CN103451135B - 一株枯草芽孢杆菌m3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌M3及其应用，属生物农药技术领域。其生产菌株为生产菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M3，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2013年07月11日；保藏号：CGMCC NO.7911。本发明的枯草芽孢杆菌M3作为制备用于防治白菜根肿病、番茄疮痂病、番茄根结线虫病、魔芋细菌性软腐病制剂的应用。本发明的有益效果在于上述病害均有明显稳定的防治效果，能够用于制备防治白菜根肿病、番茄疮痂病、番茄根结线虫病、魔芋细菌性软腐病的制剂中；具有高效、无毒、安全无残留，M3菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产。

Description

一株枯草芽孢杆菌M3及其应用

技术领域:

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌M3及其应用，属生物农药技术领域。

背景技术:

1.十字花科作物根肿病

十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的一种世界性病害。该病主要危害植株根部，通常苗期和成株期均感病，以苗期感病为主。通常苗期受害，严重时幼苗枯死，产量严重下降，甚至绝收；田间一旦受到根肿病菌的污染，土壤长期带菌，严重危胁着十字花科作物的可持续生产。近年来根肿菌(P.brassicae)在世界范围内发病日趋严重，尤其是在亚洲、北欧、澳大利亚、北美和日本等地区，根肿病己成为一种十字花科作物的主要病害，给蔬菜生产造成严重威胁，有些国家土地感染根肿的面积接近100％，造成的经济损失甚至达到50%。

该病在我国各省均有分布。目前，十字花科作物根肿病的发生有逐年加重的趋势，自2000年以来，四川省德阳、成都、眉山、凉山等油菜产区根肿病大面积发生，其中以广汉、新都、双流、彭洲、绵竹和西昌等县(市、区)发生严重，四川德阳市油菜根肿病2000年发生面积233hm²，产量损失30％以上的有12hm²，在云南蔬菜基地发生普遍且严重，随着农业产业化的推进和发展无公害有机蔬菜的要求，作为主要蔬菜和油菜的十字花科作物的根肿病研究具有重要的意义。

2.番茄细菌性疮痂病

番茄是世界范围内广泛栽培的作物，也是营养价值很高的植物。目前。番茄已经成为蔬菜类中产量最高的蔬菜品种，其产品贸易量已跃居世界第3。番茄疮痂病（bacterialspot）是番茄生产上最普遍的细菌性病害之一，也曾被称做番茄斑点病。容易与丁香假单胞菌属细菌所引起的番茄斑点病混淆。目前在我国云南、山西、北京、新疆、河南、山东等地区均有发生报道。病原菌为野油菜黄单胞菌疱斑致病变种(Xanthomonascampestris pv.vesicatoria)。病原菌通过气孔或伤口侵染植株,主要为害番茄叶片等地上部位，引起植株落叶，可在叶片、茎杆和果实上产生斑点（结痂），造成严重的产量损失和果实品质下降，给番茄生产带来巨大的损失，一般可造成20%-43%的减产，且国内暂无番茄疮痂病生物防治相关报道。

在番茄农业生产实践中通常采用栽培管理、种子处理和药剂防治的方法来控制该病害的发生，其中化学药剂以其见效快、使用简便和省时、省工的优点而被广泛使用。但近年来，生物防治以其生态环境友好、成本低、无污染的特点成为植物病害防治的热门研究领域。

3.茄科番茄根结线虫病

根结线虫对番茄造成严重的危害，带来严重的经济损失。其危害方式主要表现为直接危害和间接危害。A.L.Taylorand等指出，农田中的植物最容易受根结线虫的危害，由于孤雌生殖对数增值，使得虫口迅速增长，结果严重影响植物生长，降低了农作物的产量与质量。J.N.Sasser（1997）指出，根结线虫除了能直接对农作物造成损害外，还使真菌和细菌病害适于侵染。农田中各类病菌往往与线虫相互影响，或者互相促进侵染，或者相互抑制^[1]。我们作为发展中国家，对根结线虫的防治应当受到重视。

