CN112940978B - 一种甲基营养型芽孢杆菌bam-6及其应用 - Google Patents

一种甲基营养型芽孢杆菌bam-6及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌菌株（Bacillus methylotrophicus）BAM‑6及其应用，该菌株于2020年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20129。该菌对干腐病、灰霉病、枯萎病、早疫病、环腐病等多种植物病原真菌有明显的拮抗作用；对蚜虫、飞虱、粉虱等同翅目害虫，蛴螬等鞘翅目地下害虫具有较强的防治效果；同时能够显著促进植物生长，而且环境安全性好，在开发成生物农药、生物肥料、生物种衣剂等生物制剂发面具有良好的应用前景。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌BAM-6及其应用
技术领域
本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌BAM-6及其应用。
背景技术
植物病虫害给农业生产带来严重的损失，化学农药与肥料在防治植物病虫害、提高产量等方面发挥了巨大作用。然而长期过量和不能合理、适时、对症用肥用药，使得肥药当季利用率低，带来农产品有毒有害物质超标、土壤板结酸化、病虫抗药性上升、环境污染和生态平衡破坏等一系列问题。实现农业绿色发展以及农产品产量与质量安全、农业生态环境保护相协调的可持续发展成为政府与消费者日益关注的焦点。研究开发安全、高效、环境友好的产品及化肥农药替代技术已成为保障粮食安全、食品安全和环境安全的战略需求。
微生物药肥具有安全、高效、无污染等特点，可以避免化学农药带来的危害，是未来发展趋势。芽孢杆菌（Bacillus）不仅产生抗逆性强的芽孢，还能分泌多种胞外生物活性物质，在医药、食品、农业及工业领域有着广泛的应用前景。利用芽孢杆菌生物活体或其代谢产物对农业有害生物进行抑制或杀灭，是植物病虫害防治的一个有效措施。
甲基营养型芽孢杆菌是一类好氧、产芽孢的杆状细菌，该菌具有对人畜无毒无害、环境友好、抗逆性强、繁殖速度快等特点，并能分泌多种活性物质。近年来，在甲基营养型芽孢杆菌防治植物病害、促进作物生长等方面开展了相关研究，有研究表明该类微生物对樱花根癌病菌、白蜡褐斑病菌、草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、亚麻立枯病菌、黄瓜枯萎病菌等具有较强的抑制作用，并能促进作物生长，可见甲基营养型芽孢杆菌在防治病害和促生等方面具有良好的应用前景。但有关同时具有防病、杀虫和促进植物生长功能的菌株未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种不但具有广谱的抗菌活性，还可以防治害虫并具备促进农作物生长的基营养型芽孢杆菌BAM-6及其应用。
本发明采用如下技术方案：
一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BAM-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 20129，保藏日期为2020年6月23日。
进一步的，其能够防病治病、杀虫且促进农作物生长。
进一步的，其能够防治农作物气传真菌病害及土传真菌病害。
进一步的，所述农作物气传病原真菌包括灰霉病菌、轮纹病菌、黑斑病菌、早疫病菌。所述农作物土传真菌包括立枯病菌、枯萎病菌、干腐病菌、黄萎病菌、环腐病菌和根腐病菌。
进一步的，其能够防治同翅目害虫和鞘翅目幼虫。
进一步的，其能够防治蚜虫、飞虱、粉虱和蛴螬。
一种上述甲基营养型芽孢杆菌BAM-6在防治灰霉病、轮纹病、黑斑病、早疫病、炭疽病、立枯病、枯萎病、干腐病菌、黄萎病、环腐病菌或根腐病中的应用。
一种上述甲基营养型芽孢杆菌BAM-6在制备生防制剂或生物肥料中的应用。
进一步的，所述生防制剂或生物肥料中包含甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的菌体和/或其代谢产物。
一种杀虫剂，其活性成分为甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的菌体和/或其代谢产物。
一种种衣剂或种子处理剂，其活性成分为甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的菌体和/或其代谢产物。
一种种子处理的方法，利用甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的菌体和/或其代谢产物对种子进行包衣处理。
