CN108085269B - 甲基营养型芽孢杆菌菌株ibfcbf-2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF‑2，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11231；甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF‑2及其生防菌剂具有抗真菌范围广、拮抗效果显著的特性，可用于防治植物土传真菌病，因而具有良好的工业化应用前景。同时，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF‑2在盆栽实验中防效显著，对农作物病害防治具有很大的实用价值。

Description

甲基营养型芽孢杆菌菌株IBFCBF-2及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及甲基营养型芽孢杆菌菌株IBFCBF-2及其应用。
背景技术
土传病害是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。土传病害包括立枯、纹枯、青枯、枯萎、疫病、猝倒、根腐、软腐、根结线虫、胞囊线虫等，这些病害通常侵染植物根部或茎部，从而引起作物根茎部乃至全株发病，造成重大经济损失。
目前主要是通过采用化学药剂对土传病害进行防控，而化学药剂的长期使用，会造成水源土壤污染、生态平衡被破坏、农药残留、次要病害猖獗和使病源微生物产生抗药性等一系列的严重后果。随着人们环保意识的增强，对食品安全问题的重视，以及对生态环境建设，保护生物多样性和农业可持续发展的要求，使得生物防控土传病害成为当前研究和开发的热点。
芽孢杆菌(Bacillus sp.)是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧生活，能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和抗有机溶剂的内生孢子，是一类重要的生物防治资源，其防治机理主要是：通过将芽孢杆菌定殖至植物根部、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，并分泌抗菌物质以抑制病原菌的生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌的入侵，从而达到生物防治的目的。目前，已有部分优良的芽孢杆菌已经分离出来，并成功的应用于植物病害的生物防治，如专利号CN 102747020 A“一株枯草芽孢杆菌及其应用”中提供了一种枯草芽孢杆菌BLG010及其杀菌剂，在防治香蕉枯萎病有很好的使用效果；又如CN103146622 A“一株土地类芽孢杆菌”中提供一种土地类芽孢杆菌NK3-4，在抑制大豆根腐病中起到了很好的使用效果；在如CN 103789228 A“一种枯草芽孢杆菌及其菌剂”中提供了一种枯草芽孢杆菌BS-KA2及其生物菌剂，在花生果腐病中起到了很好的使用效果，虽然，目前已存在芽孢杆菌类的生防菌剂，但是还存在着生防菌种类较少，抑菌效果单一、不稳定的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一株甲基营养型芽孢杆菌菌株及其应用，该菌株及其菌剂具有广谱抑菌性，且抑菌效果高效稳定，可有效防治植物土传真菌病害。
本发明提供了一株甲基营养型芽孢杆菌菌株IBFCBF-2，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11231。
优选的，所述甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2为革兰氏阳性菌，能够产生芽孢，可以分泌纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶。
优选地，所述甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的菌落边缘较整齐，表面凸起且湿润，颜色呈乳白色，不透明。
优选的，所述的甲基营养型芽孢杆菌可用于防治植物土传真菌病。
优选的，所述植物土传真菌病为辣椒疫霉病、亚麻立枯病、亚麻炭疽病、亚麻枯萎病、黄瓜枯萎病、马铃薯立枯病、油茶炭疽病和油菜菌核病。
优选的，所述含有甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：将甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2接种在灭菌后的液体培养基中，在25-30℃进行培养，摇床震荡2-4d，12000r/min离心5min后用无菌水稀释至浓度为105CFU/mL的悬浮液，即得含有甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂。
优选的，所述的液体培养基组成为10g/L的胰蛋白胨，5g/L的酵母浸出膏，20g/L的蔗糖，5g/L的NaCl；液体培养基的pH值为7.2-7.4。
优选的，所述的摇床震荡的转速为180r/min。
