CN107794239B - 一种东洋芽孢杆菌菌株以及菌剂制备方法和应用 - Google Patents

一种东洋芽孢杆菌菌株以及菌剂制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种东洋芽孢杆菌菌株以及菌剂制备方法和应用，东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No.10033，所述东洋芽孢杆菌属于真细菌界，后壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂，是以所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018经斜面培养、种子培养和发酵制备得到的菌剂。制备方法包括斜面培养、种子培养、发酵和菌剂制备步骤；应用为所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂用于制备防治烟草根结线虫病和烟草黑胫病药物中的应用。所述东洋芽孢杆菌为活性成分的制剂对烟草根结线虫具有显著的毒杀作用。

Description

一种东洋芽孢杆菌菌株以及菌剂制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物分离培养技术领域，具体涉及一种东洋芽孢杆菌菌株以及菌剂制备方法和应用。
背景技术
烟草是重要的经济作物，其生长过程受到很多病害的危害，其中烟草根结线虫病和黑胫病是两种重要的土传病害，造成烟草的减产或绝收。根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类植物内寄生线虫，无严格的宿主特异性，能侵染多种农作物，严重危害农业生产，每年造成全球约1000亿美元的损失。其在全世界广泛分布，寄主范围广泛，它能使细菌和真菌更易于侵染植物，是诱发植物病害的重要原因之一。随着烟草生产的发展，连作面积的增加，线虫病危害日趋严重，是许多国家烟草生产的主要限制因素之一，在我国各大烟区造成了严重危害。烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)是一种兼性寄生菌，会诱发烟草黑胫病(Tobacco Black Shank)，对烟草具有毁灭性危害。烟草作为其寄主植物，在其团棵期到旺长期间发病达到高峰期，主要危害烟株根部和茎基部。另外，土地多年连作、与烟草青枯病、根结线虫病混合发生，将加重危害烟株健康，导致烟叶减产和烟叶质量降低。
烟草黑胫病和根结线虫病的防治目前多采用化学防治、轮作及抗病品种，但效果均不太理想，且存在诸多弊端。如目前使用的化学杀线虫剂多为剧毒或高毒、高残留农药，对土壤微生物、植物、水源和大气层带来严重污染或破坏，同时病菌和线虫抗药性问题也日益突出，而且药物在植物体内残留会间接对人类造成危害。因此急需开发对环境友好，对人畜无毒的防治线虫病害的微生物制剂。
植物寄生线虫生防细菌的研究是利用环境中的拮抗细菌来防治植物病虫害的有效途径，也是最近几年兴起的新的研究热点，而筛选高效和活性稳定的拮抗菌株则是保证生物防治获得成功的先决条件。目前主要研究的生防细菌有植物根围促生细菌（PGPR）、穿刺巴氏杆菌（Pasteuria penetrans）、假单孢杆菌（Pseudomonas spp.）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。同时，烟草黑胫病的生物防治资源也十分丰富，研究发现许多芽孢杆菌作为拮抗菌对烟草黑胫病具有良好的防治效果。国内外众多研究表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等通过抗生、溶菌、竞争、重寄生等作用机制对烟草黑胫病具有良好的防治效果。
但是据可查资料，能够同时具备防治烟草黑胫病和根结线虫病功能的东洋芽孢杆菌及其制剂的制备和利用一直未见报道，本发明为防治烟草中的这两种病害提供生防资源和方法。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种东洋芽孢杆菌菌株；第二目的在于提供所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂；第三目的在于提供所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂的制备方法；第四目的在于提供所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂的应用。
除非另有说明外，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。
本发明的第一目的是这样实现的，东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No.10033，所述东洋芽孢杆菌属于真细菌界，后壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属；具备防治烟草黑胫病和根结线虫病的能力。
——东洋芽孢杆菌SB3018的获得与鉴定
（1）东洋芽孢杆菌SB3018的获得与鉴定