本发明的有益效果在于：本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌BAM-6具有广谱抗菌性，对灰霉病菌、霜霉病菌、早疫病菌、枯萎病菌、环腐病菌等多种植物病害均具有明显的抑制效果；同时可以有效杀灭蚜虫、飞虱、粉虱等同翅目害虫、蛴螬等鞘翅目地下害虫。并具有促进植物生长的作用，增加产量，在开发成生物肥料、生物农药、生物种衣剂等方面具有良好的应用前景。本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌产芽孢、抗逆能力强，在可加工性及环境适应性等方面具有开发成微生物制剂的优势；与化学制剂相比，以该菌株研制的生物制剂具有更安全、环保，其制备和使用过程无污染、无公害、对环境友好，为新的生防微生物资源的开发利用奠定基础。
附图说明
图1为甲基营养型芽孢杆菌BAM-6在 LB 固体培养基上生长的菌落形态图。
图2为甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的16S rDNA同源序列比对分析构建的系统发育树。
具体实施方式
以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
实施例 1 甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的分离与筛选
（1）取土样：选择长势良好的马铃薯地块（贵州），取健康马铃薯植株的根际，铲去表土层2-3 cm，取马铃薯根际土壤20~50g；装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
（2）菌株分离和纯化：在PB培养基上用平板稀释法对土壤样品进行分离。具体操作如下：准确称取10 g土壤样品，加入到装有玻璃珠的90 mL 0.9%生理盐水锥形瓶中，180r/min摇床振荡30min，使土样分布均匀制成土壤悬液，浓度为 10-1；依次稀释到浓度为10-5、10-6、10-7。分别在80℃恒温水浴30 min，各取 100 µL 稀释液涂布PB平板，平板于30 ℃恒温培养箱倒置培养48 h。挑取不同形态的单菌落，用芽孢染色进行鉴定，芽孢杆菌用划线法纯化后转接至PB培养基试管斜面，30 ℃培养48 h后，4 ℃冰箱保存备用。
（3）防病杀虫作用菌株的筛选
具有防病作用菌株的初筛：以马铃薯病原真菌接骨木镰孢菌为指示菌，采用平板对峙法测定不同菌株对接骨木镰孢菌生长的抑制作用。
具体操作方法如下：将直径为8.0mm的病原真菌菌饼倒置于PDA培养基平板的中央，26℃培养箱培养2d后在半径50mm的圆周上等距离接种拮抗菌，培养4d后根据各筛选菌菌落边缘与病原真菌菌落边缘之间的抑菌带宽度确定拮抗程度，保留效果优良的菌株。每个处理重复3次。
具有防病作用菌株的复筛：采用平板对峙法，将初筛所得的拮抗菌采用液体培养后，发酵液以转速12000r/min离心10min去菌体，上清液用0.22μm无菌滤膜过滤制备无菌发酵滤液。在制备好的病原真菌平板上用灭菌打孔器打孔，每孔加入100μL拮抗菌的无菌滤液，病原真菌筛选板26℃下培养2～3d，采用十字交叉法测量抑菌圈直径并计算平均抑制率，筛选出对接骨木镰孢菌拮抗作用较强的菌株。
杀虫作用菌株的筛选：将复筛出的菌株发酵培养后，对其进行适当稀释，制成稀释液。取适量长度的蚕豆茎叶放入锥形瓶中。对活蚜虫及所在茎叶喷施适量稀释液后放入锥形瓶内，瓶口用薄纱布覆盖并用橡皮筋固定。2 d后，对蚜虫进行数量统计，筛选出杀虫效果较好的菌株。将对病原真菌与蚜虫抑制效果最强的菌株（实验室编号为JJYYX1）命名为BAM-6，并对该菌株进行了-80℃冷冻保藏。
实施例 2 甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的鉴定
形态特征和生理生化实验：依据《常见细菌系统鉴定手册》中的实验方法，对筛选得到菌株BAM-6 进行形态学及生理生化鉴定。如图1所示，该菌株在 PB 培养基平板形成的单菌落呈乳白色，不透明、近圆形、前期边缘整齐后期不规则呈褶皱状凸起，干燥易挑取。挑取培养 48 h 菌落进行革兰氏染色后，革兰氏染色阳性；光学显微镜 100 倍油镜下观察，菌株为杆菌，产芽孢，芽孢中生，呈椭圆形。其生理生化鉴定指标如表1所示。
表1 菌株BAM-6的生理生化特征
Figure 145642DEST_PATH_IMAGE001
。
注：“+”为阳性；“－”为阴性。
