体浓度为1×105mL-1的稀释液，其中菌体计数法采用的是显微直接计数法。向放置l天的PDA平板中加入100μL的拮抗菌发酵稀释液，用涂布器涂匀，每个处理4个重复。将切取的灰霉菌菌块接种在涂好的平板中央，有菌丝的一面接触平板。25℃培养4d后，用直尺“十字交叉法”测量灰霉菌菌落直径(单位为cm)，结果取其平均值。按如下公式计算抑菌率：抑菌率=(D对照-D处理)／D对照×100%。
根据表1的试验结果可以看出，三种菌株分别对灰霉菌的抑制效果不显著，尤其是热带假丝酵母对灰霉菌的抑制作用不明显。令人欣喜的是，由这三种菌株组成的复合菌液却表现出了对灰霉菌极为显著的抑制效果（P＜0.01）。
表1不同菌株对灰霉菌的抑制效果比较
注：与热带假丝酵母比较，*P＜0.05，**P＜0.01；
与乳糖细黄链霉菌比较，￥P＜0.05，￥￥P＜0.01；
与地衣芽孢杆菌比较，$P＜0.05，$$P＜0.01。
另外，表1中的复合菌液，其中菌体由菌落形成单位数目比为10：0.5：0.5的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomycesmicroflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093组成，菌体浓度为1×105mL-1。
实施例6生物有机肥防治番茄灰霉病的试验研究
选择三块土壤性状一致、肥力均匀中等，且番茄灰霉病发病较重的棉田，分组为试验田A、B，并对这三块地所种植的番茄分别作如下处理：
试验田A（0.5亩）：每亩施用实施例2生物有机肥100kg；
试验田B（0.5亩）：每亩施用实施例4生物有机肥100kg；
对照田（0.5亩）：每亩施用实施例2灭菌生物有机肥100kg作为对照。
试验前后取样调查病情（试验后取样的时间为施肥后2周）。各试验田采用5点取样法，每点调查3株全部叶片和果实，每张叶片按病斑占叶面积的百分率进行病情分级记载，计算病情指数。果实按分级标准将每次调查结果汇总，计算病情指数。
病害叶片调查分级标准：0级：无病斑；1级：单叶片有病斑3个；3级：单叶片有病斑4-6个；5级：单叶片有病斑7-10个；7级：单叶片有病斑11～20个，部分密集成片；9级：单叶片有病斑，占叶面积1／4以上。
病害果实调查分级标准：0级：无病班；l级：残留花瓣发病或柱头发病；3级：萼片腐烂或柱头发病蔓延到果脐部；5级：果脐部有浸润斑无霉层；7级：果脐部有霉层但未扩展到其他部位；9级：霉层扩展到果实的其他部位。
叶片病情指数=[∑(各级病叶数×相对级数值)／(调查总叶数×9)]×100
果实病情指数=[∑(各级病果数×相对级数值)／(调查总果数×9)]×100
由表2、3的试验结果可以看出，通过田间试验本发明的生物有机肥可显著降低番茄叶片和果实灰霉病病情指数，对番茄灰霉病具有很好的防治效果。
表2生物有机肥对番茄叶片灰霉病病情指数的影响
表3生物有机肥对番茄果实灰霉病病情指数的影响
Claims (9)
1.一种复合菌剂，其特征在于由以下菌体组成：菌落形成单位数目比为（1-10）：（0.1-1）：（0.1-1）的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCC No.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）CCTCC No.M207093。
2.根据权利要求1所述复合菌剂在制备拮抗瓜果蔬菜灰霉病病原菌的制品中的应用。
3.一种生物有机肥，其特征在于按如下方法制备而成：将猪粪与秸秆颗粒按1.8-2.5：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1-1.5米，当堆温升至75-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为28-35%，翻堆2-5次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为45-50%，堆高0.6-0.9米，堆温达到48℃时翻堆，发酵3-5天，得生物有机肥；所述复合菌剂由菌落形成单位数目比为（1-10）：（0.1-1）：（0.1-1）的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCCNo.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（BacillusLicheniformis）CCTCC No.M207093组成。
4.根据权利要求3所述生物有机肥，其特征在于按如下方法制备而成：将猪粪与秸秆颗粒按2.0-2.2：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1.2米，当堆温升至78-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为30-33%，翻堆2-3次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为47-48%，堆高0.75米，堆温达到48℃时翻堆，发酵4天，得生物有机肥；所述复合菌剂由菌落形成单位数目比为10：0.5：0.5的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCCNo.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（BacillusLicheniformis）CCTCC No.M207093组成。
5.根据权利要求3或4所述生物有机肥，其特征在于：所述秸秆颗粒为麦杆、稻秆、玉米杆、谷秆和油菜秆的一种或两种以上经粉碎后的颗粒。
6.根据权利要求3或4所述生物有机肥在制备防治瓜果蔬菜灰霉病的肥料中的应用。
7.一种生物有机肥的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将猪粪与秸秆颗粒按1.8-2.5：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1-1.5米，当堆温升至75-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为28-35%，翻堆2-5次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为45-50%，堆高0.6-0.9米，堆温达到48℃时翻堆，发酵3-5天，得生物有机肥；所述复合菌剂由菌落形成单位数目比为（1-10）：（0.1-1）：（0.1-1）的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCCNo.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（BacillusLicheniformis）CCTCC No.M207093组成。
8.根据权利要求7所述生物有机肥的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将猪粪与秸秆颗粒按2.0-2.2：1的重量比均匀混合，调节含水量为28-35%，堆高1.2米，当堆温升至78-80℃时翻堆，并加水以保持堆肥含水量为30-33%，翻堆2-3次后，将堆体翻开使堆温降至42-46℃时，接入复合菌剂，调节含水量为47-48%，堆高0.75米，堆温达到48℃时翻堆，发酵4天，得生物有机肥；所述复合菌剂由菌落形成单位数目比为10：0.5：0.5的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CCTCCNo.AY92045、乳糖细黄链霉菌（streptomyces microflavus)CICC23626和地衣芽孢杆菌（BacillusLicheniformis）CCTCC No.M207093组成。
9.根据权利要求7或8所述生物有机肥的制备方法，其特征在于：所述秸秆颗粒为麦杆、稻秆、玉米杆、谷秆和油菜秆的一种或两种以上经粉碎后的颗粒。
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