本发明所述的东洋芽孢杆菌，是从烟草叶片中分离得到。烟草样品采自云南省玉溪市研和镇，采集长势良好无病烟株旺长期叶片，洗净后随即称取叶片0.4g，在70%酒精中振荡浸泡1min，再用有效氯含量1%的次氯酸钠溶液振荡浸泡1min后，用无菌水冲洗4次。消毒后的组织与灭菌钢珠一并放入2ml灭菌离心管，加入600ul无菌水，用QIAGEN高通量组织研磨器研磨3min，频率为30r/s。研磨后的母液采用梯度稀释法稀释后涂布平板，各单操作分别重复四次，在28℃下黑暗培养48h。挑取单菌落，重新于平板上划线纯化保存，其中长势旺盛者，定名为SB3018菌株。
所用培养基配方：酵母浸出汁3.0g，牛肉浸膏1.0g，大豆蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，琼脂17.0g，蒸馏水1000mL，pH：7.0。
对上述分离的菌株SB3018，通过生物学特性观察，进行进一步的形态鉴定，方法如下：
观察菌落的形态、大小、凹凸度、边缘，革兰氏染色，生理生化特征测试具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》。该菌16S rDNA序列扩增引物采用F27/R1492，扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
以上实验结果记录如下：
A、形态特征：菌体形状为杆状，菌体平均大小为1.0~1.3um×2.8~4.2um，革兰氏染色为阳性，内生芽孢，菌体两端钝圆，有鞭毛，无荚膜，多成短链状排列。
B、培养特征：在营养琼脂平板上生长迅速，菌落近圆形、白色、边缘不整齐、表面湿润粗糙、稍突起、不透明，菌落直径为1.5~3.0 mm；培养7d 后，形成扁平状菌苔，形状不规则，表面粗糙，颜色灰白，无光泽。
C、生理生化特性：M.R试验、V-P试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用为阳性，能水解淀粉、明胶、酪素；接触酶、卵磷脂酶、酪氨酸水解试验为阳性，能还原硝酸盐，能利用葡萄糖、松二糖产酸。苯丙氨酸脱氨酶为阴性，不能利用果糖、阿拉伯糖、甘露醇、纤维二糖产酸，能耐受5％（w/V）的NaCl溶液，不耐受7％（w/V）的NaCl溶液。
D、菌株的稳定性：该菌生长温度范围在10~45℃，最适宜生长温度为27~34℃，生长pH值在5~9，最适宜pH值为7。
E、16S rDNA序列分析：对该菌株进行16S rDNA序列测定，得到了长度为1516bp的序列。SB3018菌株16S rDNA序列与芽孢杆菌属的菌株相似性达到99％，结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）。
本发明所述的SB3018菌株其16S rDNA序列如Seq No.1所示。
（2）东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株SB3018为东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）的一个株系，命名为SB3018，于2014年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），其保藏编号为CGMCC No.10033。
本发明的第二目的是这样实现的，是以所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018经斜面培养、种子培养和发酵制备得到的菌剂。
本发明的第三目的是这样实现的，包括斜面培养、种子培养、发酵和菌剂制备步骤，具体包括：
A、斜面培养：将东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018接种到斜面培养基上，在温度为28~30℃下培养48h，得斜面菌种；
B、种子培养：将斜面菌种接种到液体培养基中，在温度为28~32℃下培养18~24h，得液体发酵种子；
C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基体积3~5%的量接种入发酵罐，在28~34℃下培养36~48h，搅拌速度为120~150rpm，通气量5~10%，得到东洋芽孢杆菌SB3018发酵液；
D、菌剂制备：在发酵液中添加0.16~0.6%的活性剂充分混匀，得到目标物菌剂。
本发明的第四目的是这样实现的，所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂用于制备防治烟草根结线虫病和烟草黑胫病药物中的应用。
本发明所述东洋芽孢杆菌和以所述东洋芽孢杆菌为活性成分的制剂可应用于烟草根结线虫病和烟草黑胫病的防治，具有以下优点：
1、本发明所述东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018是一种高效生防细菌，以所述东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018为活性成分的制剂对烟草根结线虫具有显著的毒杀作用，其液体制剂100倍稀释液对根结线虫的毒杀死亡率为100%。
