CN109136123B - 一株线虫生防菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株线虫生防菌及其应用，属于微生物农药技术领域。生防细菌为花椒内生芽孢杆菌(Bacillus endozanthoxylicus)1404菌株，1404菌株已于2018年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号为CCTCCNO:M2018368。本发明的微生物菌体及其代谢产物，能与农药常规吸附载体和助剂混合制成1404菌剂。1404菌株在制备用于防治根结线虫病的菌剂中的应用。本发明的有益效果在于：利用1404菌株制备的菌剂，能高效防治番茄、黄瓜、烟草等多种作物根结线虫病，具有使用成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点。

Description

一株线虫生防菌及其应用
技术领域：
本发明涉及一株线虫生防菌及其应用，属微生物农药技术领域。
背景技术：
根结线虫以二龄幼虫侵染作物根系并诱导植物组织线虫根瘤，根瘤的形成阻碍了植物从土壤中吸收营养和水分；此外，根结线虫的侵染造成伤口和降低植物抗性，有利于土壤中其它植物病原菌的侵染，因此容易导致根结线虫病与其它植物病害的复合发生、造成更大的损失(Bird&Kaloshian，2003)。作物病原线虫引起的病害已成为农业生产中的第二大类病害。全球每年因作物病原线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元(Abad et al.,2008)，其中危害最重、造成损失最大的是根结线虫，根结线虫克危害粮食、油料、蔬菜、烟草、水果等3000多种植物。
蔬菜是我国第一大经济作物和最大的出口创汇农产品。据不完全统计，2008年全国设施蔬菜面积已达5020万亩，面积仍在不断增加。由于设施大棚高温、多年连茬等因素，近年来大棚蔬菜根结线虫危害猖獗失控，给蔬菜生产带来严重损失。发病地块一般减产20％以上，严重的达75％甚至绝收。据估算，我国蔬菜每年因根结线虫危害造成的损失超过50亿元。烟草是中国多个省份经济的重要支柱产业，2012年全国烟草种植面积2118万亩。目前，除东北外，烟草根结线虫在全国各主要产烟区都有发生，在云、贵、川等西南省份的山地烟区尤为严重，一般发病田减产3-4成，重病田减产6-7成。
长期以来，对作物病原线虫的防治主要依靠化学农药，但由于化学杀线虫剂高毒性，造成农产品和生态污染问题非常突出。根据保护臭氧层的“蒙特利尔议定书”国际条约，发达国家已于2005年全面禁用使用最广泛的化学杀线虫剂溴甲烷，发展中国家将于2015年全面禁用(Ristaino & Thomas,1998)。目前，灭线磷、溴甲烷、涕灭威等化学杀线虫剂在国内几乎都被禁用或限制使用。由此导致可选用的化学杀线虫剂种类更少，加剧了线虫防治的困难。
利用生防微生物研发的线虫生物农药在国内外登记的品种很多，在线虫病害防控中发挥巨大作用。在2015年国家“减农药、减化肥”政策倡导下，发掘新的生防资源并研发高效生物农药对根结线虫病的防治尤为重要。花椒内生芽孢杆菌(Bacillusendozanthoxylicus)1404菌株是本发明人2017年报道的一细菌新物种(Ma et al.,2017)。本发明人在近期的研究中首次发现1404菌株对根结线虫二龄幼虫有较强的致死活性，该细菌在番茄、黄瓜、烟草等作物上根结线虫病的防治中有着重要的应用价值，而该细菌的杀线虫活性及其在根结线虫病中的应用未见报道。
主要参考文献：
Abad P,Gouzy J,Aury JM.et al.2008.Genome sequence of the metazoanplant-parasitic nematodeMeloidogyne incognita.Nat.Biotechnol.26(8):909-15.
Bird DM and Kaloshian I.2003.Are roots special？Nematodes have theirsay.Physiol.Mol.Plant Pathol.62:115-123.
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发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一株线虫生防菌及其应用。
本发明具体是这样实现的：
本发明人采用细菌传统分离方法，从采自甘肃省陇南市的辣椒叶片中获得了一株花椒内生芽孢杆菌(Bacillus endozanthoxylicus)1404菌株，1404菌株已于2018年6月14日保存于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号为CCTCCNO:M2018368。
1404菌株为革兰氏阳性菌，在牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂17g,用无菌水定容至1000ml,pH 7.2)上，32℃下培养2天，菌落淡黄色，扁平，边缘稍不规则；细胞圆杆状，宽1.3-1.8μm，长1.7-3.2μm。该菌株在15-45℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH 6.0-10.0的范围内可以生长，最适生长pH为6.0-7.0；在牛肉膏蛋白胨培养基上耐受NaCl的最高浓度为5％(W/V)。利用通用引物27f和1492r经PCR扩增1404菌株的16S rRNA基因获得的序列在GeneBank公共数据库的序列号为KX865139，此序列是鉴定该菌株的主要分子特征依据。
本发明的1404菌株在制备用于防治根结线虫病的菌剂中的应用。
本发明的微生物菌剂，按微生物发酵常规方法及微生物菌剂制备常规方法制成。
本发明的有益效果在于：
1、利用1404菌株制备的菌剂对作物根结线虫病的防效达70％以上。
2、利用1404菌株制备的菌剂，能高效防治作物根结线虫病，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的详述。实施例中的微生物菌剂，按微生物发酵常规方法及微生物菌剂制备常规方法制成。
1.本发明中1404菌株的培养及菌剂制备
1404菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，32℃下培养2天后获得斜面种子。
