CN108841764B - 一株生防细菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株生防细菌及其应用，属于微生物农药技术领域。生防细菌为植烟土壤鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium tabacisoli)h337菌株，h337菌株已于2018年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号为CCTCCNO:M2018370。本发明的微生物菌体及其代谢产物，能与农药常规吸附载体和助剂混合制成h337可湿性粉剂。h337菌株在制备用于防治烟草黑胫病和烟草根结线虫病的菌剂中的应用。本发明的有益效果在于：利用h337菌株制备的菌剂，能高效防治烟草黑胫病和烟草根结线虫病，具有使用成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点。

Description

一株生防细菌及其应用
技术领域:
本发明涉及一株生防细菌及其应用，属微生物农药技术领域。
背景技术:
烟草是云南、贵州等省份的重要支柱产业之一。由烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)侵染引起的黑胫病，以及由根结线虫(Meloidogyne spp.)侵染引起的线虫病是烤烟栽培中的两大主要土传病害。烟草黑胫病的发生面积遍布全世界各大烟区，在温带、亚热带和热带烟区发生较重，该病害在国内烟草常年严重发生，损失严重，已经成为制约烟草农业正常生产的重要因素(Wang et al.,2012)。烟草根结线虫病在世界范围内广泛发生，在热带亚热带烟区发生尤为严重，不仅造成烟株萎蔫黄化、发育迟缓甚至整株死亡，严重影响烟叶的产量和质量，成为近年来烟草病虫害防治的重点(宋辉等，2011)。
目前，对烟草黑胫病、烟草根结线虫病的防治仍然以化学防治为主，但生物防治因其独特的安全性而被重视。目前利用各种生防微生物控制烟草黑胫病、线虫病已被广泛报道(祝明亮等，2008；Huang et al.,2015)。在2015年国家“减农药、减化肥”政策倡导下，发掘新的生防资源并研发高效生物农药对烟草黑胫病、根结线虫病的防治也尤为重要。植烟土壤鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium tabacisoli)h337菌株是本发明人等2017年报道的一细菌新物种，(Zhou et al.,2017)。本发明人在近期的研究中首次发现植烟土壤鞘氨醇杆菌(S.tabacisoli)h337菌株对烟草疫霉菌的菌丝生长具有极强的抑菌活性，对根结线虫二龄幼虫也有较强的致死活性，该细菌在烟草黑胫病、烟草根结线虫病的防治中有着重要的应用价值，而该细菌的抗真菌活性、杀线虫活性及其在烟草土传病害防治中的应用未见报道。
主要参考文献:
Huang Y,et al.2015.Isolation and characterization of rhizospherebacteria active against Meloidogyne incognita,Phytophthora nicotianae and theroot knot-black shank complex in tobacco.Pest Management Science,71:415-422.
Wang H,et al.2012.A rapid microbioassay for discovery of antagonisticbacteria for Phytophthoraparasitica var.nicotianae.Phytopathology,102:267-271.
Zhou et al.2017.Sphingobacterium tabacisoli sp.nov.,isolated from atobacco field soil sample.International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology 67:4808-4813.
宋辉，等.烟草根结线虫病防治药剂的筛选研究.云南农业大学学报，2011，26(6)：740-748.
祝明亮，等.2008.烟草微生物学.科学出版社，pp.1-384.