2、本发明所述东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018是一种高效生防细菌，以所述东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018为活性成分的制剂对烟草黑胫病具有显著的防治作用，其液体制剂按每株烟苗施用5ml，对烟草黑胫病的防效可达80.5%。
3、本发明所述以东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018为活性成分的制剂的制备方法简单易行，合理有效，成本低廉，有利于该制剂的工业化生产和应用普及。
4、本发明所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018及以东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018为活性成分的制剂对人畜无毒，并且具有很强的环境适应性和环境友好性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No.10033，所述东洋芽孢杆菌属于真细菌界，后壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。
分类命名：东洋芽孢杆菌SB3018
拉丁文名：Bacillus toyonensis SB3018
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
地址：中国北京中国科学院微生物研究所
保藏日期：2014年11月21日
保藏编号：CGMCC NO：10033。
本发明所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂，是以所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018经斜面培养、种子培养和发酵制备得到的菌剂。
本发明所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂的制备方法，包括斜面培养、种子培养、发酵和菌剂制备步骤，具体包括：
A、斜面培养：将东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018接种到斜面培养基上，在温度为28~30℃下培养48h，得斜面菌种；
B、种子培养：将斜面菌种接种到液体培养基中，在温度为28~32℃下培养18~24h，得液体发酵种子；
C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基体积3~5%的量接种入发酵罐，在28~34℃下培养36~48h，搅拌速度为120~150rpm，通气量5~10%，得到东洋芽孢杆菌SB3018发酵液；
D、菌剂制备：在发酵液中添加0.16~0.6%的活性剂充分混匀，得到目标物菌剂。
A步骤中所述的斜面培养基的成分为：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏4 g/L，NaCl4 g/L，琼脂粉15 g/L。
B步骤中所述的液体培养基的成分为：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏4 g/L，NaCl4 g/L。
C步骤中所述的发酵培养基的成分为：玉米粉12g/L，葡萄糖6g/L，豆饼粉15 g/L，CaCO3 5 g/L，(NH4）2SO4g/L，K2HPO4 0.4 g/L，其余为水，pH值为6.5~7.5。
本发明所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂的应用为所述的东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）SB3018的菌剂用于制备防治烟草根结线虫病和烟草黑胫病药物中的应用。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
本发明提供的SB3018的鉴定方法。
SB3018的16SrDNA基因的PCR扩增、测序由上海英骏生物技术有限公司完成。根据测序结果构建系统发育树。系统发育表明菌株与Bacillus sp.的进化距离最近，结合形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）。
实施例2
SB3018菌液体制剂对根结线虫的毒杀作用
根结线虫的分离采用贝曼漏斗法进行，获得根结线虫的二龄幼虫。将分离的根结线虫添加到东洋芽孢杆菌SB3018菌液体制剂的100倍稀释液中，以等量的水为对照，室温放置1h观测线虫存活和死亡数量。结果表明，在对照中，根结线虫二龄幼虫的死亡率是4.41％，而东洋芽孢杆菌SB3018液体制剂的100倍稀释液的处理根结线虫二龄幼虫的死亡率达到了100％，由此可见，以东洋芽孢杆菌SB3018为活性成分的液体制剂对根结线虫二龄幼虫具有强烈的毒杀效果。
实施例3
SB3018菌液体制剂对烟草根结线虫的防治作用