目前对线虫病害主要防治措施是使用化学药剂，但多数化学药剂毒性高且品种少。如今利用生物杀线虫剂控制根结线虫成为研究热点。

4.魔芋细菌性软腐病

魔芋富含葡甘露聚糖，是自然界仅有的几种含天然葡甘露聚糖的植物之一，也是唯一分布广、适应性强、可大量提取葡甘露聚糖的植物。是一种极具开发潜力的医疗保健食品和工业原料。据不完全统计，2005年，云南省种植面积达15万亩，全国的种植面积约为80万亩。魔芋细菌性软腐病是一种对魔芋生产具有毁灭性危害的世界性植物病害。据不完全统计，仅在云南省，魔芋软腐病每年综合发病率达35%以上，魔芋损失率达21.5%，每亩造成经济损失774元，全县每年由于软腐病危害而造成的魔芋损失达1200多万元。对于魔芋细菌性软腐病，目前国内主要以轮作等农业措施和大剂量的化学农药等防治措施，但在我国人多地少的情况下，采用轮作来防治魔芋细菌性软腐病的可行性越来越低；化学防治不仅成本高、防效差，而且污染环境，影响品质，并且一些病原细菌对生产上常用的农用链霉素表现出抗药性，使防治效果更差。另外，由于化学农药使用及农药残留量超过国际标准，影响了其对外出口的增长。

随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，人们对健康和环境问题日益关注，发展高产、优质、高效的魔芋生产已成为提高芋区农民经济收入的关键问题，特别是近几年有机魔芋或无公害魔芋生产已成为魔芋产业发展的主导方向，在防治病害方面更需要农业和生物防治等不造成农残和环境污染的防病措施。因此，筛选开发出一种高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治魔芋细菌性软腐病的生物制剂，对减轻病害危害、提高品质、增强魔芋农田生态系统稳定性、保障魔芋产业的健康发展，使农民增产、增收具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

目前，大量使用化学农药防治植物病害已造成对环境和人类健康的危害，加速了生物农药的研发和应用研究。芽孢杆菌属细菌是一类好氧或兼性厌氧并能产生抗逆性芽孢的细菌，能在极端条件下生存。芽孢杆菌（Bacillus spp.）在自然界分布非常广泛，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。它能够产生丰富的具有潜在植物病害防治和医学应用价值的抑菌物质，是植物病害生防微生物的重要组成部分。芽孢杆菌能够产生多种抑菌物质，包括脂肽类、磷脂类、聚酮类化合物等，芽孢杆菌营养要求简单，易于分离、培养和保存。田间应用已证实，其生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性和在不同植物不同年份防效的一致性等方面明显优于非芽孢杆菌和其它真菌生防菌剂。

发明内容:

本发明的目的在于克服现有方法的不足，提供了一种高效、无毒、安全、无残留、使用简便的枯草芽孢杆菌M3及其应用。

本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M3已经保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北晨西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年07月11日；保藏号：CGMCC NO.7911。

本发明的生产菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M3，分离自云南富源魔芋茎内，通过经形态学、培养性状、常规生理生化和Biolog全自动鉴定系统测定，和16srDNA序列分析，鉴定该内生细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M3。

该菌株具有以下特征：(1)菌落不规则圆形，菌落边缘裂页状，菌落初期粘稠，后期起皱，乳白色，不透明，菌体在液体中不易分散，不产色素，产芽孢；在显微镜下观察：菌体直杆状，大小0.7～0.8×2.0～2.4μm；(2)该菌株定殖能力强、抑菌能力强、能促进魔芋生长，具有杀菌、防病、增产的作用。该菌株可在白菜、番茄、魔芋的根际和体内定殖，并且对白菜根肿病、番茄疮痂病、番茄根结线虫病、魔芋细菌性软腐病均有一定防治作用(3)具有以下生理生化特征：革兰氏染色阳性，严格好气，不产生H₂S，利用过氧化氢酶、葡萄糖产酸、能与硝酸盐产生还原反应，V.P试验为阳性反应，能水解淀粉、水解酪蛋白、能使明胶液化、在2%、5%、10%NaCl中生长良好，能利用阿拉伯糖、葡萄糖、蔗糖，不能利用海藻糖、纤维二糖。

本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M3菌株，用于防治白菜根肿病、番茄疮痂病、番茄根结线虫病、魔芋细菌性软腐病制剂的制备中。即：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）M3菌株经过试管培养，摇床扩大培养，发酵培养制备为生物制剂，将其运用于白菜、番茄、魔芋上，测定其对白菜根肿病、番茄疮痂病、番茄根结线虫病、魔芋细菌性软腐病的防治效果和产量。