16S rDNA 序列分析：提取菌株BAM-6的总基因组DNA为模板扩增其16S rDNA序列。采用通用引物27F/1492R扩增目的片段，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用双向测序方法进行基因测序。测序结果通过GenBank数据库进行BlAST进行序列同源性比对，并利用MEGA软件构建系统发育树，如图2所示。分析结果显示，该菌株与甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）的相似性达 99.9%，且在系统发育树上亲缘关系最近。
结合形态特征、生理生化试验及16S rDNA同源序列比对分析结果，确定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophilus）。送菌株至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 20129。保藏日期为2020年6月23日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
实施例 3甲基营养型芽孢杆菌 BAM-6 的抑菌谱测定
选取常见植物真菌病害病原菌如：马铃薯干腐病菌、马铃薯早疫病菌、马铃薯枯萎病菌、马铃薯环腐病菌、梨黑斑病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌、番茄根腐病菌、黄瓜灰霉菌、棉花枯萎病菌、葡萄白腐病菌、葡萄灰霉病菌、苹果轮纹病菌、烟草赤星病菌等多种植物病原真菌为靶标，采用平板对峙法测定菌株BAM-6的抑菌谱。菌株 BAM-6 对所试 14种植物真菌病害均有较强的拮抗作用，其中对马铃薯干腐病菌的抑制作用最强，抑菌圈直径可达30.15mm，其次为枯萎病菌，抑菌圈达29.28mm。
表2 甲基营养型芽孢杆菌 BAM-6 对不同植物病原真菌的抑制作用
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例 4 甲基营养型芽孢杆菌BAM-6对马铃薯干腐病的防病效果
将甲基营养型芽孢杆菌BAM-6无菌发酵液稀释，设原液、20倍稀释夜、50倍稀释液三个处理，以噻菌灵和无菌水作为对照。
选取大小一致、无病虫感染的马铃薯块茎（马铃薯品种为费乌瑞它），清洗表面杂物，1% NaClO 表面消毒5 min，无菌水冲洗，再用75%乙醇消毒。在马铃薯的表面均匀打3个3mm深、直径3 mm的孔。
将消毒处理后马铃薯块分别置于无菌发酵液和对照中浸泡 10 min，取出晾干。每个打孔部位喷施 50 μL 孢子浓度为 105 CFU/m L的马铃薯干腐病菌的孢子悬浮液。用塑料袋包装后装入纸箱中于20±2℃、湿度55%~60%条件下贮藏， 每个处理40个薯块，重复3次。处理60d后于接种处沿与块茎表面垂直的方向纵向切开块茎伤口，测定发病率。
发病率（%）=（处理薯发病点数/处理的薯块总点数）×100
防治效果（%）=（对照发病率一处理的发病率）÷对照发病率×100
表 3 甲基营养型芽孢杆菌 BAM-6对马铃薯干腐病的室内防病效果
Figure 187416DEST_PATH_IMAGE003
。
从表3可知，拮抗菌BAM-6制剂对马铃薯干腐病有很好的防治效果，使用发酵原液对马铃薯干腐病的防治效果为85.47%。
实施例 5 甲基营养型芽孢杆菌BAM-6对蚜虫的防治效果
室内毒力测定：将甲基营养型芽孢杆菌BAM-6 进行发酵培养，发酵液稀释成10倍、20倍、30倍、50倍液，以清水处理作对照。豆蚜来自河北省科学院生物所蚜虫培养室。每个浓度下供试蚜虫50头，3次重复，用毛笔头挑50头年龄大小相近的蚜虫放在准备好的培养皿上饥饿4h，将等重的蚕豆茎浸泡在粗提物水溶液10min后用滤纸吸干水分，取出放在垫有滤纸的培养皿后，加入2mL去离子水保湿，再将平皿用保鲜膜覆盖，扎孔，每12h加1mL水、换蚕豆茎，于25℃培养箱培养过夜，记录蚜虫的死亡头数，计算不同稀释倍数下蚜虫的死亡率。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
测定蚜虫的死亡率：蚕豆蚜处理过夜后，用毛笔头触碰蚜虫，若蚜虫不动则视为死亡，统计并记录死亡的蚜虫头数由表4实施数据结果可以看出，甲基营养型芽孢杆菌BAM-6对蚜虫有良好的防治作用。发酵原液对蚕豆蚜的防治效果为100.00%，稀释30倍对蚜虫的防治效果70%以上。
表 4 甲基营养型芽孢杆菌BAM-6对蚕豆蚜的防治效果
Figure 891454DEST_PATH_IMAGE005
。
实施例 6 甲基营养型芽孢杆菌BAM-6发酵液对蛴螬的灭杀作用
将甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的发酵液调配成5×1010cfu/L、1×109cfu/L、5×108cfu/L浓度，配置药土。采用药土法，选取虫体大小一致的白星花金龟三龄幼虫蛴螬。用碎花生作为食料，将容量4L的塑料桶作容器，每桶放置混合均匀药土2L，并加入适量等量的食料拌匀。每处理试虫数量为15头，重复3次。对照组为NB培养液拌土，接虫后置于室内常温培养，每隔8h观察一次。
表5 BAM-6发酵液对蛴螬的灭杀作用
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
通过表5所示结果可知，菌株BAM-6的发酵液浓度越高对蛴螬的灭杀作用越强，同一浓度下累计死亡率随时间的延长而增加，对照组对蛴螬并无影响，表明菌株BAM-6对蛴螬有很强杀灭作用。
种衣剂或拌种剂是防治种传、土传病害及地下害虫最简便、经济有效的途经，但目前种衣剂多以中高毒化学药剂为主，药剂在土壤中的毒性残留时间长，造成土壤、水源污染，土壤微生态平衡破坏、有害生物产生抗药性等问题。实施例3、实施例5及实施例6的结果表明，菌株BAM-6具有良好杀虫防病作用，而且防病作用中具有较宽的抑菌谱，因此，利用其菌体及其活性代谢产物为主要成分可制备种衣剂或拌种剂，具有良好的应用前景。
实施例 7 甲基营养型芽孢杆菌BAM-6 对黄瓜的促生作用
菌株BAM-6的促生应用在温室中进行研究，将表面消毒的黄瓜种子通过人工气候箱进行催芽至1cm左右，挑选长势一致的黄瓜苗播种，种植土以营养土和蛭石1∶1混合，种植盆的上口径11cm，下口径10cm，深8.5cm，植土用量占盆的4/5，每盆种植3粒，共设5组处理。播种后将BAM-6的发酵液分别稀释20倍、50倍、100倍、200倍和500倍每盆灌根20ml，以去离子水作为对照组，出苗30d时，测其株高、茎粗、鲜重、干重等形态指标，并记录结果。
表6 BAM-6发酵液对黄瓜植株形态指标的影响
Figure 739193DEST_PATH_IMAGE007
。
通过表6实施结果数据可见，甲基营养型芽孢杆菌BAM-6具有促进植物生长的作用。其发酵液100倍、200倍和500倍稀释液对黄瓜植株均有显著的促生作用，处理组的株高、茎粗等指标显著高于对照组，株高分别提高17.5%、28.8%和21.7%，茎粗分别提高11.7%、14.5%和12.1%；200倍稀释液处理组茎叶和根的鲜重最大，同时其植株干重也显著高于对照组。
采用同样的方法，进行盆栽实验，将该菌株发酵液应用于马铃薯、番茄、小麦、玉米等作物，实验结果表明该菌株发酵液对这几种作物均有显著的促生作用。
综上，本发明提供的保藏号为CGMCC No. 20129 的甲基营养型芽孢杆菌BAM-6对多种植物病原真菌及蚜虫、蛴螬具有良好的防治作用，同时还能够促进植物的生长发育，从而达到提高产量及减少产品农药残留的目的，在开发为农用生物制剂方面具有良好的应用前景。

Claims (7)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BAM-6，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.20129。
2.一种如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌BAM-6在防治灰霉病菌、轮纹病菌、黑斑病菌、早疫病菌、炭疽病菌、枯萎病菌、干腐病菌、环腐病菌或根腐病菌中的应用。
3.一种如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌BAM-6在制备生防制剂或生物肥料中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生防制剂或生物肥料中包含甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的菌体和/或其发酵液。
5.一种杀虫剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的菌体和/或其发酵液。
6.一种种衣剂或种子处理剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的菌体和/或其发酵液。
7.一种种子处理方法，其特征在于，利用权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌BAM-6的菌体和/或其发酵液对种子进行包衣处理。
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