优选的，所述的含有甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂在防治辣椒疫霉病、亚麻立枯病、亚麻炭疽病、亚麻枯萎病、黄瓜枯萎病、马铃薯立枯病、油茶炭疽病和油菜菌核病中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了甲基营养型芽孢杆菌菌株IBFCBF-2(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11231)及其生防菌剂。甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2为革兰氏阳性菌，能够产生芽孢，可以分泌纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶，所分泌的β-1,3-葡聚糖酶可水解植物真菌细胞壁中成分的β-1,3-葡聚糖，羧甲基纤维素酶协同蛋白质酶可作用于真菌细胞壁分解其纤维素及蛋白质，从而抑制植物病原真菌的生长与增殖，因而本发明的IBFCBF-2具有抗真菌范围广、拮抗效果显著的特性，良好的工业化应用前景。同时，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2在盆栽实验中防效显著，对农作物病害防治具有很大的实用价值。
附图说明
图1是实施例1制备的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的形态图；
图2是实施例1制备的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的革兰氏染色图(a)和芽孢染色图(b)；
图3是实施例1制备的的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的PCR产物琼脂糖电泳图；
图4是实施例1提供的根据甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的16S rDNA序列构建的系统发育树图；
图5是实施例2中甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2对不同病原菌抑制效果图；A:辣椒疫霉病；B:亚麻立枯病；C:亚麻炭疽病；D:亚麻枯萎病；E:黄瓜枯萎病；F:马铃薯立枯病；G:油茶炭疽病；H:油菜菌核病；
图6是实施例2中甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2产拮抗蛋白图；A:胶体几丁质培养基；B:羧甲基纤维素钠培养基；C:茯苓粉培养基；D:脱脂牛奶琼脂培养基；
图7是实施例3中甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2防治油菜菌核病盆栽实验的示意图；
图8是实施例3中甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2防治黄瓜枯萎病盆栽实验的示意图。
具体实施方式
本发明实施里提供的甲基营养型芽孢杆菌菌株，使本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂能够有效防治植物土传真菌病害。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案作进一步详细的说明。
本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌菌株为甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2于2015年8月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.11231。
实施例1甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的制备与鉴定
一、甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的制备
S01：通过多点采样法采集土样，并将采集到的土样研细，本发明实施例中的土样取自中国农业科学院麻类研究所沅江实验站辣椒实验地；
S02：将研细的土样放入装有无菌水的离心管中充分震荡，制成浓度为10-1的土壤悬浮液；
S03：将所述土壤悬浮液逐级梯度稀释，得到不同浓度的土壤悬浮液；
S04：选取浓度为10-5、10-6和10-7三个梯度的土壤悬浮液，并加入到NA培养基平板上进行涂布处理，放到30℃的培养箱中培养48h，得到菌落；
S05：挑选形态不一的单菌落在斜面上进行划线保种，并培养24h，得到分离菌，将所述分离菌置于4℃的冰箱中保存备用；
S06：用直径0.5cm的打孔器将亚麻立枯、辣椒疫霉、黄瓜枯萎病原菌菌块接种到PDA培养基平板的中心，在距平板中心2.5cm十字交叉处等距离接种所述分离菌，同时以不接种分离菌的作为对照(CK)，每次处理进行3次重复实验，在温度为25℃条件下培养，当对照组(CK)长满全部器皿时，记录抑菌圈的大小，选择抑菌圈最大的为甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2。
其中，NA培养基为营养琼脂培养基，该营养琼脂培养基的组成按照浓度包括20g/L的琼脂，10g/L的胰蛋白胨，3g/L的牛肉膏，5g/L的NaCl。NA培养基在制备时的pH值为7.2-7.4，并经过20min的灭菌处理，且灭菌时的温度为121℃。PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
二、甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的鉴定：
1、形态学鉴定