发明内容:
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种生防细菌及其应用。
本发明具体是这样实现的：
本发明人采用细菌传统分离方法，从采自云南昆明的烤烟土壤中获得了一株植烟土壤鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium tabacisoli)h337菌株，h337菌株已于2018年6月14日保存于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号为CCTCCNO:M2018370。
S.tabacisoli h337菌株为革兰氏阴性菌，在ISP2培养基(酵母浸粉4g，麦芽浸膏10g，葡萄糖4g，琼脂20g，补水至1,000ml,pH 7.0)上，30℃下培养3天，菌落直径2-6mm，黄色，圆形，中间凸起；细胞圆杆状，宽0.4-0.6μm，长0.8-1.8μm，细胞不具游动性。该菌株在10-35℃的温度范围内生长，最适生长温度30℃；在pH 6.0-9.0的范围内可以生长，最适生长pH为7.0；在ISP2培养基上耐受NaCl的最高浓度为3％(W/V)。利用通用引物27f和1492r经PCR扩增h337菌株的16S rRNA基因获得的序列在GeneBank公共数据库的序列号为KX129934，此序列是鉴定该菌株的分子特征依据。h337菌株的主要脂肪酸为异式十五碳饱和脂肪酸，占31.8％，是鉴别该菌的化学特征依据。
本发明的h337菌株在制备用于防治烟草黑胫病和烟草根结线虫病的菌剂中的应用。
本发明的微生物菌剂，按微生物发酵常规方法及微生物菌剂制备常规方法制成。
本发明的有益效果在于：
1、利用h337菌株制备的菌剂对烟草黑胫病和烟草根结线虫病的防效达70％以上。
2、利用h337菌株制备的菌剂，能高效防治烟草黑胫病和烟草根结线虫病，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的详述。实施例中的微生物菌剂，按微生物发酵常规方法及微生物菌剂制备常规方法制成。
1.本发明中h337菌株的培养及菌剂制备
h337菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到ISP2培养基斜面上，30℃下培养2天后获得斜面种子。
h337菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的ISP2液体培养基中，30℃，180rpm条件下摇床培养3天获得液体种子。
h337菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(V/V)的比例接入发酵罐中的ISP2液体培养基中，在1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时。
h337可湿性粉剂的制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成。需保证h337菌株在菌剂中的活菌数含量在1×109个/克以上。
2.本发明菌剂对烟草黑胫病的防效试验
烟草疫霉菌(P.nicotianae)的培养：感病烟株采自云南省峨山县烟田，取病部组织并按常规方法进行表面消毒后接种在PDA培养基平板上，28℃下培养5天后挑起新鲜菌丝体接种于PDB(PDA不加琼脂)培养基中，28℃下，150rpm下摇床培养5天后备用。
供试药剂：h337可湿性粉剂，活菌数含量为2.5×109个/克，按本发明上述方法制备；58％甲霜灵锰锌，西安鼎盛生物化工有限公司生产。
育苗期使用方法：烤烟常规漂浮育苗时，取50g h337可湿性粉剂用300ml水稀释后与5kg育基质混匀；阳性对照用58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂10g与40g硅藻土的混合物取代h337可湿性粉剂；空白对照用50g硅藻土取代h337可湿性粉剂。待烟苗长至5-6片叶子时，在直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的每一花钵移栽一株烟苗，在烟根接种烟草疫霉菌培养液5ml，每处理三个重复，每重复5盆；肥水管理按常规方法进行。
移栽期使用方法：烤烟按常规漂浮育苗，待烟苗长至5-6片叶子时，用h337可湿性菌剂沾根，5克/株，然后移栽于直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的花钵中，在烟根接种烟草疫霉菌培养液5ml。阳性对照用58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂1g与4g硅藻土的混合物取代h337可湿性粉剂；空白对照用5g硅藻土取代h337可湿性粉剂。每处理三个重复，每重复5盆；肥水管理按常规方法进行。