本发明的有益效果在于：

1、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M3菌株对白菜根肿病、番茄细菌性疮痂病、茄科作物根结线虫病、魔芋软腐病均具有明显稳定的防治效果，能够用于制备防治白菜根肿病、番茄疮痂病、番茄根结线虫病、魔芋细菌性软腐病的制剂中；

2、具有高效、无毒、安全无残留，M3菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产。

具体实施方式：

实施例1：制备生物制剂（以下为重量百分比）

生产菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M3，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2013年07月11日；保藏号：CGMCC NO.7911。

将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M3转到试管斜面培养基上，试管斜面培养基配方为：牛肉浸0.3%，酵母浸膏0.1%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，琼脂1.7%，含水量为96.1%-96.4%，pH：7.0。在28℃恒温培养2天，获得试管种。

液体发酵培养基配方为：黄豆粉2.0%，淀粉1.0%，葡萄糖0.30%，KH₂PO₄0.1%，蛋白胨0.2%(NH₄)₂SO₄0.05%，MgSO₄·7H₂O0.03%，CaCO₃0.1%，花生油0.1％，消泡剂0.01％，含水量为96.11%，pH7.5;

将试管种接种到500mL三角瓶（每瓶装200mL）液体培养基中，培养基配方为：牛肉浸0.3%，酵母浸膏0.1%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，琼脂1.7%，含水量为96.11%，pH7.5。于28℃恒温振荡培养14小时，转速为150rpm，所得培养液即为本发明生物制剂。

将获得的试管种接种到500mL三角瓶（每瓶装200mL）液体培养基中，培养基配方为：牛肉浸0.3%，酵母浸膏0.1%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，琼脂2.0%，含水量为96.11%，pH7.5。于28℃恒温振荡培养14小时，转速为200rpm，所得培养液转接至发酵罐中进行发酵生产，获得液体制剂。

液体发酵培养基配方为：黄豆粉2.0%，淀粉1.0%，葡萄糖0.30%，KH₂PO₄0.1%，蛋白胨0.2%(NH₄)₂SO₄0.05%，MgSO₄·7H₂O0.03%，CaCO₃0.1%，花生油0.1％，消泡剂0.01％，含水量为96.11%，pH8.0。

液体发酵条件

罐温：发酵罐的罐温均控制在25℃，通过插入培养基的温度计测量，以夹层内通入冷却水或热水的方法进行调节。

罐压：发酵罐的罐压控制在0.5/平方厘米，通过无菌空气入口和废气排放口进行调节。

搅拌：发酵罐的搅拌速度为200转/分钟。

抽样检查和培养条件调节：每2小时自取样管取样1次，测定pH，并涂片以结晶紫染色镜检菌体形态、有无杂菌的污染，观察菌体是否产芽孢等，待镜检菌体芽孢数占整个菌体的5%以上时，减少通风量和降低培养温度至22℃左右，其它条件不变，继续培养和抽样检查，待镜检菌体芽孢数占整个菌体的85%以上时，停止培养和放罐，发酵罐放罐时镜检计数，并用培养基平板方法进行活菌的计数。

培养周期：发酵罐的培养周期约为36小时。

液体发酵制剂：经平板计数测定含菌量，含菌量达180亿CFU/mL，供田间防治病害用。

即得本发明生物制剂。

实施例2：生防菌剂M3对白菜根肿病药效试验

1、供试材料

实验安排在云南农业大学温室进行。田间试验在云南省玉溪市通海县王武营村、楚雄州禄丰县金山镇岔河村两块田共三块根肿病发生严重地块，王武营和岔河村其中一块田的前茬作物为非十字花科作物，岔河村另外一块田前茬作物为白菜。供试大白菜品种：青岛83-1（青岛国际种苗有限公司）、春喜霸王1号（昆明春喜农业科技开发有限公司）、成杂5号（云南云鸿蔬菜花卉种苗研究所）。