将本实施例制备得到的菌株划线到NA培养基平板上，然后将平板倒置，在温度为30℃的条件下培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况，其在平板上的菌落形态如图1所示，由图可知，本实施例制备得到的菌株的菌落边缘较整齐，表面凸起且湿润，颜色呈乳白色，不透明。
用试剂盒对本实施例制备得到菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，并在油镜下观察菌株和对菌株进行拍照。该菌株的革兰氏染色和芽孢染色分别如图2(a)和图2(b)所示，从图2(a)中可以看出，经革兰氏染色后，甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2为杆状，且呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌；从图2(b)中可以看出，经芽孢染色后，甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2菌体显蓝色，芽孢显红色，由此说明本发明提供的菌株能够产生芽孢。
2、生理生化鉴定
(1)接触酶实验
在本实施例制备的菌株的液体培养液中直接滴加3％的过氧化氢，立即观察。若有大量气泡产生，则为阳性；若不产生气泡，则为阴性。本发明提供的菌株立即产生大量气泡，实验结果为阳性。
(2)氧化酶实验
取白色洁净滤纸一角，蘸取少量的本实施例制备的菌株菌落，加入浓度为1％的盐酸二甲基对苯二胺水溶液一滴，阳性者立即呈粉红色，且颜色会逐渐加深。在此次实验中，菌落不变色，实验结果为阴性。
(3)淀粉水解实验
将本实施例制备的菌株点接到淀粉培养基上，在温度为37℃的条件下培养24h，滴加少量碘液在淀粉培养基平板上，轻轻旋转，使碘液均匀分布在淀粉培养基平板上，观察菌落周围的情况。若菌落周围出现无色透明圈表明有水解淀粉的能力，反之，则没有。本菌株菌落的周围有透明圈产生，由此能够说明本菌株具有水解淀粉的能力。
(4)甲基红MR实验
挑取少量的本实施例制备的菌株，并接种于通用培养基上，在温度为30℃的条件下培养3-5d，培养结束后取培养液1mL，并加入甲基红指示剂1-2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。在此次实验中，菌液变黄，所以为阴性。
(5)VP实验
挑取少量的本实施例制备的菌株，并接种于通用培养基，在温度为30℃的条件下培养4d，培养结束后取培养液2.5mL先加入α-萘酚纯酒精溶液0.6mL，再加入浓度为40％的氢氧化钾水溶液0.2mL，摇动2-5min，阳性菌通常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或30℃的恒温箱中，若2h内仍不显现红色，则可判定为阴性。在此次实验中，菌液立即变红，所以为阳性。
(6)明胶液化实验
取本实施例制备的菌株，穿刺接种于明胶中，并使本菌株位于明胶深度的2/3处。在温度为20℃的条件下培养5-7d。每天观察结果本菌株是否被细菌液化，若被液化，则为试验阳性；若不被液化，则为阴性。在此次实验中，明胶未被液化，因此反应特征为阴性。
(7)硝酸盐还原实验
将本实施例制备的菌株接种于硝酸盐肉汤中，在温度为28℃的条件下摇床培养3d，然后取5mL培养液，按试剂盒(海博生物技术有限公司硝酸盐还原试剂盒)说明加入显色剂，变黄为阳性，反之，不变色为阴性。在此次实验中，菌液变黄，说明本反应特征为阳性。
(8)产硫化氢实验
将本实施例制备的菌株穿刺接种于醋酸铅培养基中，在温度为35℃的条件下培养24-48h，并观察结果。若培养基变黑，则为阳性；不变黑，则为阴性。在此次实验中，培养基未变色，说明反应特征为阴性。
(9)柠檬酸盐利用实验
挑本实施例制备的菌株在西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面上划线接种，在温度为37℃的条件下培养3-7d。若培养基为碱性者，即指示剂蓝色或桃红色的为阳性；若培养基不变色，则为阴性。在此次实验中，培养基未变色，说明反应特征为阴性。
(10)卵磷脂酶活性实验
用75％的乙醇将新鲜鸡蛋的表面进行消毒，并用灭菌的镊子将鸡蛋打个孔，倾去蛋清，然后用无菌吸管吸出卵黄，加入到融化后冷却至50℃左右的NA培养基中，混和均匀后放倒平板，点接本实施例制备的菌株，在温度为30℃的条件下培养24h，并进行观察。若菌落边缘出现浑浊圈者为酶阳性。在此次实验中，菌落边缘出现明显的浑浊圈，说明反应特征为阳性。
(11)丙二酸盐利用实验
挑取培养12h菌苔(本实施例制备的菌株)接种于丙二酸盐培养基，在温度为35℃的条件下培养24-48h，培养基由绿变蓝者为阳性，反之为阴性。在此次实验中，培养基变蓝，说明反应特征为阳性。
(12)葡萄糖发酵实验
挑取少量本实施例制备的菌株穿刺接种于葡萄糖氧化发酵培养基，在温度为30℃的条件下培养3d，观察培养基颜色的变化。若无颜色变化，则需要继续观察7d，培养基变黄者为发酵型。在此次实验中，培养基变黄，说明反应特征为阳性。
(13)半乳糖利用实验阳性
将本实施例制备的菌株接种在半乳糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用半乳糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，说明本菌株可以利用半乳糖。
(14)阿拉伯糖利用实验
将本实施例制备的菌株接种于阿拉伯糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用阿拉伯糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，说明本菌株可以利用阿拉伯糖。
(15)甘露糖利用实验
