CN114164152B - 一种枯草芽孢杆菌Yb-1及其分离方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌Yb‑1及其分离方法与应用，涉及生物技术领域，该菌株于2021年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22659。本发明首次从蔬菜作物上分离出一种能够对辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄细菌性疮痂病菌产生拮抗作用的枯草芽孢杆菌Yb‑1；本发明通过枯草芽孢杆菌Yb‑1对蔬菜种子的萌发促生试验，枯草芽孢杆菌Yb‑1对种子芽长和根长具有促生作用，且能提高种子发芽率和生根率；本发明通过灌根法、针刺法和剪叶法评价芽孢杆菌对辣椒和番茄的安全性，结果表明，枯草芽孢杆菌Yb‑1接种后对辣椒和番茄均安全。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种枯草芽孢杆菌Yb-1及其分离方法与应用。
背景技术
植物病害是威胁农业生产的重要因素，一直以来化学农药的长期大量使用不仅使病原菌产生了抗药性，而且农药残留对人、蓄和环境都有为害。随着人类对环境保护和食品安全意识的增强，具有良好防治效果的生物防治策略已引起人们的高度重视，生物防治是利用有益生物来抑制或者消灭有害生物的一种方法，无害、无毒、无污染、不易产生抗药性，将来可能逐步替代化学农药成为一个环保安全的选择。在植物体内存在一种植物内生细菌，繁殖力高、种类多、生活周期较短而且易于培养，是防治植物病害的重要微生物资源，可以在促进植物组织健康生长的同时控制植物病害的发生和发展，因此被大量应用于植物病害防治研究上。像芽胞杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、沙雷氏菌(Serratia)和节杆菌(Arthrobacter)等都在控制植物真菌性病害上有突出作用。在农业生态系统中，充分利用生防菌株的生物学潜力有助于减少化肥和农药的投入，促进植物生长，减轻环境污染，实现农业可持续发展。
植物内生菌不仅能促进植物生长，增加作物产量，还能够通过诱发植物自身的抗病潜能从而增强植物的抗病性，对植物本身而言不是一个外来物种，最具防病潜力与应用价值。芽胞杆菌是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的革兰氏阳性菌，杆状或者球状，具有生长快速、抗逆性强、适应范围广等优点。芽孢杆菌在生长代谢过程中能产生多种抑菌物质，包括低分子量抑菌肽、抑菌蛋白和挥发性抑菌物质，这些物质在植物病害防治中起了重要作用,可见芽孢杆菌具有很好的应用前景和极大的开发潜力。
尽管对植物病害的生物防治已进行了大量研究，但芽孢杆菌真正应用于生产仍然受到很多因素的制约。芽孢杆菌不污染环境，对人、畜、植物安全，对植物病害有较长期的控制作用，但易受化学杀菌剂的干扰，见效也慢。有时芽孢杆菌在体外和在体内的生物测定结果往往显示不一致，在应用过程中，由于田间环境因子如温度、湿度、光照等的不断变化而影响芽孢杆菌的定殖和繁殖，导致其在田间大生态系统中的行为和作用方式会出现很大差别。因此，以植物体内芽孢杆菌为主要对象进一步研究对植物病害生物防治具有重大意义。
发明内容
为解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌Yb-1及其分离方法与应用，为农作物的生产安全和质量安全提供技术支持，降低田间化学农药的使用，减少茄科蔬菜及土壤农残，创造显著的经济效益、社会效益和生态效益。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Yb-1，其特征是，该菌株于2021年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.22659。
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Yb-1为革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到柱状。单个细胞0.7～0.8×2.0～3.0μm，无夹膜，周生鞭毛，可运动。菌落表面粗糙，常形成凸起状皱缩，不透明，乳白色或淡黄色。需氧菌。可利用蛋白质、淀粉及多种糖类。可产生枯草菌素、多粘菌素等多种活性物质。