病原菌接种方法：每份病菌取鲜质量15g匀浆，配置100mL菌液，利用菌落计数法使菌液孢子浓度为12×10⁷个/mL，将菌液加入到300g风干草炭土中，搅拌均匀，其含水量以手握成团、触之能散为宜，密封48h以上，病菌孢子浓度为4×10⁷个/g。培养土按草炭∶蛭石∶珍珠岩=2V∶1V∶1V配制，装入营养钵(规格为10cm×10cm)，浇足底水，中心用实心棒插一个深3cm、直径2cm的圆穴，置入病菌土。每份病菌土分装10钵，每钵播种4粒种子，均播在病菌土上，每份菌土保苗20株以上。播种后苗床地温控制在25℃，土壤湿度保持在90%，pH值控制在6.0-7.0，为病菌的发病营造良好的条件。

生防菌菌悬液制备：生防菌接种于装有250mL KB液体培养基的500mL三角瓶中，在摇床中（180rpm，25℃）震荡培养3d，用分光光度计在600nm波长下调OD值到0.6，菌悬液浓度相当于10⁸-10⁹CFU/mL。

生防菌株不同发酵组分的制备：在生防菌株达到生长指数期后，按如下方法制备不同组分：将发酵液离心（10000rpm，15min），收集上清液，然后用细菌过滤器过滤（Φ=0.45μm）彻底除去菌体，即得到无菌发酵液（代谢产物溶液）。

2.2测定生防菌对大白菜根肿病的生防效果的测定

2、温室试验

试验一（保护作用），先将制备好的M3发酵液，OD值为0.25（浓度约10⁸每CFU/mL）灌根接种到种好的白菜上，24小时后接种根肿菌孢子悬浮液。于7天和14天后再灌两次生防菌悬液。每株苗的生防菌用量为10mL。

试验二（治疗作用），先接种根肿菌，并在播种后7天、14天和21天将制备好的M3发酵液灌根，OD值为0.25。

试验三（生防菌与病原菌同时施用），接种病原菌的同时，将制备好的M3发酵液（OD值为0.25）一同施入，并于7天和14天后再灌两次生防菌悬液。

试验四（浸种处理），将制备好的M3发酵液（OD值为0.25）浸种1h后，将种子自然晾干。

试验五（壳聚糖包衣），取1g壳聚糖分散于100mL1%乙酸溶液中（或1g壳聚糖乙酸盐溶于100mL水中），加1g甘油（增塑剂），再用NaOH溶液调节PH到5.6。包衣：生防菌在KB培养基中，28℃培养48h，用还有生防菌的壳聚糖溶液包埋白菜种子。

3、田间药效试验

播种白菜种子，供试材料随机排列，每个材料种植5行，每行42株苗，设置三次重复。并在播种后7d、14d和21d将制备好的M3发酵液（OD值为0.25）灌根。每株苗灌菌100mL。

试验进行中，于病害发生高峰期进行采样，每次采样100株，调查并记录各个品种株高、叶面积、植株鲜重等生理指标和发病等级，统计根肿病发生率及病情指数，分析结果。

4、病情调查

接种后45d开始调查，病情分级标准:0级，根部无肿瘤，根系发育正常;1级，1%-30%的根着生少许肿瘤，有小的结节状肿块，相互不连接;2级，31%-60%的根着生肿瘤，有大的结节状或球状肿块，相互连接;3级，61%-100%的根着生肿瘤，膨大到形成纺缍形瘤，大的瘤块一直延伸到下胚轴，植株矮小，停止生长。

病情指数=[Σ（各级病株数×相对级数值）/最高级别×调查总株数]×100

病情指数<10为抗病，病情指数≥10为感病

发病率=（发病株数/调查总株数）×100

相对防效=（对照病情指数－处理病情指数）×100/对照病情指数

5、试验结果

表1温室试验测定M3对大白菜根肿病的防效结果

表2M3田间防治大白菜根肿病的结果

实施例3：生防菌剂M3对番茄疮痂病室内抑菌、田间药效试验

温室盆栽试验于2012年在云南农业大学温室进行。试验种植的番茄品种为Rutgus。该试验采用两种生防菌接种方式。其中一种是喷雾接种法。即先将番茄苗播种到盆里。待番茄长出4-6片真叶时，将制备好的M3发酵液（OD₅₉₀=0.25）10mL和病原菌菌液（OD₅₉₀=0.25）10mL，混合后喷向番茄叶片。另外一种是浸种法。即，在将番茄播种前用OD₅₉₀=0.25的M3发酵液给番茄种子浸种，然后用羧甲基纤维素进行种子包衣处理。然后置于28℃恒温摇床2h。然后将番茄播种到盆里。待番茄长出4-6片真叶时，将制备好的病原菌菌液（OD₅₉₀=0.25）10mL喷向番茄叶片。两组实验中均以无菌水作为对照组。每组实验各有7个处理组和对照组，均设置6个重复。调查方法如下：