将本实施例制备的菌株接种于甘露糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用甘露糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，本菌株可以利用甘露糖。
(16)D-果糖利用实验
将本实施例制备的菌株接种于D-果糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用D-果糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，本菌株可以利用D-果糖。
(17)D-木糖利用实验
将本实施例制备的菌株接种于D-木糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用D-木糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，本菌株可以利用D-木糖。
综上，生理生化鉴定结果如表1。
表1甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生理生化特征结果
注：+：阳性反应；-：阴性反应.
3、16S rDNA序列分析
采用康为世纪生物科技有限公司基因组提取试剂盒提取本实施例制备的菌株的DNA，其具体操作步骤如下:提取试剂盒包括50μL的PCR反应体系，而PCR反应体系包括25μL的2×Master Mix；2μL的上游引物27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')；2μL的下游引物1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')；18μL的dd H2O；3μL的模板DNA。
PCR反应条件为：在温度为94℃预变性5min；94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸1min；30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
将得到的PCR产物进行脂糖凝胶电泳分析，从图3可知本实施例制备的菌株DNA全长约为1422bp。将得到的PCR产物由长沙维世尔生物科技有限公司进行测序，本实施例制备的菌株核苷酸序列表如序列表SEQ ID NO.1所示。将所得核苷酸序列通过NCBI—BLAST进行同源性序列比对分析，得到相似性较高的序列。运用MEGA6.0软件构建系统发育树(如图4所示)，本实施例制备的菌株的16S rDNA序列与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophilus)的同源性达到100％。
综合上述形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析结果，能够确定本实施例制备的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophilus)，其命名为甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2。
本发明实施例制备的甲基营养型芽孢杆菌菌株为甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2于2015年8月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.11231。
实施例2甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的抑菌效果评价
1、抑菌效果评价
以辣椒疫霉病、亚麻立枯病、亚麻炭疽病、亚麻枯萎病、黄瓜枯萎病、马铃薯立枯病、油茶炭疽病和油菜菌核病为例对甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2抑制效果的进行研究，其具体内容如下：
以油菜菌核病菌、亚麻立枯病菌、亚麻炭疽病菌、亚麻枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、油茶炭疽病菌及马铃薯立枯病菌为靶标菌，在距离平板中心2.5cm处点接甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2，以不接种IBFCBF-2细菌的平板为对照，每个处理重复3次。将平板倒置于28℃培养箱中，待对照组病原真菌长满平板时，测量候选拮抗细菌直径及细菌对每株病原真菌的抑菌圈直径。
由图5可知，甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2对上述所有植物病原真菌均有抑制效果，说明甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2具有广谱的抑菌性；从表2可知甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2对上述病原真菌的抑菌直径在15-32mm之间，而且从拮抗指数可以看出，其对上述病原真菌有很好的拮抗效果，说明甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2对上述植物病原真菌有高效的抑菌效果，可用于防治上述植物病原真菌引起的植物土传害病。
表2 IBFCBF-2对不同植物病原真菌拮抗的作用
注：表中小写字母表示拮抗菌HX-140对不同病原真菌拮抗效果的显著差异(P<0.05).