烤烟品种为红花大金元，根结线虫接种方式为病土接种，烤烟移栽时每株烟施用东洋芽孢杆菌SB3018制剂5ml，以不施用制剂为对照。移栽后60天挖根调查烟草根结线虫病的病情指数。经过东洋芽孢杆菌SB3018制剂处理的烟草根结线虫病情指数为25.3，而没有施用该制剂的空白对照病情指数达到了63.5，由此可见，以东洋芽孢杆菌SB3018为活性成分的制剂对烟草根结线虫病的防治效果为60.2％。
实施例4
SB3018菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用
运用对峙培养法，用灭菌的打孔器(直径5mm)将烟草黑胫病菌接种到PDA平板培养基的中心处，在烟草黑胫病菌块平行两侧离中心点30mm处平行两侧划两条短线(用接种环沾取少量菌液后，在培养基上划两道，长度约0.5cm)，此为处理组，对照组采用不含候选菌的空白PDA培养液。然后倒置放在28℃恒温培养箱中培养4天，观察黑胫病菌周围有无抑制带，并利用十字交叉法测量其抑菌直径大小。对照不接种拮抗菌。SB3018菌株对烟草黑胫病抑菌效果最好，其抑菌直径达到48.3mm，相对抑制率达到75.2％，具有较好的抑菌效果。
实施例5
SB3018菌液体制剂对烟草黑胫病的防治作用
取三株生长到5-6片真叶的红花大金元烟草植株盆栽，盆栽用土预先接种烟草黑胫病病菌的菌谷，接种量为0.1%（m/m），SB3018菌液体制剂稀释10倍后，对盆栽红花大金元烟草植株进行灌根处理，每株灌根50ml。每个处理20株。于施药处理后14天调查病情指数和相对防治效果。盆栽试验结果表明，在施药处理14天后，SB3018菌液体制剂具有较好的防治效果，SB3018菌剂处理的烟株病情指数为13.32，空白对照达到68.41，防治效果达到80.5％。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种东洋芽孢杆菌菌株及菌剂以及菌剂制备方法和应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1516
<212> DNA
<213> 东洋芽孢杆菌SB3018 16S rDNA序列
<400> 1
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gtcttatggg caggttaccc acgtgttact cacccgcccg ccgctaactt cttgagagca 1440
agctctcaat ccattcgctc gacttgcatg tattaggcac gccgccagcg ttcatcctga 1500
gccatgatca aactct 1516

Claims (6)

1.一种东洋芽孢杆菌Bacillus toyonensis SB3018菌株，所述SB3018菌株的16S rDNA序列如Seq No.1所示，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No.10033，所述东洋芽孢杆菌属于真细菌界，后壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。
2.一种根据权利要求1所述东洋芽孢杆菌Bacillus toyonensis SB3018菌株制备的菌剂，其特征在于制备方法包括斜面培养、种子培养、发酵和菌剂制备步骤，具体包括：
A、斜面培养：将东洋芽孢杆菌Bacillus toyonensis SB3018菌株接种到斜面培养基上，在温度为28~30℃下培养48h，得斜面菌种；
B、种子培养：将斜面菌种接种到液体培养基中，在温度为28~32℃下培养18~24h，得液体发酵种子；
C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基体积3~5%的量接种入发酵罐，在28~34℃下培养36~48h，搅拌速度为120~150rpm，通气量5~10%，得到东洋芽孢杆菌SB3018发酵液；
D、菌剂制备：在发酵液中添加0.16~0.6%的活性剂充分混匀，得到目标物菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于A步骤中所述斜面培养基的成分为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏4g/L，NaCl 4g/L，琼脂粉15g/L。
4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于B步骤中所述液体培养基的成分为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏4g/L，NaCl 4g/L。
5.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于C步骤中所述发酵培养基的成分为：玉米粉12g/L，葡萄糖6g/L，豆饼粉15g/L，CaCO3 5g/L，(NH4)2SO4g/L，K2HPO4 0.4g/L，其余为水，pH值为6.5~7.5。
6.一种根据权利要求2所述菌剂在制备防治烟草根结线虫病和烟草黑胫病药物中的应用。
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