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌Yb-1的分离方法，包括以下步骤：
获取蔬菜样本，采用研磨、稀释、划线方法分离芽孢杆菌，对分离的芽孢杆菌进行多次纯化培养后初步分离到芽孢杆菌菌株；
对初步分离的芽孢杆菌菌株进行生理生化特性鉴定分析，根据基本特征明显差异性对芽孢杆菌菌株进行筛选鉴定，得到如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌Yb-1。
优选的，所述芽孢杆菌菌株的初步分离具体为：
选取蔬菜样本，将蔬菜样本剪成4mm左右的正方形；
将正方形的蔬菜样本放入装有75％无水乙醇的培养皿消毒，根据不同材料消毒时间为30s-2min，并用无菌水清洗2次；
将消毒清洗后的蔬菜样本放入点滴皿中加入无菌水研磨，用枪头吸取50μL左右放入LB平板上划线，28℃下培养2-3d；
观察芽孢杆菌生长情况，挑取疑似菌落进行纯化培养，初步分离到芽孢杆菌菌株。
本发明提供的一种微生物菌剂，其该菌剂包含上述的一种枯草芽孢杆菌Yb-1、其发酵培养物、其发酵产物中的一种或多种；或，该菌剂由上述的一种枯草芽孢杆菌Yb-1、其发酵培养物、其发酵产物中的一种或多种组成。
本发明提供的上述两种微生物菌剂在作为辣椒炭疽病菌的拮抗剂中的应用。
本发明提供的上述两种微生物菌剂在作为茄子黄萎病菌的拮抗剂中的应用。
本发明提供的上述两种微生物菌剂在作为番茄灰霉病菌的拮抗剂中的应用。
本发明提供的上述两种微生物菌剂在作为番茄细菌性疮痂病菌的拮抗剂中的应用。
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌Yb-1在植物病害生物防治中的应用。
具体的。所述植物病害由辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄细菌性疮痂病菌中的一种或多种引起。
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌Yb-1在促进蔬菜生长且同时提高种子发芽率和生根率中的应用。
本发明通过将辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄细菌性疮痂病菌置于PDA培养基上30℃培养6d，制备PDA培养基平板；将PDA培养基平板晾干后，用灭菌的打孔器在平板上打出呈三角形分布的直径为4mm的孔，吹干孔内水分；取培养至对数期的芽孢杆菌菌液30μl加入到孔内，在平板中央放置待测菌种，无菌水做对照，倒置平板，30℃恒温培养7d后十指交叉法测量抑菌圈直径大小。
对茄子黄萎病菌的抑菌率为76.28％，对番茄灰霉病菌的抑菌率为74.07％，对番茄细菌性疮痂病菌的抑菌率为84.00％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次从蔬菜作物上分离出一种能够对辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄细菌性疮痂病菌产生拮抗作用的枯草芽孢杆菌Yb-1；
2、本发明通过枯草芽孢杆菌Yb-1对蔬菜种子的萌发促生试验，枯草芽孢杆菌Yb-1对种子芽长和根长具有促生作用，且能提高种子发芽率和生根率；
3、本发明通过灌根法、针刺法和剪叶法评价芽孢杆菌对辣椒和番茄的安全性，结果表明，枯草芽孢杆菌Yb-1接种后对辣椒和番茄均安全；
4、本发明为农作物的生产安全和质量安全提供技术支持，降低田间化学农药的使用，减少茄科蔬菜及土壤农残，创造显著的经济效益、社会效益和生态效益。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1是本发明实施例中芽孢杆菌分离过程示意图；
图2是本发明实施例中部分芽孢杆菌的初分离效果图；
图3是本发明实施例中纯化培养后的芽孢杆菌菌落效果图；
图4是本发明实施例中部分芽孢杆菌的抑菌效果图；
图5是本发明实施例中枯草芽孢杆菌Yb-1对蔬菜种子的促生作用
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：一种蔬菜内生枯草芽孢杆菌Yb-1的快速分离与鉴定方法
步骤一：如图1-3所示，获取蔬菜样本，采用研磨、稀释、划线方法分离芽孢杆菌，对分离的芽孢杆菌进行多次纯化培养后初步分离到芽孢杆菌菌株。