2抑菌机理研究
将实施例1制备的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2分别点接至含有胶体几丁质培养基、羧甲基纤维素钠培养基、茯苓粉培养基和脱脂牛奶琼脂培养基的平板中，将平板倒置于30℃培养箱中培养3d，观察菌落周围是否产生透明圈。
其结果如图6所示，甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2在羧甲基纤维素钠培养基、茯苓粉培养基和脱脂牛奶琼脂培养基上均有透明圈产生，说明甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2可以分泌纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶。真菌细胞壁干重的80％由碳水化合物组成，如：几丁质、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、纤维素、半乳聚糖等。大约10％由蛋白质及糖蛋白构成，蛋白质包括负责细胞壁生长的酶、特定胞外酶和将多糖交联起来的结构蛋白。甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2分泌的β-1,3-葡聚糖酶可水解真菌细胞壁中的β-1,3-葡聚糖中的β-1,3-糖苷键，羧甲基纤维素酶协同蛋白质酶可作用于真菌细胞壁分解其纤维素及蛋白质，从而抑制植物病原真菌的生长与增殖。
实施例3含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂在抑制油菜菌核病和黄瓜枯萎病中的应用
1、含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂的制备
将实施例1制备得到的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2接种在灭菌后的NA液体培养基(即牛肉膏蛋白胨液体培养基，其配比为10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏和5g/L NaCl，Ph＝7.2-7.4)中，在30℃进行摇床震荡培养2d，震荡速度为180r/min，接着12000r/min离心5min，取菌体，用无菌水稀释成浓度为105CFU/mL的悬浮液，即得含有甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂。
2、油菜菌核病和黄瓜枯萎病病原真菌菌液的制备
油菜菌核病和黄瓜枯萎病病原真菌分别接种到灭菌后的PDA液体培养基(PDA培养基的组成为200g的去皮马铃薯，20g的葡萄糖，1000mL无菌水，pH值为7.2-7.4)中，在28℃进行摇床震荡培养7d，震荡速度为180r/min，然后用无菌水将菌液稀释至105CFU/mL，即得油菜菌核病菌菌悬液和黄瓜枯萎病菌菌悬液。
3、含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂抑制油菜菌核病和黄瓜枯萎病中的应用
(1)含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂对油菜菌核病的防控效果
试验品种：油菜(种子由湖南省农业科学院蔬菜研究所提供)
病原菌：油菜菌核病菌
土壤：市售营养土
试验处理：对照组：施病原菌和无菌水；处理组：施病原菌和含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂
将油菜种子10％的双氧水进行表面消毒20min，用无菌水冲淋3遍后，置于的培养皿中，并将培养皿置于人工气候箱，在温度为30℃的条件下恒温暗光催芽，选取芽长为0.5cm的种子播于育苗钵中，每孔1株，加入营养土，对照组：施加5ml的油菜菌核病菌菌悬液和5ml的无菌水；处理组：施加5ml的油菜菌核病菌菌悬液和5ml的含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂。在生长过程中，每隔2d每孔施加5mL营养液，以保证基质较为湿润，幼苗能够正常生长。生长过程中观察幼苗的生长态势，播种20d后记录各处理发病株数，并计算发病率和防治效果。
对油菜幼苗的病情指数按以下标准进行统计：0级：植株健康，无病症；1级：1/4以下分枝数发病；2级：1/4-1/2的分枝数发病；3级：1/2以上分枝数发病。
计算公式为：
发病率＝发病株数/调查总株数×100％
病情指数＝∑(病级株树×病级代表值)/株数总和×最高病级的代表值×100
相对防效＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％
含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂对油菜菌核病的防控效果如表3所示，从表3中能够看出，处理组的的油菜的发病率更低，施加含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2生防菌剂对油菜菌核病的防效提高了55.88％。同时，从图7中能够看出处理组油菜苗长势良好，因而，本发明实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2及其生防菌剂能够有效的防治油菜菌核病。