病情分级标准参照方中达的《植病研究方法》，具体为：

0级     无病

1级     只有1-2个短条斑，病斑面积占叶面积的1/5以下

3级     病斑面积占叶面的1/4左右

5级     病斑面积占叶面的1/2左右

7级     病斑面积占叶面的3/4左右

9级     全叶发病

病情指数=∑[各级病株（叶）数×该病级值]×100/(调查总株叶数×最高病级数值)

病叶率=调查发病叶数/调查的总叶数×100%

相对防效=（对照病情指数－处理病情指数）×100/对照病情指数

表3M3两种处理方式对番茄疮痂病防效的影响

生防菌M3发酵液（OD590=0.25）对番茄疮痂病菌具有良好抑菌作用，抑菌圈为4.3-6.1mm。温室活体试验表明M3发酵液对该病也有很好的防效。

实施例4：生防菌M3制剂对番茄根结线虫病药效试验

温室盆栽试验于2012年在云南农业大学温室进行。试验种植的番茄品种为Rutgus。这次生防菌初筛选试验我们采用了两种生防菌接种方式。其中一种是灌根法。即先将番茄苗播种到盆里。待番茄长出4-6片真叶时，将生防菌发酵液（OD590=0.25）20mL和3000条线虫均匀混合到盆土中。另外一种是浸种法。即，在将番茄播种前用OD600=0.5的生防菌发酵液给番茄种子浸种，然后用羧甲基纤维素进行种子包衣处理。然后置于28℃恒温摇床2h。然后将番茄播种到盆里。待番茄长出4-6片真叶时，将3000条线虫均匀混合到盆土中。两组实验中均以无菌水作为对照组。每组实验各有15个处理组和对照组，均设置6个重复。接种线虫后，定期检查植株根结线虫发病情况。在接种后一个月进行正式调查。调查方法如下：

发病级数分类标准依据K,R.Barder分类标准（李永波.2003）：

0级     无病

1级     轻微感染，仅有少量根结，根结百分率小于5%

2级     根结明显，根结百分率小于25%

3级     根结百分率25%-50%

4级     根结百分率50%-75%

5级     根结百分率76%以上

根结百分率=（具有根结的根数/总的根数）×100%

根结线虫抑制百分率=（对照根结百分率-处理根结百分率）×100%/对照组根结百分率

相对防效=（对照病情指数－处理病情指数）×100/对照病情指数

表4M3两种处理方式对番茄根结线虫防效的影响

生防菌M3发酵液（OD₅₉₀=0.25）对线虫具有100%的触杀作用。

实施例5：生防菌M3制剂对魔芋软腐病室内抑菌、田间药效试验

1、室内抑菌试验

采用含菌平板法：在灭过菌的培养皿中加入100μl病原菌悬液后，加入培养基，混匀。在无菌条件下用吹风机吹干待用。在每块平板上放置4个牛津杯(直径0.6cm、高1.0cm)，用移液枪分别向每个牛津杯内加入供试内生拮抗菌100μl或无菌水各100μl，然后将平板放置在28℃培养箱培养。每皿三个处理，每一处理三个重复。将平板放在恒温箱中28℃培养，每天观察一次，并记载抑菌圈的变化情况。

2、不同接种时间、接种浓度、接种方式对防效的影响

a.不同接种时间对防效的影响

离体接种薯块的制备：选取把表皮完整无损伤健康魔芋种球，去皮，并用75%的乙醇进行表面消毒处理，将整个种球切成若干个厚度3cm左右的魔芋薯块，用灭菌的打孔器（Φ=6mm）打孔，置于灭菌培养皿中(皿底含灭菌滤纸保湿)。