芽孢杆菌菌株初步分离具体为：选取蔬菜样本，将蔬菜样本剪成4mm左右的正方形；将正方形的蔬菜样本放入装有75％无水乙醇的培养皿消毒，根据不同材料消毒时间为30s-2min，并用无菌水清洗2次；将消毒清洗后的蔬菜样本放入点滴皿中加入无菌水研磨，用枪头吸取50μL左右放入LB平板上划线，28℃下培养2-3d；观察芽孢杆菌生长情况，挑取疑似菌落进行纯化培养，获得目标菌株Yb-1。
步骤二：对初步分离的芽孢杆菌菌株进行生理生化特性鉴定分析，根据基本特征明显差异性对芽孢杆菌菌株进行筛选鉴定。
生理生化特性测定分析具体为：对芽孢杆菌菌株Yb-1进行菌落形态描述、革兰氏染色、最适温度、pH测定、葡萄糖利用、柠檬酸钠利用、淀粉水解、明胶液化、接触酶试验、氧化酶试验等生理生化测定。
(1)革兰氏染色
a、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈(用来大致确定菌液滴的位置)。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
b、涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
c、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
d、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)。
e、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
f、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。
g、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
h、脱色：吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
i、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。革兰氏阳性细菌染色后呈紫色到蓝黑色，革兰氏阴性细菌染色后呈红色。
(2)最适温度、pH测定
设定不同的温度26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃培养芽孢杆菌，设置不同的pH值pH5-pH9培养芽孢杆菌，在经过不同温度和pH下培摇后测定菌液浓度，菌体生长最旺盛时的温度和pH为菌体最适温度和pH。
(3)葡萄糖的利用
葡萄糖培养基：(NH4)2HPO4为1g，MgSO4为0.2g，酵母膏为0.2g，葡糖糖为1％，水洗琼脂为5-6g，蒸馏水为1000mL，溴甲酚紫0.4％乙醇液2mL(先用95％乙醇溶解，再加水配成0.4％溶液)，pH为6.8-7.0。先调pH后再加指示剂。以上培养基分装，培养基高度约为4-5cm，115℃灭菌20min。用18-24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，室温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性，有气泡产生为产气。
(4)柠檬酸钠的利用
柠檬酸钠培养基：柠檬酸钠为2g，K2HPO4为1g，NH4H2PO4为1g,NaCL为5g,MgSO4为0.2g，琼脂为15-20g，1％溴麝香草酚蓝(酒精溶液)或0.04％苯酚红10ml,水1000ml。细菌可分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。
(5)淀粉水解作用
把细菌接种到淀粉琼脂平板上培养2d，然后用Lugol碘侵泡平板。清晰的、无颜色的区域表示有淀粉水解作用。注意：某些芽孢杆菌种产生有限的区域，所以应该刮掉菌落以便观察结果。Lugol碘：每100ml中碘酒5g，碘化钾10.0g，把碘和碘化钾溶于10ml水中，用蒸馏水定容。应用时，用蒸馏水稀释5倍。淀粉琼脂(每升蒸馏水中营养琼脂8g,可溶性马铃薯淀粉10.0g)。
(6)接触酶、氧化酶试验
接触酶试验：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡，挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3％过氧化氢溶液2mL(临时配置)，观察结果。于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。