表3甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2菌悬液对油菜苗期病害的抑制作用
(2)含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂对黄瓜枯萎病的防控效果
试验品种：黄瓜(种子由湖南省农业科学院蔬菜研究所提供)
病原菌：黄瓜枯萎病菌
土壤：市售营养土
试验处理：对照组：施病原菌和无菌水；处理组：施病原菌和含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂
将黄瓜种子10％的双氧水进行表面消毒20min，用无菌水冲淋3遍后，置于的培养皿中，并将培养皿置于人工气候箱，在温度为30℃的条件下恒温暗光催芽，选取芽长为0.5cm的种子播于育苗盆中，每盆10株，加入营养土，对照组：施加5ml的黄瓜枯萎病菌菌悬液和5ml的无菌水；处理组：施加5ml的黄瓜枯萎病菌菌悬液和5ml的含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂。在生长过程中，每隔2d每孔施加5mL营养液，以保证基质较为湿润，幼苗能够正常生长。生长过程中观察幼苗的生长态势，播种20d后记录各处理发病株数，并计算发病率和防治效果。
对黄瓜幼苗的病情指数按以下标准进行统计：0级：植株健康，无病症；1级：茎叶出现轻微病症，叶片黄化；2级：茎叶轻度萎蔫，出现坏死斑；3级：植株中度萎蔫，茎叶出现坏死斑；4级：植株严重萎蔫，倒伏枯死。计算公式为：
计算公式为：
发病率＝发病株数/调查总株数×100％
病情指数＝∑(病级株树×病级代表值)/株数总和×最高病级的代表值×100
相对防效＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％
从表4中能够看出，处理组黄瓜的发病率明显低于对照组的发病率，且防治效果更显著，达到76.37％，从图8中能够看出处理组黄瓜苗长势良好，因而，本发明实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2及其生防菌剂具有显著的拮抗效果。
表4含甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2的生防菌剂对黄瓜苗期病害的抑制作用

Claims (6)

1.一株甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2，其特征在于，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophilcus)其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.11231。
2.一种制备生防菌剂的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-2接种在灭菌后的液体培养基中，在25-30℃进行摇床震荡培养2-4d，接着12000r/min离心5 min后，用无菌水稀释成浓度为105 CFU/mL的悬浮液，即得含有甲基营养型芽孢杆菌的生防菌剂。
3.根据权利要求2所述制备生防菌剂的方法，其特征在于，所述的液体培养基组成为10g/L的胰蛋白胨，5 g/L的酵母浸出膏，20 g/L的蔗糖，5 g/L的NaCl；液体培养基的pH值为7.2-7.4。
4.根据权利要求2所述制备生防菌剂的方法，其特征在于，所述的摇床震荡的转速为180 r/min。
5.根据权利要求2~4任意一项所述的制备生防菌剂的方法得到生防菌剂。
6.根据权利要求5所述的生防菌剂在防治辣椒疫霉病、亚麻立枯病、亚麻炭疽病、亚麻枯萎病、黄瓜枯萎病、马铃薯立枯病、油茶炭疽病和油菜菌核病中的应用。
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Denomination of invention: Methyltrophic Bacillus strain IBFCBF-2 and its application

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License type: Common License

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Assignor: INSTITUTE OF BAST FIBER CROPS, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2022440000277

Denomination of invention: Methyltrophic Bacillus strain IBFCBF-2 and its application

Granted publication date: 20191206

License type: Common License

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