1404菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，32℃，180rpm条件下摇床培养3天获得液体种子。
1404菌株发酵罐大量培养：将液体种子按3％(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时。
1404菌剂制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成。需保证1404菌株在菌剂中的活菌数含量在2×109个/克以上。
2.1404菌剂防治番茄根结线虫病的田间试验
试验地点：云南省玉溪市化念镇蔬菜大棚。
试验作物：番茄(品种：粉都-80)。
供试药剂：1404菌剂，活菌数含量为2.5×109个/克，按本发明上述方法制备；10％噻唑膦颗粒剂，山东省联合农药工业有限公司生产。
试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复120株番茄。
处理1：1404菌剂50公斤/亩。整地时，将菌剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中。
处理2：10％噻唑膦颗粒剂2公斤/亩。整地时，将颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中。
处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照。
调查和统计方法：移栽180天后调查植株根瘤病级指数(0级：无根瘤；1级：1-20％的根系有根瘤；2级：21-40％的根系有根瘤；3级：41-60％的根系有根瘤；4级：61-80％的根系有根瘤；5级：81-100％的根系有根瘤)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100,n1-n5分别代表根瘤病级指数1-5级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。
试验结果：表1显示每亩施用50公斤1404菌剂对番茄根结线虫的防效高达90.17％，高于每亩施用2公斤10％噻唑膦颗粒剂的防效(81.68％)。
表1. 1404菌剂对番茄根结线虫的防效
Figure BDA0001739440510000041
3. 1404菌剂防治黄瓜根结线虫的田间试验
试验地点：云南省玉溪市化念镇蔬菜大棚。
试验作物：黄瓜(品种：中农203)。
供试药剂：1404菌剂，活菌数含量为2.5×109个/克，按本发明上述方法制备；10％噻唑膦颗粒剂，山东省联合农药工业有限公司生产。
试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复120株黄瓜。
处理1：1404菌剂50公斤/亩。整地时，将菌剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中。
处理2：10％噻唑膦颗粒剂2公斤/亩。整地时，将颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中。
处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照。
调查和统计方法：移栽180天后调查植株根瘤病级指数(0级：无根瘤；1级：1-20％的根系有根瘤；2级：21-40％的根系有根瘤；3级：41-60％的根系有根瘤；4级：61-80％的根系有根瘤；5级：81-100％的根系有根瘤)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100,n1-n5分别代表根瘤病级指数1-5级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。
试验结果：表2显示每亩施用50公斤1404菌剂对黄瓜根结线虫病的防效高达88.66％，稍高于而每亩施用2公斤10％噻唑膦颗粒剂的防效(86.69％)。
表2. 1404菌剂对黄瓜根结线虫的防效
Figure BDA0001739440510000051
4. 1404菌剂防治烟草根结线虫的田间试验
试验地点：云南省玉溪市峨山县。
试验作物：烟草(品种：K326)。
供试药剂：1404菌剂，活菌数含量为2.5×109个/克，按本发明上述方法制备；10％噻唑膦颗粒剂，山东省联合农药工业有限公司生产。
试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复60株。
处理1：穴施1404菌剂，10克/株。
处理2：穴施10％噻唑膦颗粒剂，2.5克/株。
处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照。
调查和统计方法：120天后调查植株根瘤病级指数(0级：无根瘤；1级：1-20％的根系有根瘤；2级：21-40％的根系有根瘤；3级：41-60％的根系有根瘤；4级：61-80％的根系有根瘤；5级：81-100％的根系有根瘤)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100,n1-n5分别代表根瘤病级指数1-5级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别处理和对照的病情指数。
试验结果：表3显示每株穴施10克的1404菌剂，对烟草根结线虫的防效高达85.98％，稍高于每株穴施2.5克的10％噻唑膦颗粒剂的防效(83.42％)。
表3. 1404菌剂对烟草根结线虫的防效
Figure BDA0001739440510000061
实际应用表明：利用1404菌株制备的菌剂，不仅能高效防治番茄、黄瓜和烟草的根结线虫病，还具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。

Claims (1)

1.一株保藏号为CCTCC NO: M 2018368的花椒内生芽孢杆菌（Bacillus endozanthoxylicus）1404菌株在制备用于防治根结线虫病的菌剂中的应用。
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