氧化酶试验：取白色洁净滤纸沾取菌落。加1％盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加1％α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。(1％盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，干冰箱内避光保存。1％α-萘酚－乙醇溶液。)
对芽孢杆菌Yb-1进行初步分离和生理生化测定后，Yb-1为革兰氏阳性菌，菌落表面粗糙，常形成凸起状皱缩，不透明，乳白色，其结果如表1所示：
表1芽孢杆菌Yb-1生理生化基本特征
注：+为阳性反应；-为阴性反应。
步骤三：芽孢杆菌Yb-1的分子鉴定。将芽孢杆菌培养至对数期，提取基因组，采用16SrRNA通用引物27F/1492R进行扩增，扩增产物回收纯化后进行平端化反应，连接到pLBVecter含有致死基因的载体上进行连接转化，无需蓝白斑筛选。在含有氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB平板上直接挑取阳性克隆，进行测序，测序结果登陆NCBI网站进行Blast，同时采用gyrA、gyrB、rpoA、yyaR、yyaO等多基因结合的方法进行鉴定，将芽孢杆菌Yb-1鉴定为枯草芽孢杆菌。其结果如表2所示：
表2芽孢杆菌基本信息及鉴定结果
实例2枯草芽孢杆菌Yb-1抑菌活性鉴定
选取四种对蔬菜有害的病原菌进行枯草芽孢杆菌Yb-1抑菌活性鉴定，明确枯草芽孢杆菌Yb-1的抑菌效果。
在本实施例中，病原体为辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄细菌性疮痂病菌四种。
辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌、番茄灰霉病菌的拮抗作用鉴定具体为：将辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌、番茄灰霉病菌置于PDA培养基上30℃培养6d，制备PDA培养基平板；将PDA培养基平板晾干后，用灭菌的打孔器在平板上打出呈三角形分布的直径为4mm的孔，吹干孔内水分；取培养至对数期的芽孢杆菌菌液30μl加入到孔内，在平板中央放置待测菌种，无菌水做对照，倒置平板，30℃恒温培养7d后十指交叉法测量抑菌圈直径大小。
辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌、番茄灰霉病菌的抑菌率计算具体为：以不加菌剂的PDA平板做对照，25℃恒温培养箱中培养8d，十字交叉法测量菌落直径，计算菌落直径平均值和菌丝生长抑制率，菌丝生长抑制率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.4)]×100％。
番茄细菌性疮痂病菌的拮抗作用鉴定具体为：将番茄细菌性疮痂病菌置于YDC培养基上28℃培养2d，在无菌操作台下，取5ml培养至对数期的黄单胞菌加入到200ml的45℃下液化的LB固体培养基中，混匀后倒平板；平板晾干后，用灭菌的打孔器在平板上打出呈三角形的直径为4mm的孔，吹干孔内水分；取培养至对数期的待测芽孢杆菌加入到含有黄单胞菌的LB培养基孔中，每孔加30μl，每个浓度重复3次，无菌水做对照，倒置平板，28℃恒温培养24h后十指交叉法测量抑菌圈直径大小。
番茄细菌性疮痂病菌的抑菌率计算具体为：计算抑菌圈平均值，根据抑菌圈直径计算相对抑菌率，相对抑菌率＝(处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径)/(处理抑菌圈直径)×100％。
图4为部分芽孢杆菌抑菌效果图，a为Yb-1对辣椒炭疽病菌抑菌效果；b为Yb-1对番茄细菌性疮痂病菌抑菌效果。
选用初步分离到的枯草芽孢杆菌Yb-1进行抑菌情况测定，其结果如表3所示：
表3芽孢杆菌对4种病原的拮抗作用(单位：cm)