试验处理：不同接种时间对魔芋薯块腐烂情况的影响：将培养好的内生拮抗细菌M3发酵液（浓度为3×10⁸CFU/mL）提前一天接种到魔芋薯块孔中，然后再接种魔芋软腐病原菌MY9；将培养好的内生拮抗细菌M3发酵液同时和魔芋软腐病原菌MY9接种到魔芋薯块孔中；将培养好的魔芋软腐病原菌MY9（浓度为3×10⁸CFU/mL）提前一天接种到魔芋薯块孔中，然后再接种内生拮抗细菌M3发酵液；内生拮抗细菌与病原菌的接种浓度和接种量一致，均为3×10⁸CFU/mL，接种量为60μL/孔。每个处理重复3次，28℃培养24-72h观察软腐情况。

b.不同接种浓度对防效的影响

不同接种浓度对魔芋软腐病防效的影响：待魔芋植株进入成熟期后，选取长势一致的健康植株进行接种试验。将培养好的内生拮抗细菌1-7、M2、M3发酵液按原液、200倍稀释、500倍稀释三个浓度，采用灌根法接种，接种量为100mL，1天后采用同样方法接种魔芋软腐病菌MY9，接种浓度为3×10⁸CFU/mL，接种量为100mL。每个处理重复三次，待病情稳定后调查发病情况。

c.不同接种方式对防效的影响

生防菌M3液体制剂原液、200倍稀释液、200倍稀释液、CK对照均采用种球包衣或者灌根法，每株魔芋根部浇药液50毫升，发病初期施第一次用药，共施药2次，间隔7天。供试作物为花魔芋（富源县地方品种），防治对象为魔芋细菌性软腐病，试验地点为云南省富源县竹园镇。试验设5个处理，3次重复，共15个小区。小区面积不小于20平方米，随机排列。四周设保护行，收获时每小区测产。

调查方法：在魔芋发病后期，对试验小区进行病害调查.根据魔芋软腐病地上部分症状特点及病情发展趋势，我们将病斑分为环绕型和纵向型，前者病斑环绕叶柄，病情发展快.会很快引起复叶倒伏，危害性大；后者病斑只在叶柄一侧，多沿维管束纵向扩展，后期向横向扩展后导致整个叶柄腐烂。魔芋软腐病的分级标准(病情分为5级)，0级：无症状；l级：叶柄一侧有2cm以下小型水浸状病斑，或病斑长占叶柄总长度的1/10以下，同侧叶片轻度黄化；2级:叶柄一侧有2cm以上病斑，或病斑长占叶柄总长度的1／10-5/10，同侧叶片黄化；3级：病斑呈环绕型，或纵向型病斑长度占叶柄总长的5/10以上，叶片大部分黄化或部分枯死；4级：全叶枯黄或倒伏腐烂。若整个复叶从顶端开始黄化，叶柄与块茎连接处有软腐症状，为块茎发病，病情归入5级。

3、试验结果

表5M3菌剂对魔芋软腐病菌的抑菌作用测定

表6不同接种时间对防效的影响

表7不同接种浓度及接种方式对防效的影响

总体结果表明，本发明的生生物制剂（不管是液体菌剂还是可湿性粉剂）防治白菜根肿病、番茄疮痂病、番茄根结线虫病、魔芋细菌性软腐病效果显著，且兼有促生、增产的效果。本制剂可通过浸种、灌根、喷雾等方式施用。本发明的制剂已在云南省曲靖市富源县及楚雄市禄丰县等地进行了田间防效试验，证明该生防制剂防效显著、稳定，可以有效地解十字花科蔬菜（大白菜）根肿病、番茄细菌疮痂病、茄科作物根结线虫病、魔芋软腐病的防治难题。

本生防制剂能够与其他的杀细菌农药、植物生长调节剂混合使用，但必须保证所混药剂对本发明采用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M3无副作用。

本发明的细菌生防制剂一般在作物播种或病害始发期施用。方法是播种前，采用发酵制剂与种球浸(拌)种后，凉干施入土壤中，或在病害始发期将本制剂通过灌根施入白菜、番茄、魔芋茎基部或喷雾方法，稀释300-500倍使用。病害生严重地区可在植物生长过程中追施2-3次。

实际应用表明：本发明具有对十字花科蔬菜根肿病、番茄细菌性疮痂病、茄科蔬菜根结线虫病、魔芋软腐病防治效果明显；具有成本低、使用简便、有效期较长的特点。

Claims (2)

1.一株枯草芽孢杆菌M3，特征在于生产菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）M3，，已于2013年07月11日保藏在保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.7911。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌M3在制备防治白菜根肿病、番茄疮痂病、番茄根结线虫病、魔芋细菌性软腐病制剂中的应用。