成株期使用方法：烤烟按常规漂浮育苗，待烟苗长至5-6片叶子时，将烟苗移栽于直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的花钵中，1株/盆。移栽30天后，取5g h337可湿性粉剂稀释于200ml自来水中并浇灌烟根，同时在烟根接种烟草疫霉菌培养液5ml。阳性对照用58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂1g与4g硅藻土的混合物取代h337可湿性粉剂；空白对照用5g硅藻土取代h337可湿性粉剂。每处理三个重复，每重复5盆；肥水管理按常规方法进行。
防效计算：以上各处理的烟苗在温室内随机排列摆放，生长90天后统计各处理的烟草黑胫病的发病率，按GB/T23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》介绍的方法进行病级分类、计算病情指数和防效。
试验结果：从表1能够看出，h337可湿性粉剂在育苗期、移栽期和成株期使用对烟草黑胫病的防效分别为75.36％、81.43％和71.06％，防效均略高于化学农药58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂的相应处理；移栽期用5g h337可湿性粉剂沾根的防效最好。
表1 h337可湿性粉剂及对照化学农药不同使用方法时对烟草黑胫病的防效
Figure BDA0001739440690000041
3.本发明菌剂对烟草根结线虫病的防效试验
根结线虫(Meloidogyne sp.)二龄幼虫的制备：烟草根结线虫病根采自云南省耿马县烟田，在解剖镜下挑取根瘤上的卵块，用2％次氯酸钠处理2分钟以消解卵囊，收集卵粒，用无菌水漂洗3次，将卵粒悬液在28℃下孵化5天，然后用贝曼漏斗法收集二龄幼虫，并将线虫浓度调整到约1000条/毫升，4℃保存备用。
供试药剂：h337可湿性粉剂，活菌数含量为2.5×109个/克，按本发明上述方法制备；10％噻唑膦颗粒剂，山东省联合农药工业有限公司生产。
育苗期使用方法：烤烟常规漂浮育苗时，取50g h337可湿性粉剂用300ml水稀释后与5kg育基质混匀；阳性对照用10％噻唑膦颗粒剂10g与40g硅藻土的混合物取代h337可湿性粉剂；空白对照用50g硅藻土取代h337可湿性粉剂。待烟苗长至5-6片叶子时，在直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的每一花钵移栽一株烟苗，在烟根接种根结线虫二龄幼虫5ml，每处理三个重复，每重复5盆；肥水管理按常规方法进行。
移栽期使用方法：烤烟按常规漂浮育苗，待烟苗长至5-6片叶子时，用h337可湿性菌剂沾根，5克/株，然后移栽于直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的花钵中，在烟根接种根结线虫二龄幼虫5ml。阳性对照用10％噻唑膦颗粒剂1g与4g硅藻土的混合物取代h337可湿性粉剂；空白对照用5g硅藻土取代h337可湿性粉剂。每处理三个重复，每重复5盆；肥水管理按常规方法进行。
成株期使用方法：烤烟按常规漂浮育苗，待烟苗长至5-6片叶子时，将烟苗移栽于直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的花钵中，1株/盆。移栽30天后，取5g h337可湿性粉剂稀释于200ml自来水中并浇灌烟根，同时在烟根接种根结线虫二龄幼虫5ml。阳性对照用10％噻唑膦颗粒剂1g与4g硅藻土的混合物取代h337可湿性粉剂；空白对照用5g硅藻土取代h337可湿性粉剂。每处理三个重复，每重复5盆；肥水管理按常规方法进行。
防效计算：以上各处理的烟苗在温室内随机排列摆放，生长90天后统计各处理的烟草根结线虫病的发病率，按GB/T23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》介绍的方法进行病级分类、计算病情指数和防效。
试验结果：从表2能够看出，h337可湿性粉剂在育苗期、移栽期和成株期使用对烟草根结线虫病的防效分别为70.41％、85.32％和73.25％，防效均略高于化学农药10％噻唑膦颗粒剂的相应处理；移栽期用5g h337可湿性粉剂沾根的防效最好。
表2 h337可湿性粉剂及对照化学农药不同使用方法时对烟草根结线虫病的防效
Figure BDA0001739440690000061
实际应用表明：利用h337菌株制备的菌剂，不仅能高效防治烟草黑胫病和烟草根结线虫病，还具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。

Claims (1)

1.一株保藏号为CCTCC NO: M 2018370的植烟土壤鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium tabacisoli）h337 菌株在制备用于防治烟草黑胫病及烟草根结线虫病的菌剂中的应用。
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