以辣椒炭疽病菌为例，对照的菌落平均直径为(7.92+7.78+7.32)/3＝7.67，半径为3.84，Yb-1处理的抑菌圈平均直径为(3.46+3.34+3.40)/3＝3.40，每个抑菌圈所处位置是对照区域的半径位置，因此处理区的菌落平均直径为(3.84-3.40)×2＝0.88，根据计算公式菌丝生长抑制率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.4)]×100％，可得Yb-1抑制辣椒炭疽病菌菌丝生长率(％)＝[(7.76-0.88)/(7.76-0.4)]×100％＝93.48％，以此类推计算辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌和番茄灰霉病菌的抑菌率。番茄细菌性疮痂病菌抑菌率计算方法，细菌的对照是长满整个平板的，因此对照区域抑菌圈直径只能算0.4cm，Yb-1处理区平均直径为(2.00+1.96+2.34)/3＝2.10，相对抑菌率％＝(处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径)/(处理抑菌圈直径)×100％，可得Yb-1抑制番茄细菌性疮痂病菌抑制率(％)＝[(2.10-0.4)/2.10]×100％＝80.95％。以此类推计算其他抑菌率，如表4所示：
表4枯草芽孢杆菌Yb-1对4种病原的抑菌率(％)
实施例3：枯草芽孢杆菌Yb-1对蔬菜种子的萌发促生试验
LB平板活化Yb-1菌株，挑取单菌落28℃，180rpm摇床培养至对数期。根据初期预实验，对菌株设置不同的浓度梯度。以十字花科蔬菜白菜和空心菜、茄科蔬菜辣椒和番茄、葫芦科蔬菜黄瓜及豆科蔬菜豇豆种子为对象，根据种子大小分别取20～40粒于培养皿中，培养皿底部垫入吸水滤纸，取不同浓度的菌液浸湿种子，室温进行催芽，定期进行湿润。每个浓度3个重复，无菌水做对照。由于每个种子发芽时间不一致，空心菜、白菜发芽较早，辣椒和番茄发芽较晚，需要定期观察种子芽和根的生长情况。测量芽长和根长进行统计分析，计算发芽率和生根率，研究各个浓度对种子的促生或抑制作用，选取促生作用较好的芽孢杆菌进行盆栽试验。
表5 Yb-1对蔬菜种子的促生作用单位：mm
Yb-1对种子的促生作用见图5和表5。图5中，a为番茄、b为白菜、c为空心菜、d为黄瓜以及e为豇豆种子。Yb-1对蔬菜种子的促生实验中，设置6个稀释浓度，一个对照，3个重复。统计时均取每个浓度的平均值。Yb-1对辣椒种子的促生作用中，原液均不能使种子发芽，有抑制作用。与对照相比，当Yb-1稀释浓度为10000X时，对芽长和根长均有促生作用，发芽率和生根率均比对照高10.83％。在番茄种子中，原液均不能使种子发芽，有抑制作用。与对照相比，当Yb-1稀释浓度为10000X时，对芽长和根长均有促生作用，而且发芽率比对照高20％，生根率比对照高18.33％。在白菜种子中，原液均不能使种子发芽，有抑制作用。与对照相比，当Yb-1稀释浓度为1000X和10000X时，对芽长和根长均有促生作用，当稀释浓度为1000X时，发芽率比对照高5.83％，生根率比对照高8.33％，当稀释浓度为10000X时，发芽率和生根率均比对照高0.83％。在空心菜种子中，原液均不能使种子发芽，有抑制作用。与对照相比，当Yb-1稀释浓度为1000X和100000X时，对芽长和根长均有促生作用，当稀释浓度为1000X时，发芽率和生根率均比对照高18.33％，当稀释浓度为100000X时，发芽率比对照高8.33％，生根率均比对照高3.33％。在黄瓜种子中，原液均不能使种子发芽，有抑制作用。与对照相比，当Yb-1稀释浓度为10000X时，对芽长和根长均有促生作用，而且发芽率比对照高3.33％，生根率比对照高5.00％。在豇豆种子中，Yb-1原液可使部分种子发芽，发芽率仅为6.67％，不能生根，当Yb-1稀释浓度为100X、1000X、10000X和100000X时，均对豇豆种子的芽长和根长有促生作用，但1000X的稀释浓度没有对照的发芽率高。综上，当Yb-1稀释浓度为10000X时，对辣椒、番茄、白菜、黄瓜和豇豆均具有促生作用，同时可提高种子发芽率和生根率。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Yb-1，其特征是，该菌株于2021年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22659；
该菌株从蔬菜中分离得到，该菌株可用于制备番茄细菌性疮痂病菌(Xanthomonascampestris pv.vesicatoria)的拮抗剂。
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